쥐 고환의 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 분리 및 세뇨관 세포

요약

차 세르 톨리 (Sertoli) 세포는 면역 보호 특성의 염증이나 감염, 및 이용 기간 동안 고환 면역 특권, 신호 전달 연구가 필요합니다. 여기에서 우리는 고도로 정제 차 세르 톨리 (Sertoli) 세포와 쥐의 고환에서 세뇨관 세포의 분리를 위해 효소 기반의 프로토콜을 설명합니다.

초록

분화는 정자 제 사춘기시 나타나는 때문에 정소, 특히 남성 생식에서 독특한 방식으로 면역계 도전 - 10 년 이상의 전신성 면역 관용의 확립 후. 정자 세포는 면역 체계에 의해 비 자동으로 알 수있는 단백질의 수를 표현한다. 정소는 한 손이 네오 항원 내성을 확립 여전히 한편 감염 및 종양 발생으로부터 자신을 보호 할 수 있어야한다. 따라서 고환은 유해한 염증 면역 반응을 불러 일으키는없이 외국 항원을 허용 몸에 약간의 면역 특권 사이트 중 하나입니다. 세르 톨리 세포 고환이 면역 특권 환경 유지에 중요한 역할을하며 외부 환경 cotransplanted 세포의 생존을 연장. 따라서 차 세르 톨리 (Sertoli) 세포는 전자가 될 수 없습니다 고환의 면역 특권을 연구하기위한 중요한 도구입니다asily 설립 세포주 또는 다른 세포 모델로 대체. 원하는 경우 세뇨관 세포 - - 쥐의 고환에서 하루 내에 여기에서 우리는 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 분리에 대한 상세하고 포괄적 인 프로토콜을 제시한다.

서문

고환은 안드로겐을 즉 남성 생식 및 성 호르몬을 생산하고 있습니다. 기관은 두 개의 구획으로 구성되어있다. 간질 성 구획에서, 즉 스테로이드는 간질 세포 내에서 발생, 총 고환 볼륨 ^1의 10-12 %를 차지. 관형 구획 고환 부피의 약 ¹ 60-80%를 나타내고, 생식 세포 및 체세포 두 종류 포함 - 세뇨관 세포와 버팀 세포. 정소는 각각 1-3 고도로 복잡한 정소 세관을 포함 250-300 소엽으로 결합 조직 중격에 의해 분할된다. 이 세관은 기초 막, 콜라겐 시트 및 세뇨관 세포의 원주 층 (그림 1A)에 의해 둘러싸인.

새싹 상피 세포가 기저막의 내강 측에 있습니다. 세르 톨리 세포 루멘 기저막에서 전체 종자 상피 걸쳐 큰 신장 세포이다. 그들은 강하게 아르 AT & T는기초 막에 아​​팠다과 간질에서 생식 상피를 폐색 및 혈액 - 고환 장벽을 나타내는 기저 조직 꽉 접합을 통해 지속적인 세포 시트를 형성한다. 세르 톨리 세포는 눈에 띄는 세포질 계획과 생식 세포의 종 특이하지만 상수와 꽉 형태 학적 및 기능적 접촉 얻을 할 수 있도록 파급 효과가있다. 배체 생식 줄기 세포는 증식과 정조 세포로 분화.

감수 분열 동안 나는 감수 분열 II 동안 추가로 네 개의 반수체 정자에 개발 생성 배체 정모 세포를 짧은 살았다. 그들이 셀룰러 망을 형성하도록 모든 생식 세포 세포질 브릿지로 연결된다. 정자 성숙 동안 주요 이벤트 spermiogenesis 불리는 과정에서 잔류 체를 형성 세포질의 대부분의 압출이다. 잔류 몸은 세르 톨리 (Sertoli) 세포에 의해 포식한다. 늦은 정자는 다음에 출시관 루멘은 더욱 성숙 부고환으로 이송. 세르 톨리 세포와 생식 세포 상호 지형적 기능적으로 정자를 조정하기 위해 나타납니다.

