JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Abstract

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

Introduction

כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC) בשילוב עם פוסט טור derivatization (PCD) היא כלי רב עצמה כי הוא שימושי בפתרון מספר בעיות במעבדה האנליטית. זה יכול לשמש כדי לזהות תרכובות שאינן אחר לגילוי עם החבילה של גלאי זמין 1,2, להגדיל את האות של אנליטי היעד, המאפשר גבולות נמוכים של גילוי quantitation 3-5 או סלקטיבי derivatize אנליטי יעד על מנת למנוע תופעות מטריקס 6. בשימוש נפוץ התגובות PCD כוללים התגובה של אמינים, כגון חומצות אמינו, עם-phthaladehyde אורתו 7-9, ninhydrin 9,10 או fluorescamine 11,12, את derivatization של מינים חמצן תגובתי (ROS) עם 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazil הרדיקלי (DPPH •) 13,14 או 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic חומצה (ABTS) 15,16, ושימוש מגיב-אזיד יודיד כדי derivatize ג גופריתתרכובות ontaining 17,18.

יש, עם זאת, חסרונות רבים לשימוש תגובות PCD עם מערכות HPLC 6. בעיקר בקרב אלה הוא השימוש סליל תגובה בין נקודת תוספת של מגיב derivatization (ים) ו הגלאי, המאפשר זמן לערבוב והתגובה להתרחש 8. יש תגובה אלה לולאות לעתים קרובות כרכים של 500 μl או יותר, אשר גבוה משמעותית לעומת היקף שאר המערכת HPLC 19. שימוש תגובה בנפח גבוה אלה לולאות תוצאות רחבות שיא גדל לעומת מה יהיה ציין ללא הנוכחות של לולאת התגובה. התוצאה היא קצרות, פסגות רחבות יותר כי יש גבולות גבוהים של quantitation וזיהוי ואפקטים שלילי רזולוצית chromatographic. איורי 1 ו -2 להדגיש את ההידרדרות של צורת שיא הנגרמות כתוצאה מהתוספת של כרכי לולאת תגובה שונים פוסט עמודה. ניתוח זהבוצע באמצעות רכב שלב נייד של מתנול 94% ו -6% מי מילי- Q. קצב הזרימה של השלב הנייד היה 1 מ"ל / דקה, את עוצמת הזריקה היה 20 μl ואת אורך הגל הניתוח היה 265 ננומטר. סלילי של כמויות משתנות מת מ -20 μl 1,000 μl הוכנסו בין הטור לבין הגלאי כדי לדמות את ההשפעה של נפח מת לולאת תגובה בשיטות PCD. לולאות אלה הוכנו מ צינורות נירוסטה של ​​קוטר פנימי 0.5 מ"מ. הניסוי בוצע על מערכת HPLC המורכבת של בקר (SCL-10AVP), בלחץ נמוך Gradient Valve (FCL-10ALVP), משאבה (LC-20AD), מזרק (SIL-10ADVP), וגלאי PDA ( SPD-M10ADVP). השלב הנייד נשאב באמצעות מסלק גזים לפני המבוא למערכת HPLC. ההפרדה בוצעה באמצעות טור 250 מ"מ x 4.6 מ"מ id 5 מיקרומטר. תנאי הניסוי נבחרו להיות אופייני של תגובות PCD אשר פורסמו לאחרונה בספרות.

הפשוט, התקנת כור טור פוסט הנפוץ ביותר נקראת כור צינורי הלא מפולח אשר הוא למעשה צינור ארוך, דק שדרכו הנוזל יכול לזרום ואת התגובה יכולה להתרחש. בשנת שיא במערכת זו רחבה תלויה לא רק את הנפח מת להוסיף למערכת, אלא גם את הקוטר הפנימי של הצינור כפי מודגש על ידי Iijima et al. 8. יתר על כן, גיאומטרית סליל ממלא תפקיד הרחבת המותג ציינה. סטיוארט 20 נאמר כי התפתלות של הכור משנה את פרופילי זרימה משני, וכתוצאה מכך ערבוב טוב יותר, כלומר הנפח המת יכול להיות ממוזער. זה כבר נאמר כי הרחבת השיא הוא לא משמעותי בעת שימוש צינורי פתוח סרוגים סליל 21. כאשר הרחבת השיא היא גדולה מדי, סוגים אחרים של כורים יכולים גם להיחשב 20,22. אלה עשויים לכלול כורי מיטה או כורי תזרים מפולחים. כורים אלה הם שימושיים במיוחד עבור תגובות איטיות שאחרת requirלולאות התגובה הגדולה הדואר. כמו כורי צינורי הלא מפולחים הם הסוגים הנפוצים ביותר של כורים המשמשים ליישומי PCD, שאר מאמר זה עוסק בסוג זה של התקנת כור.

העיצוב של זרימת תגובה (RF) טור משלבת הולמת סוף מרובה יציאות מאפשרת בשלב נייד כדי לצאת (או להיכנס) בעמודה או דרך יציאה אחת הממוקמת באזור המרכז הרדיאלי של העמודה או שלוש יציאות הממוקמים בחלק החיצוני קיר באזור של הטור (ראה איור 3). זרמים אלה שני מופרדים באמצעות הולם סוף המכיל frit נקבובי מרכזי מוקפת טבעת חדירה כי הוא בתורו המוקף frit הנקבובי חיצוני המשתרע החוצה אל קיר העמודה. בשל זרימת צלב טבעת המרכזית החדירה אינו אפשרי בין שני האזורים הנקבוביים.

במהלך כרומטוגרפיה זרימת תגובה, מגיב derivatization (ים) נשאבים נגד כיוון זרימה בשלב נייד לאחת או TWo הנמלים החיצוניים של טור זרימת תגובה. Eluent הטור הוא מעורבב עם מגיב derivatization (הים) frit החיצוני והעביר אל הגלאי דרך יציאה חיצונית בחינם. זרימת תגובה יכולה לשמש אחת מעמד derivatization מגיב יחיד (1 נמלית מגיב derivatization, 1 יציאה להעביר את eluent העמודה אל הגלאי ו -1 היציאה החסומה) או מערכת מגיב כפולה (2 יציאות עבור ריאגנטים derivatization ו -1 יציאה להעביר את eluent עמודה אל הגלאי). תזרים מן הזרם המרכזי או שניתן להשתמש בהם כדי לזהות את eluent טור underivatized, ריבוב ביעילות זיהוי 23, או עבר לבזבז.

טכניקת כוונון אחד עיקרית זמינה בעת הפעלת כרומטוגרפיה RF-PCD הוא היחס של התזרים המרכזי ואת הפריפריה. היחס האופטימלי עבור כל derivatization תלוי במספר גורמים כגון האם הזרם המרכזי יזוהו או עבר לבזבז. לכן פעם היחס האופטימלי נקבע, יש להבטיח את זה כי יחס התזרים הנכון מושגת לפני כל סיבוב מתבצע.

זה כבר נמצא כי השימוש של frit לערבב את זרם eluent עמודה מגיב derivatization בתוצאות RF-PCD ב ערבוב יעיל יותר לעומת טכניקות ערבוב המסורתי שבדרך כלל להעסיק נפח מת אפס מת נפח T-piece או נמוך פ- חתיכה לערבב שני הזרמים. זו אפשרה את השימוש של לולאות תגובה קטנות יחסית, או אפילו החיסול של לולאת התגובה כלילה. צמצום תוצאות גודל לולאת תגובת פסגות חדות בהשוואה לשיטות derivatization טור פוסט מסורתיות. משמעות דבר היא כי, על אף העובדה כי לא כל eluent העמודה derivatized, אות גדולה יחס רעש הם נצפו ולכן גבולות נמוכים של גילוי quantitation יכולים להיות מושגת.

כרומטוגרפיה זרימת תגובה פותחה כדי להתגבר על קשיים עם התאמת תגובת PCD ים לעמודות ומערכות HPLC מודרניים, במיוחד מההפסד היעיל הנגרם על ידי להקת הרחבה בשל כרכים מתו טור פוסט גדולים הנובעים מהצורך להעסיק תגובת נפח גדולה לולאות. תהליכי הערבוב היעילים יותר ב RF-PCD לעומת PCD הקונבנציונלי אומרים כרכי לולאת תגובה קטנה יכולים להיות מועסקים מובילים לעלייה יעילה הפרדה נצפית. יתר על כן כרומטוגרפיה RF-PCD מראה הן גדלו אות וירידת רעש לעומת טכניקות PCD קונבנציונליות וכתוצאה מכך גבולות נמוכים של גילוי quantitation בהשוואה לשיטות PCD קונבנציונליים. יתרון נוסף של RF-PCD בהשוואה לשיטות PCD קונבנציונאלי היא היכולת לנטר את זרם underivatized כי elutes מהנמל המרכזי של הטור RF כמו גם את זרם derivatized כי elutes מאזור הפריפריה של הטור. RF-PCD היא טכניקה חדשה יחסית אך מבטיח המציג יתרונות רבים על פני שיטות PCD המסורתית.