작은 고환 조각이 재배 및 세포 유형은 현미경 ^(2)에 의해 확인 된 경우 개별 고환 세포 유형의 준비는 거의 한 세기 전에 시작했다. 뾰족한 집게를 사용의 Tunica albuginea을 연 후 세관의주의 해부으로는 관과 간질 구획 ^(3)를 분리 이후 수 있었다. 1975 년 웨일스어 및 위브는 간질 조직과 외부 세뇨관 세포 층 ^(4)의 제거를위한 크레아틴 처리를 부착 세관을 확보하기 위해 콜라게나 제 처리를 도입했다. 초기 젊은 미성숙 래트에 대한 (오래된 약 20 일)이되는 사용되었던에서 정자가 아직 시작되지 않았으므로 세르 톨리 세포 튜브형 세포 집단의 많은 부분을 포함한다. 이 연령 쥐 르트에서OLI 세포는 분열을 중단하고, 혈액 - 고환 장벽 ^(5)를 설립되도록 인접 셀 간의 긴밀한 접합을 형성한다.

웨일스어 및 위브 Dorrington 외.의 독립은 트립신의 조합을 소개하고, 같은 해 ⁶ 년에 출판되었다 ​​soybeen 트립신 억제제와 콜라게나 제 처리하여 디옥시리보 뉴 클레아. 두 그룹은 약 70 %의 Sertoli 세포를 포함 도금 균질 세포 현탁액을 제조하기 위해 (주사기 바늘 또는 각각 파스퇴르 피펫을 통하여 반복해서 분해 관형 단편 드로잉) 기계적 힘을 사용했다. 혈청이없는 배지를 사용하여 배양 3 일 후, 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 비율은 약 90 %로 증가한다. 이것은 주로 생식 세포 오염의 죽음에 기인 할 수있다. 잔류 세뇨관 세포 (PTCS)은, 그러나, 그들의 세포 외 기질 단단히 통해 부착있어. PTCS 아니지만 세르 톨리 (Sertoli) 세포를 생성하는 것으로 알려진PTCS 오염을 추정하기위한 마커 단백질로서 작용할 수 피브로넥틴. 따라서, 오동 나무 등. 추가 히알루 처리 세르 톨리 세포 분획 ^(7)의 순도를 개선시킬 수 있음을 추론. 실제로 이들은 추가적인 처리에 비해 혈청 함유 배지 정제 세르 톨리 (Sertoli) 세포 배양에 사용되는 경우에 특히 분명하게되는 약 20 배 PTCS에 의한 오염을 줄일 수있는 것을 표시 할 수있다. 그때부터 오동 나무 등의 등의 개선 된 절차에. 일반적인 프로토콜되었고 광범위 필드 ⁸ (그림 1B)의 다른 주요 그룹에 의해 사용되었다.

콜라게나 제 처리 중에 PTCS의 대부분이 해제되고 버팀 세포에 병렬로 분리 될 수있다. PTCS가 적극적으로 증식과 난포 자극 호르몬 (FSH)이 응답하지 않는 반면, 세르 톨리 (Sertoli) 세포는 더 이상 분열을 겪게 및 특성 형태 학적 변화에 의해 FSH에 반응하지 않는및 환상 아데노신 모노 포스페이트 (cAMP) 농도 ⁹ 증가한다. 매우 유사한 효소 소화 프로토콜 남자 ^{10, 11, 12,} 마우스, 햄스터 시베리아 ¹³ 야크 ^(14)와 같은 다른 동물 차 세르 톨리 세포의 분리를 위해 사용될 수있다. 생식 세포를 저장성 충격 오염 다량 제거하기위한 분리 절차 ^(15)의 단부에 사용될 수있다. 성인 쥐 ¹⁶ 고환에서 이것은 또한 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 효율적인 분리를 허용한다. 농축 버팀 세포 현탁액은 계시 가시 독말풀과 응집소 ¹⁷ 렉틴 코팅 접시에 현탁액을 도금함으로써 세균 세포로부터 분리 될 수있다. 만 세르 톨리 (Sertoli) 세포와 약간의 잔류 PTCS는 렉틴 판에 부착.