> חיבור של טור RF מושג כמעט באותו אופן כמו טור HPLC קונבנציונלי עם ההבדל העיקרי להיות מספר אבזרי קצה על עמודת RF. אבזרים המשמשים לחיבור טור HPLC תקן למערכת HPLC מסוגלים לשמש לחיבור טור RF למערכת HPLC.

Protocol

זהירות: עיין גיליונות נתוני בטיחות חומרים (MSDS) עבור כל החומרים ריאגנטים לפני השימוש (כלומר, MSDS עבור מתנול). להבטיח את השימוש של כל נהלי הבטיחות המתאימים בעת טיפול ממסים בעל ביצועים גבוהים eluent הנוזל כרומטוגרפיה (HPLC). ודא שימוש נאות של בקרות הנדסה של HPLC, מכשור איזון גלאי אנליטיים, ולהבטיח את השימוש בציוד מגן אישי (משקפי מגן, כפפות, חלוק, מכנסיים באורך מלא, ונעליים סגורות).

הערה: פרוטוקול זה מתאר 3 שיטות derivatization שלאחר טור זרימת תגובה (RF-PCD) טכניקות, כל אחד עם מגיב שונה ספציפי לאופי תרכובת כימית של עניין. לניתוח של ROS עבור לפרק "1. איתור של ROS באמצעות DPPH •", לניתוח של אמינים ראשוניים ראה סעיף "2. איתור של אמינים ראשוניים באמצעות fluorescamine", ועבור ניתוח של תרכובות פנוליות עבור לפרק "3 . איתור של פנוליםבאמצעות ferricyanide 4-aminoantipyrene ואשלגן ". השתמש במים טהורים (למשל, מים-Q מילי) לאורך כל הדרך.

הערה: חיבור של טור RF מושג כמעט באותו אופן כמו טור HPLC קונבנציונלי עם ההבדל העיקרי להיות מספר אבזרי קצה על עמודת RF. אבזרים המשמשים לחיבור טור HPLC תקן למערכת HPLC מסוגלים לשמש לחיבור טור RF למערכת HPLC.