기본 버팀 세포 배양 주로 쥐에서 마우스 세르 톨리 (Sertoli) 세포 리튬 등 세포주 호르몬 반응성을 조사하거나 설정하기위한 초기 사용되고네브라스카 TM4 ^18. 이 세포주는 지금까지 이상 백 연구에서 조사되었다. 병진 접근법에서 세르 톨리 세포 면역 조직 ^(19)없이 공 배양 세포 및 장기 이식 생존 동종 또는 이종의 췌장의 공동 이식에서와 같은 조직의 면역 보호에 이용되고있다. 체세포 - 생식 세포 (세르 톨리 (Sertoli) 세포 - 생식 세포) ^{(20)의 상호} 작용 ²¹ - 격리 버팀 세포는 상피 간엽 (PTCc 세르 톨리 (Sertoli) 세포) 공부 공동 배양 실험에 사용되었다. 최근 주 버팀 세포 비병원성과 uropathogenic E. 감염 다음 식 사이토 카인 선도 수신자 같은 수용체의 발현 및 염증성 사이토 카인의 분비뿐만 아니라 신호 전달 캐스케이드 조사에 이용되고 대장균 ^22. 다른 최근 조사는 고환 면역 쪽을 공부 세르 톨리 (Sertoli) 세포를 사용 하였다rivilege ^(23)과 테스토스테론 전처리가 LPS에 의한 염증 반응 ^(24)을 억제 것을 보여 주었다.

프로토콜

1. 동물 윤리 정책

여기에 설명 된 실험은 지방 자치 단체로, Regierungspräsidium 기센, 독일의 지침에 따라 수행 및 실험 목적에 대한 관리 및 동물의 사용을위한 연습의 독일 코드 (권한 없음을 확인했다 :. GI 23분의 20 수 (Nr) (31) / 2012).