1. איתור של ROS באמצעות DPPH •

  1. גדר של מכשיר HPLC
    1. הכן את מכשיר HPLC במי 100% על קו A, מתנול 100% על קו B כשלב הנייד. טהר את משאבות לפי דרישות היצרן.
    2. הגדרת רכיבי אינסטרומנטלי HPLC ואת משאבת derivatization הנוספת כפי שמודגם באיור 4 א.
    3. הגדר את גלאי UV-Vis לנתח באורך גל של 520 ננומטר.
  2. גדר שלטור RF
    1. חבר את כניסת טור RF אל מכשיר HPLC.
    2. חבר אורך 15 ס"מ של צינורות מזהה 0.13 מ"מ לשקע הנמל המרכזי של הטור RF.
    3. חבר יציאת היקפי מוצא אל גלאי UV-Vis באמצעות אורך 15 ס"מ של צינורות מזהה 0.13 מ"מ.
    4. חבר את קו משאבת DPPH • ליציאת פריפריה על היציאה של טור RF.
    5. חסום את היציאה ההיקפית בשימוש על היציאה של טור RF באמצעות פקק עמודה.
    6. תביאו את קצב הזרימה של המשאבה HPLC עד 1 מ"ל דקות -1 ב- B 100% קו - 100% מתנול.
    7. לאזן את העמודה עם השלב הנייד 100% מתנול למשך 10 דקות עבור טור באורך 4.6 מ"מ id x 100 מ"מ. הפעם צריך להיות מדורג על פי המידות של עמודות אחרות המשתמש רשאי להעסיק.
  3. הכנת מגיב • DPPH
    1. הכן פתרון 0.1 מ"ג / מ"ל של DPPH • מתנול.
    2. Sonicate את הבקבוק המכיל את מגיב DPPH • במשך 10 דקות.
    3. מכסים את הבקבוק בנייר כדי למנוע חשיפה לאור.
    4. טהר את משאבת DPPH • עם מגיב DPPH • מוכן בהתאם לדרישות היצרן.
  4. כוונון לשקע העמודה RF
    1. במדויק לשקול שני כלי נקי ויבש. לייבל שיט אחד כמרכזי ושני כמו פריפריה.
    2. אסוף הקולחים היוצאים בנמל המרכזי לתוך הכלי שכותרתו מרכזי 1.0 דקות.
    3. לשקול מחדש את הספינה לנמל המרכזית ולחשב את המשקל של הזרימה מהנמל המרכזי כדלקמן:
      משקל של מרכז פורט (g) = משקל סופי של כלי המרכזי הפורט (ז) - משקל ההתחלתי של כלי המרכזי פורט (ז)
    4. חזור על שלבי 1.4.2 ו 1.4.3 עבור הקולחים היוצאים UV-Vis המחובר ליציאה ההיקפית של טור RF ולחשב משקל עבור כלי היציאה ההיקפי כמוכדלקמן:
      משקל של היקפיים פורטים (g) = משקל סופי של כלים היקפיים פורטים (ז) - משקל ההתחלתי של כלים היקפיים פורטים (ז)
    5. חישוב אחוזי הזרם מגיע מהנמלים המרכזיות והיקפיות כדלקמן:
      במרכז פורט% = משקל של מרכז פורט (ז) / (משקל של מרכז פורט (g) + משקל של היקפיים פורט (ז)) x 100
      היקפי נמל% = משקל של היקפיים פורטים (ז) / (משקל של מרכז פורט (g) + משקל של היקפיים פורטים (ז)) x 100
    6. ודא יחס הסגמנטציה בין לזרם המרכזי ואת זרימת הפריפריה הוא 30:70 (מרכזי: פריפריה). אם הזרימה המרכזית היא מעל 30%, להפחית את כמות זרימת יציאה על ידי הוספה באורך של צינורות מזהים 0.13 מ"מ לשקע של הנמל המרכזי. אם הזרימה המרכזית היא מתחת ל -30% מקטין את האורך של צינורות 0.13 מ"מ מהנמל המרכזי.
    7. חזור על שלב 1.4.1 כדי 1.4.6 עד יחס פילוח 30:70 (מרכזי: היקפי) מושגת.
    8. הגדר את קצב הזרימה של Dמשאבת מגיב PPH • 0.5 מ"ל דקות -1.
      הערה: עמודת RF להגדיר עם מגיב DPPH • עכשיו הוא מוכן לניתוח. דוגמאות ניתן להזריק עכשיו.
  5. תנאים כיבוי להפעיל הודעה
    1. לאחר כל הדגימות כבר מוזרק, המציין כי בטווח סיים, להפסיק את זרימת משאבת מגיב derivatization.
    2. הסר את שורת משאבת מגיב DPPH • מנמל פריפרית פקק הנמל.
    3. לאזן את העמודה עם השלב הנייד בה יאוחסן בכך שהוא מאפשר בשלב הנייד לעבור דרך העמודה ב 1 מיליליטר דקות -1 למשך 10 דקות.
    4. עצור את הזרימה של משאבת השלב הניידת על מכשיר HPLC.
    5. החלף מגיב DPPH • עם מתנול ולטהר את המשאבה הנוספת.
      הערה: מערכת HPLC יכול עכשיו להיות הכיבוי.

2. איתור של אמינים ראשוניים בעזרת Fluorescאמין

  1. הכנת שלב הנייד
    1. הכן 1 ליטר של פתרון אצטט 10 מ"מ אמוניום, התאמת ה- pH של התמיסה ל 9.0 עם 5 M אמוניום הידרוקסיד לפני דילול נפח.
    2. הוסף 52.6 מ"ל של אצטוניטריל (ACN) למאגר אמוניום אצטט להשיג בשלב ניידים מעורבבים מראש של 95:05 (חיץ: ACN).
  2. גדר של מכשיר HPLC
    1. הכן את מכשיר HPLC עם למאגר מוכן מראש מעורב על קו כשלב הנייד. טהר את המשאבה לפי דרישות היצרן.
    2. הגדרת רכיבי אינסטרומנטלי HPLC ואת משאבת derivatization הנוספת כפי שמודגם באיור 4 א.
    3. צרף סליל dampener הדופק למשאבה derivatization.
    4. הגדרת גלאי הקרינה (FLD) עם גל עירור של 390 ננומטר אורך גל ופליטה של ​​475 ננומטר.
  3. גדר של עמודת RF
    1. חבר הכניסת דואר טור RF אל מכשיר HPLC.
    2. חבר אורך 15 ס"מ של צינורות מזהה 0.13 מ"מ לשקע הנמל המרכזי של הטור RF.
    3. חבר יציאה היקפית לשקע של טור RF אל גלאי FLD באמצעות אורך 15 סנטימטר של צינורות מזהים 0.13 מ"מ.
    4. חבר את קו משאבת derivatization ליציאת פריפריה על היציאה של טור RF.
    5. חסום את היציאה ההיקפית בשימוש על היציאה של טור RF באמצעות פקק עמודה.
    6. תביאו את קצב הזרימה של המשאבה HPLC עד 1 מ"ל דקות -1 ב 100% קו - 10 חיץ מ"מ אמוניום אצטט pH 9, premixed עם 5% ACN.
    7. לאזן את העמודה עם השלב הנייד 100% קו A למשך 10 דקות עבור טור באורך 4.6 מ"מ id x 100 מ"מ. זמן זה עשוי להיות מדורג על פי המידות של עמודות אחרות המשתמש רשאי להעסיק.
  4. הכנת מגיב fluorescamine
    1. הפוך 100 מ"ל של ריאגנט 0.1 מ"ג מ"ל -1 fluorescamine.
    2. Sonicate דקות 1.
    3. מכסים בנייר כסף, כדי למנוע חשיפה לאור.
    4. טהר את המשאבה מגיב עם ריאגנט fluorescamine המוכן בהתאם לדרישות היצרן.
  5. כוונון לשקע העמודה RF
    1. במדויק לשקול שני כלי נקי ויבש. לייבל שיט אחד כמרכזי ושני כמו פריפריה.
    2. אסוף הקולחים היוצאים בנמל המרכזי לתוך הכלי שכותרתו מרכזי 1.0 דקות.
    3. לשקול מחדש את הספינה המרכזית ולחשב את המשקל של הזרימה מהנמל המרכזי כדלקמן בשלב 1.4.3.
    4. חזור על שלבי 2.5.2 עד 2.5.3 עבור קולחי יציאת FLD המחובר ליציאה ההיקפית של טור RF ולחשב משקל היקפי כדלקמן בשלב 1.4.4.
    5. חישוב אחוזי הזרם מגיע מהנמלים המרכזיות והיקפיות כדלקמן בשלב 1.4.5.
    6. ודא יחס הסגמנטציה בין לזרם המרכזי ואת הפריפריההזרימה היא 43:57 (מרכזית: פריפריה). אם הזרימה המרכזית היא מעל 43%, להפחית את כמות זרימת יציאה על ידי הוספה באורך של צינורות מזהים 0.13 מ"מ לשקע של הנמל המרכזי. אם הזרימה המרכזית היא מתחת 43%, מקטין את האורך של צינורות 0.13 מ"מ מהנמל המרכזי.
    7. חזור על שלב 2.5.1 כדי 2.5.6 עד יחס פילוח 43:57 (מרכזי: היקפי) מושגת.
    8. הגדר את קצב הזרימה של משאבת השלב הניידת 0.7 מיליליטר דקות -1.
    9. הגדר את משאבת derivatization לזרום ברמה של 0.1 מ"ל דקות -1.
      הערה: עמודת RF להגדיר עם מגיב fluorescamine מוכנה כעת לניתוח. דוגמאות ניתן להזריק עכשיו.
  6. תנאים כיבוי להפעיל הודעה
    1. לאחר כל הדגימות כבר מוזרק, המציין כי בטווח סיים, להפסיק את משאבת derivatization.
    2. הסר את שורת משאבת derivatization מנמל פקק הפריפריה.
    3. לאזן את העמודה עם השלב סלולריבו יאוחסן בכך שהוא מאפשר בשלב הנייד לעבור דרך העמודה ב 1 מיליליטר דקות -1 למשך 10 דקות.
    4. עצור את הזרימה של המשאבה בשלב הניידת.
    5. החלף מגיב fluorescamine עם אצטוניטריל ולטהר את משאבת derivatization.
      הערה: מערכת HPLC יכול עכשיו להיות הכיבוי.