미디어, 효소 솔루션 및 동물 2. 준비

1. 100 ml의 에탄올에 요오드 1g을 용해시켜 1 % 요오드 알코올을 준비한다.
2. 배 500 ml의 Dulbecco's 인산 완충 식염수 7.5 ML의 D-포도당 (100g / L) 및 5 ml의 100 배 페니실린 / 스트렙토 마이신 원액 (15 ㎎ / ㎖ D 각 보충 칼슘없이 (PBS) ²⁺ 및 마그네슘 ²⁺ 준비 글루코스 공수, 50 U / ㎖ 페니실린 및 50 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 최종).
3. 500 ml의 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 5 ml의 100 배 페니실린 / 스트렙토 마이신 주식 솔루션 (50 U / ㎖ 페니실린 및 50 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 지느러미와 1640 배지 1 배 (부록)AL).
4. 트립신 - DNase의 I 솔루션을 준비 (2.5 밀리그램 / 트립신 및 10 μg의 / ㎖의 DNase I ㎖) 25 mg의 트립신 0.1 ml의 DNase를 추가하여 I 9.9 ml의 PBS (1 ㎎ / ㎖의 DNase I).
5. 용액 (10 ㎎ / ㎖) 억제제 트립신 5 ml의 PBS에서 50 mg의 트립신 억제제를 녹인다. 트립신 저해제 B 용액 10 ml의 PBS (2.5 ㎎ / ㎖)에 25 mg의 트립신 억제제를 녹인다.
6. 콜라게나 히알루로 - 데 옥시 리보 뉴 클레아 제 I (DNase를 I) 용액 (1 ㎎ / ㎖ 최종) 10mg을 콜라게나 제, 10 mg의 히알루 (1 밀리그램 / 최종 ml) 및 0.1 ml의 DNase를 용해 I (1 ㎎ / ㎖의 DNase I) ( 10 μg의 10 ml의 PBS에서) 마지막 / ㎖.
7. 9.9 ml의 PBS에 10 mg의 히알루로니다 제 (1 밀리그램 / 최종 ㎖) 및 0.1 ml의 DNase의의 I 용액 (1 ㎎ / ㎖) (10 μg의 최종 / ㎖)을 추가하여 히알루-의 DNase I 솔루션을 준비합니다.
8. 그들이 세르 톨리 (Sertoli) 세포 분리의 날 19 일 이전되도록 시간을 위 스타 쥐를 주문하십시오.
   참고 : 10 기재 프로토콜 래트 위해 설계되지만 5 최소 20 래트의 최대 변형 될 수있다.모든 용액의 부피는 이에 따라 조정되어야한다.
9. 100 ml의 이소프로판올에 0.35 g 오일 레드 O 용해시켜 오일 레드 O 원액을 준비한다. 볶음 O는 / N은 ​​최대 일년 동안 실온에서 0.2 μm의 저장소를 통해 필터링합니다.
10. 4 ㎖의 물을 6 ml의 오일 레드 O 원액을 혼합하여 오일 레드 O 염색 용액을 제조 하였다 (3 : 2). 0.2 μm의를 통해 10 ~ 20 분 필터 후. 다음 2 시간 이내에 사용하십시오.
11. 4 % 준비 부드럽게 교반하면서 1X PBS 80 ml의 4g 파라 포름 알데히드 분말 (PFA)를 추가하여 환기 후드에 포름 알데히드 용액 (/ V w). 열 ~ 60 ° C는 1 M의 NaOH를 가하여 1 및 파라 포름 알데히드가 용해 될 때까지 교반을 계속한다. 용액을 실온으로 냉각 한 M HCl로 pH를 7.4로 1X PBS와 함께 100 ㎖로 볼륨을 조절 보자. 용액 (0.45 μm의) 필터 및 몇 달 동안 -20 ° C에서 분취 신선한 또는 저장소를 사용합니다.
    참고 : 중합 된 포름 알데히드 (PFA)는 물에 단량체 포름 알데히드에 해중합. 이 프로세스는적당한 난방과 약 알칼리성의 pH에​​ 의해 촉매. 갓 모든 효소액을 제조하고 사용하는 필터의 날 (0.2 μM)을 살균. 효소에 대해 서로 다른 제조 업체 (자료 참조 / 장비 표)의 경우주의 깊게 농도 / 활동을 조정, 사용됩니다.
    다음 프로토콜에서 "피펫"는 혈청 학적 피펫을 의미합니다.