3. איתור של פנולים בעזרת 4-Aminoantipyrene ואשלגן Ferricyanide

  1. הכנת שלב הנייד
    1. הכן 1 ליטר של פתרון אמוניום אצטט 100 מ"מ, התאמת ה- pH של התמיסה ל 9.0 עם 5 M אמוניום הידרוקסיד לפני דילול נפח.
    2. הוסף 52.6 מיליליטר של מתנול למאגר אמוניום יצטט להשיג בשלב נייד מעורבב מראש של 95: 5 (חיץ: מתנול).
  2. גדר של מכשיר HPLC
    1. הכן את מכשיר HPLC עם למאגר מוכן מראש מעורב על קו כשלב הנייד. טהר את המשאבה לפי יצרן "; S דרישות.
    2. הגדרת רכיבי אינסטרומנטלי HPLC ואת שתי המשאבות מגיבות נוספות כפי שמודגם באיור 4B.
    3. צרף סליל dampener הדופק לכל אחת המשאבות מגיב.
    4. הגדר את גלאי UV-Vis לנתח באורך גל של 500 ננומטר.
  3. גדר של עמודת RF
    1. חבר את כניסת טור RF אל מכשיר HPLC.
    2. חבר אורך 15 ס"מ של צינורות מזהה 0.13 מ"מ לשקע הנמל המרכזי של הטור RF.
    3. חבר יציאה היקפית לשקע של טור RF אל גלאי UV-Vis באמצעות אורך 15 סנטימטר של צינורות מזהים 0.13 מ"מ.
    4. חבר אחד מגיב (כלומר, 4-aminoantipyrene ו ferricyanide אשלגן) קו משאבה ליציאת פריפריה על היציאה של טור RF.
    5. תביאו את קצב הזרימה של המשאבה HPLC עד 1 מ"ל דקות -1 ב 100% קו - 100 מ"מ אמוניום אצטט חיץ pH 9, premixed עם 5% מתנול.
    6. לאזן את העמודה wה- i בשלב ניידים 100% קו A למשך 10 דקות עבור טור באורך 4.6 מ"מ id x 100 מ"מ. זמן זה עשוי להיות מדורג על פי המידות של עמודות אחרות המשתמש רשאי להעסיק.
  4. הכנה מגיב 4-aminoantipyrene
    1. הכן חיץ אמוניום אצטט עם pH של 9 על ידי ביצוע צעד 3.1.1.
    2. לשקול 150 מ"ג 4-aminoantipyrene ו להתמוסס 100 מ"ל של חיץ אמוניום אצטט מוכן (pH 9).
    3. Sonicate דקות 1.
    4. מכסים בנייר כסף, כדי למנוע חשיפה לאור.
    5. טהר את משאבת המגיב הראשונה עם מגיב 4-aminoantipyrene המוכן בהתאם לדרישות היצרן.
  5. הכנת מגיב אשלגן ferricyanide
    1. לשקול 150 מ"ג של ferricyanide אשלגן מתמוססים 100 מ"ל של חיץ אמוניום אצטט (pH 9) הכין לפי צעד 3.1.1.
    2. Sonicate דקות 1.
    3. מכסים בנייר כסף, כדי למנוע חשיפה לאור.
    4. Purgדואר המשאבה מגיבה השנייה עם מגיב אשלגן ferricyanide המוכן בהתאם לדרישות היצרן.
  6. כוונון של עמודת RF
    1. במדויק לשקול שני כלי נקי ויבש. לייבל שיט אחד כמרכזי ושני כמו פריפריה.
    2. אסוף הקולחים היוצאים בנמל המרכזי לתוך הכלי שכותרתו מרכזי 1.0 דקות.
    3. לשקול מחדש את הספינה המרכזית ולחשב את המשקל של הזרימה מהנמל המרכזי כדלקמן בשלב 1.4.3.
    4. חזור על שלבי 3.6.2 עד 3.6.3 עבור הקולחים היוצאים UV-Vis המחובר ליציאה ההיקפית של טור RF ולחשב משקל היקפי כדלקמן בשלב 1.4.4.
    5. חישוב אחוזי הזרם מגיע מהנמלים המרכזיות והיקפיות כדלקמן בשלב 1.4.5.
    6. ודא יחס הסגמנטציה בין לזרם המרכזי ואת זרימת הפריפריה הוא 50:50 (מרכזי: פריפריה). אם הזרימה המרכזית היא מעל 50%, להפחית אתכמות זרימת יציאה על ידי הוספה באורך של צינורות מזהים 0.13 מ"מ ליציאה המרכזית לשקע. אם הזרימה המרכזית היא מתחת ל -50%, להפחית את האורך של צינורות 0.13 מ"מ מהנמל המרכזי.
    7. חזור על שלב 3.6.1 כדי 3.6.6 עד יחס פילוח 50:50 (מרכזי: היקפי) מושגת.
    8. הגדר את קצב הזרימה של המשאבה 4-aminoantipyrene 0.5 מ"ל דקות -1.
    9. הגדר את קצב הזרימה של המשאבה אשלגן ferricyanide 0.25 מ"ל דקות -1.
      הערה: עמודת RF להגדיר עם ריאגנטים דו רכיבים מוכנה כעת לניתוח. דוגמאות ניתן להזריק עכשיו.
  7. תנאים כיבוי להפעיל הודעה
    1. לאחר כל הדגימות כבר מוזרק בטווח סיים, המציין כי בטווח סיים, להפסיק הן של המשאבות המגיבות.
    2. הסר את קווי משאבה מגיב מהנמלים ההיקפיים ולהחליף אותם עם חתיכת 15 סנטימטר של צינורות 0.13 מ"מ.
    3. לאזן את העמודה עם השלב הנייד WHIch זה יאוחסן על ידי מתן אפשרות לשלב הנייד לעבור דרך העמודה ב 1 מ"ל דקות -1 למשך 10 דקות.
    4. עצור את הזרימה של משאבת השלב הניידת על מכשיר HPLC.
    5. החלף את שני ריאגנטים על הגיב משאבות עם מתנול ולטהר את המשאבות נוספות על פי דרישת יצרן.
      הערה: מערכת HPLC יכול עכשיו להיות הכיבוי.