정액을 운반하는 세관 3. 준비

1. CO _2하여 데시 분당 챔버 체적의 적어도 20 % 변위 유량 10 수컷 위 스타 래트를 하나씩 마취. 발 패드를 압박하여 호흡이 정지 될 때까지, 테스트 마취를 기다린가있는 경우에는 반응은 자궁 전위에 의해 각각의 쥐를 안락사 없습니다. 흐르는 물에서 경정맥과 경동맥 (질 carotica)을 절편하여 혈액을 배출합니다. 70 % 에탄올로 닦아 복부를 소독.
2. 사용 포셉은 복부 뮤스으로부터 피부를 들어 올려사이클 사용은 흉골 (그림 2A)에 치골로부터 연장되는 타원형 모양의 피부 로브를 잘라 그것을 가슴에 위로 플랩. 다음으로, 복부 근육을 잡아 흉골에 치골에서 내측 절개를합니다.
   1. 위쪽 아래쪽 골반에서 고환을 밀어하기 위해 골반에서 엄지 손가락으로 복부를 꽉. 또한 고환을 인상하기위한 집게로 부고환 지방 패드 (그림 2B)를 선택합니다. 의 Tunica albuginea은 그대로두고, 정액 코드 (그림 2B)를 절단하고, 50 ML 원뿔 튜브 (그림 2C)에 20 ml의 PBS의 모든 고환를 수집합니다.
3. 모든 정소를 수집 한 후, 에탄올 중 요오드 (/ V W) 1 %의 동일 부피 (20 ml)에 추가하여 소독. 두 번 튜브를 반전 즉시 뜨는을 가만히 따르다. 빨리 25 ml의 PBS 각 (그림 2D)로 두 번 고환을 씻는다.
4. 포함 페트리 접시에 고환 이동15 ml에 보내고 PBS (그림 2E). 한 끝에 집게로 단단히 각각의 고환을 잡고 반대쪽 끝에서의 Tunica albuginea에 작은 절개를하고, 스크래핑 도구로 폐쇄 가위 블레이드를 사용하여 세관을 짠다.
   참고 : 세관은 여전히 몇 세관이 균일 효소 소화 (그림 2 층)를 활성화하기 위해 솔루션으로 연장 컴팩트 고환 모양의 다발을 형성한다.
5. 10 ㎖의 트립신-의 DNase I 솔루션을 포함하는 100 ㎖ 스크류 캡 병에 드 캡슐화 고환을 전송합니다. 32 ° C (120 진동 / 분)에 떨고 물 목욕 소화를 수행합니다. 4 분 후에는 세관의 분산 육안으로 세관을 평가합니다. 세관은 용액에 분산 시작하면, 즉시 소화를 중지합니다. 필요한 경우, 최대 2 분 동안 배양을 계속합니다.
6. 다운 3-4 시간까지 철저히 피펫으로 용액을 혼합 트립신 억제제 A. 용액 5 ㎖를 첨가하여 트립신 소화 중지10 ㎖ 피펫을 사용하여 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 옮긴다이야.
7. 배양 5 분 후 세관 신중 단계 3.6에서 10 ㎖ 피펫을 이용하여 상층 액을 제거하고 충분히 트립신 분해를 중지하기 위해 트립신 억제제 B 용액 10 ㎖를 추가 유닛 중력에 의해 침전 관찰한다. 아래로 2-3 시간을 피펫 팅에 의해 세관을 재현 탁.