תוצאות

שיטת PCD הראשונה הותאמה לשימוש על ידי RF-PCD הייתה derivatization של נוגדי חמצון באמצעות 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil הרדיקלי (DPPH •) 24. תגובה זו הונהגה על ידי ואח Koleva. 25 כבר בשימוש נרחב מאז. הגילוי מסתמך על הַדהָיָה של DPPH • הרדיקלי בנוכחות של מיני חמצן תגובתי, ומכא...

Discussion

RF-PCD מאפשר ערבוב יעיל של מגיב derivatization עם הפוסט-טור בשפכים HPLC ללא שימוש סלילי התגובה, למזער את ההשפעות של הרחבת הלהקה ושיפור ביצועים ההפרדה. שיטות RF-PCD גם הראו שיפורים בתגובה האות ביחס שיטת הזיהוי. Camenzuli et al. 28 היה הראשון לדווח על השימוש בעמודי זרימת תגובה עם DPPH...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
HPLC instrumentAgilent1290 Series HPLC
Additional Pump(s) for derivatization systemShimadzuLC-20A
RF columNon-commercial
PEEK tubingSigma AldrichZ227307
Column stoppersProvided with column
PEEK tube cutterSigma AldrichZ290882
Analytical Scale Balance4-point analytical balance
Stop watchNon-Scientific equiptment
Eluent collection vialsAny Small vial with a flat bottom will do, e.g., HPLC vials
HPLC VialsWill depend on instrument used
Vessels for mobile phase and derivatization solution(s)Sigma AldrichZ232211
General Laboratory glasswareVolumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method.
MethanolSigma Aldrich34860
DPPHSigma AldrichD9132
Ammonium AcetateSigma Aldrich17836
AmmoniaSigma Aldrich320145Corrosive
AcetonitrileSigma Aldrich34998
FluorescamineSigma AldrichF9015
4-aminoantipyrene Acros Organics BVBAAC103151000
Potassium ferricyanide AnalaRB10204-30