8. 오염 제거하기 위해 간질 세포를 25 ml의 PBS 각각 세관 9 번 씻는다. 25 ML의 피펫을 사용하여 각 세척에 세관을 재현 탁하고 10 분 단위 중력에 의해 정착 할 수 있습니다. 항상 PBS, 부유하고, 상등액의 제거를 피펫 팅에 대해 동일한 25 ML의 피펫을 사용합니다.

세뇨관 세포의 4. 제거 / 분리 (PTCS)

1. 100 ㎖ 스크류 캡 병에 모든 세관을 전송하고 콜라게나 제 히알루-의 DNase I 솔루션 (그림 3A)를 추가합니다. (120 진동 / 분) 32 ° C에서 진탕 수조에서 10 분 동안 소화를 수행.
2. 피펫 유리 슬라이드에 정지 한 방울 빠르게는 100 배 배율에서 일상적인 세포 배양을위한 반전 된 광학 현미경 하에서 세관​​을 확인합니다. 소화 고급이 아닌 경우 충분히 (현미경 검사에 필요한 시간을 계산에 포함되지 않습니다) 추가 2 분 동안 배양을 계속합니다.
   참고 :이 단계에서는 모든 세관 (그림 3b 및 C) 거친이되어야 길이와 세관 가장자리에 단축 얻을. 거친 가장자리는 세뇨관 세포의 릴리스를 표시합니다.
3. 단계 3.8에서 25 ml를 피펫을 사용하여 50 ML 원뿔 튜브에 소화 세관과 정지를 전송합니다. 10 ml의 PBS와 100ml의 병을 세척하고 원뿔 튜브에 세관에 추가합니다. 다시 25 ml를 피펫을 사용하여, PTCS를 포함, 소화 세관은 상층 액을 10 분 단위 중력에 의해 정착 조심스럽게 대기음 할 수 있도록 허용하고 새 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. 지난 몇 밀리리터의 포부를 들어 순으로 하였다 5 ml를 피펫을 사용r은 세관의 이월을 방지합니다.
4. 수집 된 세관 상청액을 20㎖ RPMI를 10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 1640 추가 브레이크를 사용하지 않고, RT에서 10 분 동안 300 XG에 혼합하고 원심 분리기.
5. 조심스럽게 뜨는을 가만히 따르다 16 ml의 매체 각을 포함하는 다섯 T75 플라스크에 RPMI 20 ml의 10 % 열 - 불 활성화 FBS로 보충 1640 배지 및 씨앗 4 ml의 각 펠렛 PTCS를 재현 탁. CO ₂ 분위기 (그림 4A) 5 %에서 37 ° C에서 품어.
6. 문화의 3 ^{번째 날에} PTCS를를 Trypsinize 그들에게 1 분할 : 10 % 열 - 불 활성화 FBS로 보충 된 16 ml의 RPMI 1640 배지를 포함 T75 플라스크에 2 각 (수율 10 플라스크 모두) (그림 4B). CO ₂ 분위기 5 %에서 37 ° C에서 배양을 계속합니다.
7. 문화의 5 ^번째 날에 다시 PTCS를를 Trypsinize 및 실험에 따라 6 자 또는 24 웰 플레이트에 그들을 판(접시 당 하나의 T75 플라스크). 실험 6 일째에 수행 될 수있다.

세르 톨리 (Sertoli) 세포의 5 단열 (희주)

1. 25 ML의 피펫을 사용하여 철저하게 PBS의 25 ml의 단계 4.3에서 정착 세관을 재현 탁하고 12 분 단위 중력에 의해 정착 할 수 있습니다. 피펫 PBS, 세관 및 상층 액을 제거의 재 부유에 대해 동일한 25 ML의 피펫을 사용합니다. 세탁 3 번 (총 4 세척)를 반복합니다.
2. 마지막 세척 다른 100 ㎖로 소화 세관을 전송 한 후 히알루-의 DNase I 솔루션을 포함하는 병 캡 나사. 32 ° C (120 진동 / 분)에 떨고 물 목욕 소화를 수행합니다.
3. 단계 4.2에 설명 된대로 5 분 후에 100 배 배율의 광학 현미경 검사를 통해서 다시 세관을 확인합니다.
   참고 : 짧은 세관, 관 집계 및 발표 세포 (그림 3D) 볼 수 있어야합니다.
   1. 관 집계가 10 분 동안 정착 허용, 우리를 뜨는을 대기음25 ml를 피펫을 보내고. 워시 25 ㎖ PBS, 각 세척 단계 (도 3e)에 대한 10 분의 침강 시간을 이용하여 4 회 집계.
4. RPMI 1640 배지 20 ㎖를 추가하고 20 ML의 주사기에 장착 된 18 G 바늘을 통해 정지 10 번을 전달합니다. 공기 방울을 피하십시오.
   참고 :에 바늘이 하나의 패스로 간주됩니다 통해 정지를 당기는. 유체 역학적 전단력에 의한 세포의 파괴 및 균질화가 응집하는 경향이 세포의 제조에 표준 기술이다. 작은 내경의 피하 주사 바늘을 ​​통해 세포의 통과는 ^25.도 5C 및 D는 배양 4 일째 정제 세르 톨리 세포의 일반적인 미세 구조를 도시 기능적 특성에 영향을 미칠 가능성이있다.
   1. 피펫 AGG이 경우 10X 배율 루틴 세포 배양을위한 광 역 현미경 세관을 확인 신속 유리 슬라이드 및 현탁액 드롭regates 모든 (그림 3 층) 분산된다. 여액 순수한 단일 세포 현탁액을 수득하기 위해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 필터.
5. 브레이크를 사용하지 않고 실온에서 10 분 동안 200 XG에 단계 5.4의 여과 액을 원심 분리기. 조심스럽게 (40)의 세르 톨리 (Sertoli) 세포를 25 ml를 피펫을 사용하여 뜨는을 대기음, 그리고 재현 탁 ml의 RPMI 1640 배지 (혈청).
6. 트리 판 블루 얼룩 100 ㎕ 100 ㎕의 세포 현탁액을 혼합하고 노이 바 우어 개선 챔버와 세포를 계산합니다. 계산 결과에 따라, 3 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 세포 농도를 조정한다. 시드 6 웰 플레이트 (= 1 일)에 웰 당 1 ml의. 오일 레드 O 염색 (6 단계)이 계획되어있는 경우 하나에 커버 슬립을 넣어 또는 세르 톨리 (Sertoli) 세포를 파종하기 전에 몇 우물.
   참고 : 튜브 간단히 셀 나누어지는이 피펫을 촬영하기 전에 때마다 흔들리는해야합니다 있도록 서스펜션의 세르 톨리 (Sertoli) 세포가 빠르게 정착. 4 일 그들은 단단히 AT & T까지기질에 ACH.
7. 4 일째에 떠 또는 접착 생식 세포를 제거하기 위해 (도 4C)은 절연 버팀 세포 PBS (도 4D)로한다 (단계 5.6)을 도금에 사용 된 6 웰 플레이트의 각 웰을 세척한다. , 매체를 기음 각 웰에 PBS의 1-2 ml에 추가하고 적극적으로 테이블에 있지만 PBS를 유출하지 않고 수평으로 6 웰 플레이트를 흔들. 세척을 3 회 반복 한 후, 5 일, 6 (도 4E)에 동일한 세정 절차를 수행한다.
   4 일 세르 톨리 (Sertoli) 세포가 완전히 첨부에와 반전 광학 현미경 (그림 4C)에서 패턴처럼 조약돌을 보여 주. 실험은 7 일 이후에서 수행 될 수있다.
   1. 부착 생식 세포 6 웰 플레이트에 파종 후 3 일 저장성 충격을 수행 부동 및 제거 용 (단계 5.7의 대체). 매체를 제거하고 냉장고에서 직접 찍은 20 mM 트리스 pH가 7.5 1 ㎖를 추가합니다. 90 초 120에 있지만 이후 트리스 버퍼를 대기음후에. PBS로 두 번 세포를 세척하고 RPMI 1640 배지 (혈청) 2 ㎖를 추가합니다. 선택적으로, 다음날 실험을 수행합니다.
      주 : 저 삼투압 충격 긴 기간보다 생식 세포를 제거 할 수 있지만 더 세르 톨리 (Sertoli) 세포뿐만 아니라 분실. 제 PBS 세척 임의의 Sertoli 세포를 대체하지 않도록 빠르게 있지만,주의하여주십시오. 직접 다른 크기의 저장성 치료 수많은 공포는 위상차 현미경에 의해 세포질에서 관찰 할 수 있습니다 후. 액포는 저장성 치료 후 몇 시간 내에 사라집니다.

6. 오일 레드 O 염색법

1. 실온에서 모든 단계를 수행합니다. 7 일 워시 세르 톨리 (Sertoli) 세포는 PBS로 두 번 커버 슬립 (단계 5.6)에서 성장하고 PBS 중 10 % 포르말린을 고정한다. 10 분 후 신선한 솔루션으로 포르말린을 대체하고, 또 다른 60 분 동안 고정을 계속합니다.
   주 : 모든 용액은 커버 슬립 웰 (들)에 첨가하고, 다음 단계 이전에 흡입된다.
2. 대기음 포르말린, 물 세포를 두 번 세척하고 60 % 이소프로판올을 추가합니다. 5 분 후 몇 분 동안 공기 건조에 세포를 할 수 있습니다.
3. 물론 당 1 ml의 오일 레드 O 염색 솔루션을 추가하고 10 분 동안 품어. 용액을 흡인시키고, 물로 즉시 세포를 네 번 세척하고 마운트 커버 글리세롤 PBS에서 슬립 (9 : 1). 일상적인 광학 현미경 (그림 4 층) 밝은 필드 이미지를 가져 가라.

7. 면역 형광 염색법

1. 두 번 PBS와 커버 슬립 성장 (단계 5.5)에서 세르 톨리 (Sertoli) 세포 (4.5 단계에서) PTCS를 세척하고 실온에서 10 분 동안 4 % PFA로 고정합니다.
2. RT에서 1 시간 동안 PBS 중 5 % BSA와 인큐베이션. BSA-PBS 용액을 취소하고 신선한 BSA-PBS의 (PTCS에 대한) 액틴 (평활근)을 함유 용액 또는 멘틴 (세르 톨리 (Sertoli) 세포) 차 항체 (희석 1 : 100 두 항체)를 추가하고 4 ° CO / N에 품어.
   주 : 차 항체의 비특이적 결합을 차단 BSA와 인큐베이션.
3. 워시 커버 PBS-0.1 % 트윈 20에서 5 분 동안 3 번 미끄러 녹색 형광 염료를 결합 염소 항 마우스 이차 항체 (희석 1 : 1,000)와 함께 품어 어둠 속에서 1 시간 동안 실온에서.
4. 워시 커버 PBS-0.1 % 트윈 20에서 5 분 동안 3 번 미끄러 져 DAPI 장착 매체를 탑재합니다.

8. 미세 구조 분석

1. PBS로 6cm 세포 배양 접시에 성장한다 (단계 5.6)에서 워시 세르 톨리 (Sertoli) 세포 (67 밀리미터 cacodylate 완충액 중 2.5 % 글루 타르 알데히드, 2.5 % 파라 포름 알데히드 0.05 % 피크르산의 혼합물을 4 ℃에서 2 시간 동안 이들을 해결 이토와 Karnovsky ^(26)에 따라 pH를 7.4).
2. 50mM의 말레 에이트 완충액 (pH 5)에 용해 된 0.3 % 우라 닐 아세테이트에서 O / N 항온 처리 한 다음, 1 % 산화 오스뮴으로 사후 고정을 수행한다. 표준 절차에 따라 미디어를 포함에 포함 된 샘플. 얇은 부분을 잘라 리드 시트 레이트로 대조 및 전자 현미경으로 검사합니다.

결과

설명 절차는 10 쥐의 고환에서 약 12 × 10 ⁷ 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 분리를 할 수 있습니다. 6-7 6 웰 플레이트 하루 7. 실험에 사용할 수 있는지 트립신-DNase의 I 소화가 세르 톨리 (Sertoli) 세포 분리시 가장 중요한 단계는 그래서 3 × 10 ⁶ 세포를 6 웰 플레이트에 잘 당 도금. 이 시점에서 분해가 지나치게 진행되면, 생식 세포의 비율 / 세르 톨리 (Sertoli) 세포 불?...

토론

The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, wh...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4	Dako	M0851	Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized	Serva	11930.04	Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence.
Corning Cell Strainers 70 µm	Corning	431751	White color
Collagenase A from Clostridium histolyticum	Roche	10103586001
DAPI mountant ProLong Gold Antifade	Life technologies	P-36931
D-glucose	Sigma	G8644	100 g/L
Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+	Gibco	14190-094
DNase I	Roche	10104159001
Electron microscope	Zeiss	EM 109S
Fluorescence microscope	Zeiss	Axioplan 2
Hyaluronidase from bovine testis	Sigma	H3506
Inverted light microscope	Olympus	CKX41	Routine cell culture microscope
Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody	Life technologies	A-10684	Alexa Fluor 488 conjugate
Oil Red O	Sigma	O0625	Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml)	Gibco	15070-063	100x solution
RPMI-1640	Gibco	21875-034	Contains 300 mg/L L-glutamine
Trypsin from porcine pancreas	Sigma	T5266
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T6522	The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche.
Vimentin antibody (V9)	Sigma	V6630	Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.  Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Wistar WU rats	Charles River		Should be 19 days old on day of experiment.