References

  1. Srijaranai, S., et al. Use of 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol as the post column reagent for ion exchange chromatography of heavy metals in environmental samples. Microchem. J. 99, 152-158 (2011).
  2. Kubickova, A., Kubicek, V., Coufal, P. UV-VIS detection of amino acids in liquid chromatography: online post-column solid-state derivatization with Cu(II) ions. J Sep Sci. 34, 3131-3135 (2011).
  3. Quinto, M., Spadaccino, G., Palermo, C., Centonze, D. Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection. J. Chromatogr. A. 1216, 8636-8641 (2009).
  4. Lee, M., Lee, Y., Soltermann, F., von Gunten, U. Analysis of N-nitrosamines and other nitro(so) compounds in water by high-performance liquid chromatography with post-column UV photolysis/Griess reaction. Water Res. 47, 4893-4903 (2013).
  5. Niu, Y., et al. Identification of isoflavonoids in Radix Puerariae for quality control using on-line high performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray ionization-mass spectrometry coupled with post-column derivatization. Food Res Int. 48, 528-537 (2012).
  6. Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. Liquid chromatography coupled to on-line post column derivatization for the determination of organic compounds: a review on instrumentation and chemistries. Anal. Chim. Acta. 798, 1-24 (2013).
  7. Dousa, M., Brichac, J., Gibala, P., Lehnert, P. Rapid hydrophilic interaction chromatography determination of lysine in pharmaceutical preparations with fluorescence detection after postcolumn derivatization with o-phtaldialdehyde. J Pharm Biomed Anal. 54, 972-978 (2011).
  8. Iijima, S., et al. Optimization of an Online Post-Column Derivatization System for Ultra High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) and Its Applications to Analysis of Biogenic Amines. Anal Sci. 29, 539-545 (2013).
  9. Cunico, R. L., Schlabach, T. Comparison of Ninhydrin and o-Phthalaldehyde Postcolumn Detection Techniques for High Performance Liquid Chromatography of Free Amino. J. Chromatogr. A. 1983, 461-470 (1983).
  10. Donahue, E. P., Brown, L. L., Flakoll, P. J., Abumrad, N. N. Rapid Measurement of Leucine-specific Activity in Biological Fluids by Ion-exchange Chromatography and Post-column Ninhydrin Detection. J. Chromatogr. A. 571, 29-36 (1998).
  11. Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: A Reagent for Assay of Amino Acids, Peptides, Proteins and Primary Amines in the Picomole Range. Science. 1972, 871-872 (1972).
  12. Samejima, K. Separation of Fluorescamine Derivitices of Aliphatic Diamines and Polyamines by High Speed Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 96, 250-254 (1974).
  13. Zhang, Y., et al. Evaluation of antioxidant activity of ten compounds in different tea samples by means of an on-line HPLC-DPPH assay. Food Res Int. 53, 847-856 (2013).
  14. Niu, Y., et al. Identification of the anti-oxidants in Flos Chrysanthemi by HPLC-DAD-ESI/MS(n) and HPLC coupled with a post-column derivatisation system. Phytochem Anal. 24, 59-68 (2013).
  15. Raudonis, R., Bumblauskiene, L., Jakstas, V., Pukalskas, A., Janulis, V. Optimization and validation of post-column assay for screening of radical scavengers in herbal raw materials and herbal preparations. J. Chromatogr. A. 1217, 7690-7698 (2010).
  16. Raudonis, R., Raudone, L., Jakstas, V., Janulis, V. Comparative evaluation of post-column free radical scavenging and ferric reducing antioxidant power assays for screening of antioxidants in strawberries. J. Chromatogr. A. 1233, 8-15 (2012).
  17. Zakrzewski, R. Determination of Methimazole in Pharmaceutical Preparations using an HPLC Method Coupled with an Iodine-Azide Post-Column Reaction. J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 32, 383-398 (2008).
  18. Zakrzewski, R. Development and validation of a reversed-phase HPLC method with post-column iodine-azide reaction for the determination of thioguanine. J. Anal. Chem. 64, 1235-1241 (2009).
  19. Gritti, F., Guiochon, G. Accurate measurements of the true column efficiency and of the instrument band broadening contributions in the presence of a chromatographic column. J. Chromatogr. A. 1327, 49-56 (2014).
  20. Stewart, J. T. Post cotumn derivatization methodology in high performance liquid chromatography (HPLC). Trends Anal. Chem. 1, 170-174 (1982).
  21. Rigas, P. G. Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography. Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).
  22. Frei, R. W. Reaction Detectors in Modern Liquid Chromatography. Chromatographia. 15, 161-166 (1982).
  23. Pravadil-Cekic, S., et al. Using Reaction Flow Chromatography for the Analysis of Amino Acid: Derivatisation With Fluorescamine Reagent. Microchem. J. , (2015).
  24. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).
  25. Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures. Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).
  26. Selim, M., et al. A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography. Microchem. J. 116, 87-91 (2014).
  27. Bigley, F. P., Grob, R. L. Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).
  28. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products. J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

110High Performance LiquidderivatizationDPPHfluorescamine

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved