Nachsäulenderivatisierung Mit Reaktionsfluß High Performance Liquid Chromatography Columns

Zusammenfassung

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Zusammenfassung

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

Einleitung

Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC), gekoppelt mit Nachsäulenderivatisierung (PCD) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das bei der Lösung einer Reihe von Fragen im analytischen Labor nützlich ist. Es kann verwendet werden , um Verbindungen zu detektieren , die ansonsten nicht nachweisbar mit der Suite von ^1,2 verfügbaren Detektoren sind, um das Signal des Zielanalyten erhöhen, was niedrigere Nachweisgrenzen und Bestimmungs ^3-5 oder selektiv ermöglicht Derivatisierung eines Zielanalyten , um zu vermeiden , Matrixeffekte ^6. Üblicherweise verwendete PCD Reaktionen schließen die Reaktion von Aminen, wie Aminosäuren, mit ortho-phthaladehyde ^7-9, Ninhydrin ^9,10 oder Fluorescamin ^11,12, die Derivatisierung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) mit dem 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazil Radikal (DPPH) ^{• 13,14} oder 2,2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure (ABTS) ^15,16, und die Verwendung des Jodids-Azid - Reagenz Schwefel c zu derivatisierenontaining Verbindungen ^17,18.

Es gibt jedoch zahlreiche Nachteile bei der Verwendung von PCD Reaktionen mit HPLC - Systemen ^6. Hauptsächlich unter diesen ist die Verwendung von Reaktionsspulen zwischen dem Punkt der Zugabe des Derivatisierungsreagenz (n) und dem Detektor, die Zeit für das Mischen und die Reaktion erlauben , ⁸ auftreten. Diese Reaktionsschleifen haben oft Volumina von 500 & mgr; l oder mehr, was signifikant ist im Vergleich zu dem Volumen der Rest des HPLC - Systems ^19. Die Verwendung dieser hohen Volumenreaktionsschleifen führt zu einer erhöhten Spitzenverbreiterung Vergleich zu dem, was ohne die Anwesenheit der Reaktionsschleife beobachtet werden würde. Dies führt zu kürzeren, breiteren Spitzen, die eine höhere Grenzen der Quantifizierung und Detektion haben und negativ bewirkt chromatographische Auflösung. 1 und 2 unterstreichen die Verschlechterung der Peakform , die aus der Zugabe von verschiedenen Nachsäulenderivatisierung Schleife Volumina zur Folge haben . Diese Analysewurde mit einer Zusammensetzung der mobilen Phase von 94% Methanol und 6% Milli-Q-Wasser durchgeführt. Die Flussrate der mobilen Phase betrug 1 ml / min, war das Injektionsvolumen 20 & mgr; l und die Analyse Wellenlänge betrug 265 nm. Spulen unterschiedlicher Totvolumina von 20 & mgr; l bis 1000 & mgr; l wurden zwischen der Säule und dem Detektor eingesetzt, um die Auswirkungen der Reaktionsschleife Totvolumen in PCD Verfahren zu simulieren. Diese Schleifen wurden aus Edelstahlrohr von 0,5 mm Innendurchmesser hergestellt. Das Experiment wurde an einem HPLC-System durchgeführt, bestehend aus einer Steuereinheit (SCL-10AVP), eine Niederdruck-Gradient Ventil (FCL-10ALVP), eine Pumpe (LC-20AD), einem Injektor (SIL-10ADVP) und einem PDA-Detektor ( SPD-M10ADVP). Die mobile Phase war durch einen Entgaser vor der Einführung in das HPLC-System gepumpt. Die Trennung wurde unter Verwendung einer 250 mm x 4,6 mm ID-Säule 5 um durchgeführt. Versuchsbedingungen wurden gewählt, um die typisch für PCD Reaktionen, die vor kurzem in der Literatur veröffentlicht wurden.

Daseinfachste, am häufigsten Nachsäulenreaktor Aufbau ist eine nicht-segmentierten Rohrreaktor bezeichnet, die die Flüssigkeit fließt, durch die effektiv eine lange, dünne Röhre ist und die Reaktion stattfinden kann. In diesem System Spitze ist Verbreiterung abhängig nicht nur das Totvolumen zu dem System hinzugefügt, sondern auch der Innendurchmesser des Rohres , wie durch Iijima hervorgehoben et al. ^8. Darüber hinaus spielt Spulengeometrie eine Rolle bei der Marke Verbreiterung beobachtet. Stewart ²⁰ festgestellt , dass die sekundären Strömungsprofile des Reaktors Aufwickeln ändert, in eine bessere Durchmischung ergibt, was bedeutet , dass das Totvolumen minimiert werden kann. Es wurde festgestellt , dass die Peakverbreiterung nicht signifikant ist , wenn eine offene röhrenförmige Spule ²¹ gestrickt werden. Wenn die Peakverbreiterung zu große, andere Arten von Reaktoren ist auch ^20,22 angesehen werden kann. Diese können Bettreaktoren oder segmentierte Strömungsreaktoren umfassen. Diese Reaktoren sind besonders nützlich für langsame Reaktionen, die sonst require große Reaktionsschleifen. Als nicht-segmentierten Rohrreaktoren sind die häufigsten Arten von Reaktoren in PCD-Anwendungen verwendet werden, der Rest dieses Artikels befasst sich mit diesem Reaktortyp-Setup.

Die Gestaltung der Reaktionsstrom (RF) Spalte enthält einen Multiport-Endanschlußstück, die mobile Phase (oder Eingabe) die Säule entweder durch einen einzelnen Port an dem radialen mittleren Bereich der Kolonne oder drei Öffnungen an der äußeren Lage angeordnet zu verlassen erlaubt Wandbereich der Säule (siehe Abbildung 3). Diese beiden Ströme werden getrennt Endfitting mit einer zentralen porösen Fritte enthält, die durch eine undurchlässige Ring umgeben ist, der wiederum durch eine äußere poröse Fritte umgeben ist, die an der Kolonnenwand heraus erstreckt. Aufgrund der zentralen Strömungs undurchlässige Ringquer ist zwischen den beiden porösen Bereichen nicht möglich.

Während der Reaktionsströmungs Chromatographie das Derivatisierungsreagenz (s) gegen die Strömungsrichtung der mobilen Phase gepumpt in einen oder two der äußeren Öffnungen des Reaktionsstromkolonne. Die Säule wird mit dem Eluens Derivatisierungsreagenz (s) in der äußeren Fritte vermischt und zu dem Detektor durch einen freien Außen Port geleitet. Die Reaktionsstrom kann entweder für ein einzelnes Reagenz Derivatisierung verwendet werden oder einem dualen Reagenzsystem (2 Anschlüsse für die Derivatisierungsreagenzien (1-Port für den Derivatisierungsreagenzes, 1 Anschluss des Säuleneluent an den Detektor und 1 Port blockiert passieren) und 1-Port passieren die Säuleneluent zum Detektor). Die Strömung aus dem zentralen Strom kann entweder verwendet werden , um die nicht derivatisierte Säuleneluent zu erfassen, effektiv Multiplexen Detektions ²³ oder Abfall geleitet.

Eine Hauptabstimmungstechnik, die verfügbar ist, wenn ausgeführt RF-PCD-Chromatographie ist das Verhältnis der zentralen und peripheren fließt. Das optimale Verhältnis für jede Derivatisierung hängt von einer Reihe von Faktoren ab, wie beispielsweise, ob die zentralen Strömungs wird Abfall nachgewiesen oder übergeben werden. Daher einmal das optimale Verhältnis bestimmt worden istSollte es, dass die richtige Strömungsverhältnis wird jedem Lauf durchgeführt wird, bevor erreicht werden gewährleistet.

Es wurde gefunden, dass die Verwendung einer Fritte in effizienter Vermischung im Vergleich zu herkömmlichen Mischtechniken, verwenden typischerweise einen Null Totvolumen T-Stück oder geringes Totvolumen der Säule Eluentenstrom und das Derivatisierungsreagenz in RF-PCD Ergebnisse zu mischen W- Stück die beiden Ströme zu mischen. Dies hat sich für die Verwendung von relativ kleinen Reaktionsschleifen, oder sogar die Eliminierung der Reaktionsschleife insgesamt erlaubt. Die Reduktion der Reaktionsschleife Größe führt zu schärferen Peaks im Vergleich zu herkömmlichen Nachsäulenderivatisierung Methoden. Das bedeutet, dass, trotz der Tatsache, dass nicht alle der Säule Eluent wird derivatisiert, größeres Signal-Rausch-Verhältnisse eingehalten werden und somit niedrigere Nachweisgrenzen und Bestimmungs erreicht werden.

Die Reaktionsfluss-Chromatographie wurde Schwierigkeiten bei der Anpassung von PKD-Reaktion zu überwinden entwickelts zu modernen HPLC-Säulen und Systeme, insbesondere der Effizienzverlust durch Band verursachte Verbreiterung aufgrund der großen Post-Säule Toten durch die Notwendigkeit verursacht Volumina großes Volumen Reaktion zu verwenden Schleifen. Die effizientere Mischprozesse in RF-PCD im Vergleich zu herkömmlichen PCD bedeuten, dass kleinere Reaktionsschleife Volumina verwendet werden in beobachteten Abscheideleistung zu einer Erhöhung führt. Weiterhin RF-PCD-Chromatographie zeigt sowohl Signal erhöht und verringert Lärm im Vergleich zu herkömmlichen Techniken PCD in unteren Grenzen der Nachweis und die Quantifizierung im Vergleich zu herkömmlichen Methoden PCD führt. Ein zusätzlicher Vorteil des RF-PCD im Vergleich zu herkömmlichen PCD Methoden ist die Fähigkeit, den underivatisierten Strom zu überwachen, die von dem zentralen Port des RF-Säule sowie der derivatisierten Strom eluiert, die aus dem Umfangsbereich der Säule eluiert. RF-PCD ist ein relativ neues, aber vielversprechende Technik, die viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden PCD zeigt.

Anschluss der RF-Säule wird in fast der gleichen Weise wie eine herkömmliche HPLC-Säule mit dem wichtigen Unterschied, die Anzahl der Endarmaturen auf einer RF-Säule erreicht. verwendeten Armaturen eine Standard-HPLC-Säule mit dem HPLC-System zu verbinden, können verwendet werden, um eine RF-Säule mit dem HPLC-System zu verbinden.

Protokoll

Achtung: Bitte beachten Sie Sicherheitsdatenblätter (MSDS) für alle Materialien und Reagenzien vor der Verwendung (dh MSDS für Methanol). Achten Sie darauf, den Einsatz aller geeigneten Praktiken Sicherheit bei Lösungsmitteln und High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Eluent Handhabung. Stellen Sie sicher, angemessene Nutzung von Engineering-Kontrollen von HPLC, Analysenwaage und Detektor Instrumentierung, und sorgen für die Verwendung persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen und geschlossene Schuhe).

Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt 3 Methoden der Reaktionsströmungs Nachsäulenderivatisierung (RF-PCD) -Techniken, die jeweils mit einem anderen Reagenz, spezifisch für die Art einer chemischen Verbindung von Interesse. Gehen Sie für die Analyse von ROS Abschnitt "1. Detektion von ROS mit DPPH ^•" für die Analyse von primären Aminen Abschnitt "2. Nachweis von primären Aminen unter Verwendung von Fluorescamin" und für die Analyse von phenolischen Verbindungen gehen in Abschnitt "3 sehen . Nachweis von PhenolenVerwendung von 4-Aminoantipyren und Kaliumferricyanid ". Verwenden von ultrareinem Wasser (zB Milli-Q - Wasser) im gesamten Gebäude .

Hinweis: Der Anschluss der RF-Säule wird in fast der gleichen Weise wie eine herkömmliche HPLC-Säule mit dem wichtigen Unterschied, die Anzahl der Endarmaturen auf einer RF-Säule erreicht. verwendeten Armaturen eine Standard-HPLC-Säule mit dem HPLC-System zu verbinden, können verwendet werden, um eine RF-Säule mit dem HPLC-System zu verbinden.

1. Nachweis von ROS Mit DPPH ^•

1. Einrichten von HPLC - Instrument
   1. Bereiten Sie die HPLC-Instrument mit 100% Wasser auf der Linie A und 100% Methanol auf Linie B als mobile Phase. Spülen Sie die Pumpen gemäß Herstelleranforderungen.
   2. Stellen Sie die HPLC instrumentalen Komponenten und die zusätzliche Derivatisierung Pumpe wie in 4A dargestellt.
   3. Stellen Sie die UV-Vis-Detektor bei einer Wellenlänge von 520 nm zu analysieren.
2. Einrichten vonRF-Säule
   1. Verbinden des Einlasses der RF-Säule mit dem HPLC-Instrument.
   2. Schließen Sie eine 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch zentralen Anschluss der HF-Säule zum Auslass.
   3. Schließen Sie einen Ausgang Peripherieschnittstelle an die UV-Vis-Detektor mit einer 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch verwenden.
   4. Schließen Sie die DPPH ^• Pumpenleitung an einen Peripherie - Anschluss am Ausgang des HF - Säule.
   5. Blockieren die nicht verwendeten Peripherieschnittstelle am Ausgang der RF Spalte einen Spalten Stopper verwendet wird.
   6. Bringen die Strömungsrate der HPLC - Pumpe auf 1 ml min ^-1 bei 100% -Linie B - 100% Methanol.
   7. Äquilibrierung der Säule mit 100% Methanol mobile Phase für 10 min für eine 4,6 mm ID x 100 mm Säule Länge. Diese Zeit sollte entsprechend den Abmessungen der anderen Spalten skaliert der Benutzer verwenden kann.
3. Herstellung von DPPH ^• Reagenz
   1. Bereiten Sie eine 0,1 mg / ml Lösung von DPPH ^• in Methanol.
   2. Beschallen den Kolben , der die DPPH ^• Reagenz für 10 min enthält.
   3. Decken Sie den Kolben in Folie Lichteinwirkung zu verhindern.
   4. Spülen Sie die DPPH ^• Pumpe mit dem vorbereiteten DPPH ^• Reagenz gemäß den Herstelleranforderungen.
4. Einstellen des HF - Kolonnenauslaß
   1. Exakt zwei saubere und trockene Gefäße wiegen. Beschriften Sie ein Gefäß als zentrale und die andere als peripher.
   2. Sammeln Sie die Abwasser den zentralen Anschluss in das Gefäß verlass für 1,0 min zentrale markiert.
   3. Wieder wiegen den Zentralbehälter Port und berechnen das Gewicht der Strömung von dem zentralen Port wie folgt:
      Gewicht des Zentralanschluss (g) = Endgewicht Zentral Hafen Schiffs (g) - Anfangsgewicht von Zentral Hafen Schiffs (g)
   4. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.2 und 1.4.3 für das Abwasser Austritt aus dem UV-Vis, die an den Peripherieanschluss des HF-Säule und berechnen Gewicht für die Peripherieschnittbehälter angebracht ist, wiefolgt:
      Gewicht der Peripherieschnittstelle (g) = Endgewicht Peripherieschnittbehälter (g) - Anfangsgewicht von Peripherieschnittbehälter (g)
   5. Berechnen des Prozentsatzes der Strömung aus den zentralen und peripheren Ports kommen, wie folgt:
      % Zentral Port = Gewicht der Zentralanschluss (g) / (Gewicht des Zentralanschluss (g) + Gewicht der Peripherieschnittstelle (g)) x 100
      % Peripherieschnitt = Gewicht der Peripherieschnittstelle (g) / (Gewicht des Zentralanschluss (g) + Gewicht der Peripherieschnittstelle (g)) x 100
   6. Sicherstellen, dass die Segmentierung Verhältnis zwischen dem zentralen Strömungs und dem peripheren Strömungs 30:70 (Zentral: periphere). Wenn die zentrale Strömung oberhalb von 30% liegt, verringern die Menge der Strömung austritt durch eine Länge von 0,13 mm id Schlauch mit dem Auslass des zentralen Port hinzufügen. Wenn der zentrale Strömungs unter 30% ist, die Länge von 0,13 mm Schlauch von dem zentralen Port verringern.
   7. Wiederholen Sie Schritt 1.4.1 bis 1.4.6, bis ein Segmentierungsverhältnis von 30:70 (Zentral: periphere) erreicht wird.
   8. Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit des DPPH ^• Reagenzienpumpe auf 0,5 ml min ^-1.
      Hinweis: Die HF - Säule mit DPPH ^• Reagenz einrichten nun zur Analyse bereit ist. Proben können nun eingespritzt werden.
5. Beitrag laufen Abschaltbedingungen
   1. Sobald alle Proben injiziert wurden, was darauf hinweist, dass der Lauf beendet ist, stoppen Sie die Strömungspumpe Derivatisierungsreagenzes.
   2. Entfernen Sie die DPPH ^• Reagenz Pumpenleitung aus dem peripheren Anschluss und Stopper auf den Hafen.
   3. Durch die Säule zu passieren , auf 1 ml min ^-1 für 10 min Äquilibrieren der Säule mit der mobilen Phase , in der sie , indem die mobile Phase gespeichert werden soll.
   4. Stoppen Sie den Fluss der mobilen Phase Pumpe auf dem HPLC-Instrument.
   5. Ersetzen Sie das DPPH ^• Reagenz mit Methanol und spülen Sie das zusätzliche Pumpe.
      Hinweis: Das HPLC-System jetzt abgeschaltet werden kann.

2. Nachweis von primären Aminen FluorescAmin

1. Vorbereitung der mobilen Phase
   1. Vorbereitung 1 l einer 10 mM Ammoniumacetat-Lösung, um den pH der Lösung auf 9,0 mit 5 M Ammoniumhydroxid vor dem Verdünnen auf das Volumen eingestellt wird.
   2. In 52,6 ml Acetonitril (ACN) mit dem Ammoniumacetatpuffer einer vorgemischten mobilen Phase von 95:05 (Puffer: ACN) zu erreichen.
2. Einrichten von HPLC - Instrument
   1. Bereiten Sie die HPLC-Instrument mit dem vorgemischten vorbereitete Puffer auf der Linie A als mobile Phase. Spülen Sie die Pumpe gemäß Herstelleranforderungen.
   2. Stellen Sie die HPLC instrumentalen Komponenten und die zusätzliche Derivatisierung Pumpe wie in 4A dargestellt.
   3. Bringen Sie ein Pulsationsdämpfer Spule an die Derivatisierung Pumpe.
   4. Set-up der Fluoreszenzdetektor (FLD) mit einer Anregungswellenlänge von 390 nm und Emissionswellenlänge von 475 nm.
3. Einrichten von HF - Säule
   1. Schließen Sie the Einlass der RF-Säule mit dem HPLC-Instrument.
   2. Schließen Sie eine 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch zentralen Anschluss der HF-Säule zum Auslass.
   3. Schließen Sie einen Ausgang Peripherieanschluss des HF-Säule mit dem FLD Detektor eine 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch verwenden.
   4. Verbinden der Derivatisierung Pumpenleitung zu einem peripheren Anschluss am Auslass der RF-Säule.
   5. Blockieren die nicht verwendeten Peripherieschnittstelle am Ausgang der RF Spalte einen Spalten Stopper verwendet wird.
   6. Bringen die Strömungsrate der HPLC - Pumpe auf 1 ml min ^-1 bei 100% -Linie A - 10 mM Ammoniumacetat - Puffer pH 9, vorgemischt mit 5% ACN.
   7. Äquilibrierung der Säule mit der 100% -Linie Eine mobile Phase für 10 min für eine 4,6 mm ID x 100 mm Säule Länge. Diese Zeit kann je nach den Abmessungen der anderen Spalten skaliert der Benutzer verwenden kann.
4. Herstellung von Fluorescamin Reagenzes
   1. Stellen Sie 100 ml einer 0,1 mg ml ^-1 Fluorescamin Reagenz.
   2. Ultraschallbad für 1 min.
   3. Mit Folie abdecken Lichteinwirkung zu verhindern.
   4. Spülen Sie die Reagenzienpumpe mit dem vorbereiteten Fluorescamin Reagenz gemäß den Herstelleranforderungen.
5. Einstellen des HF - Kolonnenauslaß
   1. Exakt zwei saubere und trockene Gefäße wiegen. Beschriften Sie ein Gefäß als zentrale und die andere als peripher.
   2. Sammeln Sie die Abwasser den zentralen Anschluss in das Gefäß verlass für 1,0 min zentrale markiert.
   3. Wieder wiegen den Zentralbehälter und berechnen das Gewicht der Strömung von dem zentralen Port wie in Schritt 1.4.3 folgt.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 2.5.2 für das Abwasser zu 2.5.3 die FLD austretende, die an den Peripherieanschluss des HF-Säule und berechnen Gewicht für periphere angebracht ist, wie in Schritt 1.4.4 folgt.
   5. Berechnen des Prozentsatzes der Strömung aus den zentralen und peripheren Ports kommen, wie in Schritt 1.4.5 folgt.
   6. Sicherstellen, dass die Segmentierung Verhältnis zwischen dem zentralen Strömungs und dem peripherenFlow ist 43:57 (Zentral: periphere). Wenn die zentrale Strömung oberhalb 43% ist, verringern die Menge der Strömung austritt durch eine Länge von 0,13 mm id Schlauch mit dem Auslass des zentralen Port hinzufügen. Wenn der zentrale Strömung unter 43% ist, verringern Sie die Länge von 0,13 mm Schlauch aus dem zentralen Anschluss.
   7. Wiederholen Sie Schritt 2.5.1 bis 2.5.6, bis ein Segmentierungsverhältnis von 43:57 (Zentral: periphere) erreicht wird.
   8. Stellen Sie die Durchflussrate der mobilen Phase Pumpe auf 0,7 ml min ^-1.
   9. Stellen Sie die Derivatisierung Pumpe bei 0,1 ml min ^-1 fließen.
      Hinweis: Die HF-Säule mit Fluorescamin Reagenz eingerichtet für die Analyse ist nun fertig. Proben können nun eingespritzt werden.
6. Beitrag laufen Abschaltbedingungen
   1. Sobald alle Proben injiziert wurden, was darauf hinweist, dass der Lauf beendet ist, stoppen Sie die Derivatisierung Pumpe.
   2. Entfernen Sie die Derivatisierung Pumpenleitung aus dem peripheren Anschluss und Stopper.
   3. Äquilibrieren der Säule mit der mobilen Phase indie es gespeichert werden soll , indem die mobile Phase durch die Säule passieren bei 1 ml min ^-1 für 10 min.
   4. Stoppen Sie den Fluss der mobilen Phase Pumpe.
   5. Ersetzen Sie das Fluorescamin Reagenz mit Acetonitril und spülen Sie das Derivatisierung Pumpe.
      Hinweis: Das HPLC-System jetzt abgeschaltet werden kann.

3. Nachweis von Phenolen Unter Verwendung von 4-Aminoantipyren und Kaliumferricyanid

1. Vorbereitung der mobilen Phase
   1. Vorbereitung 1 l eines 100 mM Ammoniumacetat-Lösung, um den pH der Lösung auf 9,0 mit 5 M Ammoniumhydroxid vor dem Verdünnen auf das Volumen eingestellt wird.
   2. Hinzufügen 52,6 ml Methanol zu dem Ammoniumacetatpuffer einer vorgemischten mobilen Phase von 95 zu erreichen: 5 (Puffer: Methanol).
2. Einrichten von HPLC - Instrument
   1. Bereiten Sie die HPLC-Instrument mit dem vorgemischten vorbereitete Puffer auf der Linie A als mobile Phase. Spülen Sie die Pumpe nach Hersteller; S Anforderungen.
   2. Stellen Sie die HPLC instrumentalen Komponenten und die beiden zusätzlichen Reagenzienpumpen , wie in 4B dargestellt.
   3. Bringen Sie ein Pulsationsdämpfer Spule an jedem der Reagenzienpumpen.
   4. Stellen Sie die UV-Vis-Detektor bei einer Wellenlänge von 500 nm zu analysieren.
3. Einrichten von HF - Säule
   1. Verbinden des Einlasses der RF-Säule mit dem HPLC-Instrument.
   2. Schließen Sie eine 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch zentralen Anschluss der HF-Säule zum Auslass.
   3. Schließen Sie einen Ausgang Peripherieanschluss des HF-Säule mit dem UV-Vis-Detektor mit einer 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch verwenden.
   4. Verbinden jedes Reagenz (dh 4-Aminoantipyren und Kaliumferricyanid) Pumpenleitung zu einem peripheren Anschluss am Auslass der RF - Säule.
   5. Bringen die Strömungsrate der HPLC - Pumpe auf 1 ml min ^-1 bei 100% -Linie A - 100 mM Ammoniumacetat - Puffer pH 9, vorgemischt mit 5% Methanol.
   6. Äquilibrieren der Säule wit der 100% -Linie Eine mobile Phase für 10 Minuten für eine 4,6 mm ID x 100 mm Länge Spalte. Diese Zeit kann je nach den Abmessungen der anderen Spalten skaliert der Benutzer verwenden kann.
4. Herstellung von 4-Aminoantipyren Reagenzes
   1. Vorbereiten eines Ammoniumacetat-Puffer mit einem pH-Wert von 9 durch Schritt 3.1.1 folgende.
   2. Wiegen 150 mg 4-Aminoantipyren und lösen sich in 100 ml der vorbereiteten Ammoniumacetat-Puffer (pH 9).
   3. Beschallen für 1 min.
   4. Mit Folie abdecken Lichteinwirkung zu verhindern.
   5. Spülen Sie die erste Reagenz Pumpe mit der hergestellten 4-Aminoantipyren Reagenz gemäß den Herstelleranforderungen.
5. Herstellung von Kaliumferricyanid Reagenzes
   1. Wiegen 150 mg Kaliumferricyanid und lösen sich in 100 ml Ammoniumacetatpuffer (pH 9), hergestellt gemäß Schritt 3.1.1.
   2. Beschallen für 1 min.
   3. Decken Sie in Folie Lichteinwirkung zu verhindern.
   4. Purge das zweite Reagenz Pumpe mit dem vorbereiteten Kaliumferricyanid Reagenz nach den Anforderungen des Herstellers.
6. Tuning von HF - Säule
   1. Exakt zwei saubere und trockene Gefäße wiegen. Beschriften Sie ein Gefäß als zentrale und die andere als peripher.
   2. Sammeln Sie die Abwasser den zentralen Anschluss in das Gefäß verlass für 1,0 min zentrale markiert.
   3. Wieder wiegen den Zentralbehälter und berechnen das Gewicht der Strömung von dem zentralen Port wie in Schritt 1.4.3 folgt.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 3.6.2 für das Abwasser zu 3.6.3 die UV-Vis-Austritt aus, die an die Peripherieschnitt der HF-Säule angebracht ist, und berechnen Gewicht für periphere wie in Schritt 1.4.4 folgt.
   5. Berechnen des Prozentsatzes der Strömung aus den zentralen und peripheren Ports kommen, wie in Schritt 1.4.5 folgt.
   6. Sicherstellen, dass die Segmentierung Verhältnis zwischen dem zentralen Strömungs und dem peripheren Strömungs 50:50 (Zentral: periphere). Wenn der zentrale Strömungs über 50% liegt, verringert sich dieStrömungsmenge durch Addieren einer Länge von 0,13 mm id Schlauch mit dem Auslass zentrale Öffnung austritt. Wenn der zentrale Strömung unter 50% liegt, verringern Sie die Länge von 0,13 mm Schlauch aus dem zentralen Anschluss.
   7. Wiederholen Sie Schritt 3.6.1 bis 3.6.6, bis ein Segmentierungsverhältnis von 50:50 (Zentral: periphere) erreicht wird.
   8. Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit des 4-Aminoantipyren Pumpe auf 0,5 ml min ^-1.
   9. Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit des Kaliumferricyanid Pumpe auf 0,25 ml min ^-1.
      Hinweis: Die HF-Spalte mit den Zweikomponenten-Reagenzien aufgebaut nun zur Analyse bereit ist. Proben können nun eingespritzt werden.
7. Beitrag laufen Abschaltbedingungen
   1. Sobald alle Proben der Lauf beendet injiziert wurden, was darauf hinweist, dass der Lauf beendet ist, beide der Reagenz Pumpen stoppen.
   2. Entfernen Sie die Reagenzienpumpleitungen von den peripheren Ports und ersetzen Sie sie mit einem 15 cm Stück 0,13-mm-Schlauch.
   3. Äquilibrieren der Säule mit der mobilen Phase in WHIch ist es , indem die mobile Phase gespeichert werden , durch die Säule zu passieren , auf 1 ml min ^-1 für 10 min.
   4. Stoppen Sie den Fluss der mobilen Phase Pumpe auf dem HPLC-Instrument.
   5. Ersetzen Sie beide die Reagenzien auf dem Reagenz Pumpen mit Methanol und spülen die zusätzlichen Pumpen gemäß Hersteller Anforderung.
      Hinweis: Das HPLC-System jetzt abgeschaltet werden kann.

Ergebnisse

Die erste PCD - Verfahren, die zur Verwendung von RF-PCD wurde die Derivatisierung von Antioxidantien mit der 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazil Radikal (DPPH) ^{• 24} angepasst. Diese Reaktion wurde durch Koleva et al vorgestellt. ²⁵ und seit weit verbreitet ist. Die Detektion beruht auf der Entfärbung des DPPH ^• Radikale in Gegenwart von reaktiven Sauerstoffspezies, damit die Anwesenheit von Antioxidationsmitteln führt zu einem Abfall in der beobachteten Extinktion. D...

Diskussion

RF-PCD ermöglicht die effiziente Durchmischung des Derivatisierungsreagens mit dem HPLC Abstrom säulennachgeordneten ohne die Verwendung von Reaktionsspulen, die Effekte der Bandverbreiterung zu minimieren und die Trennleistung verbessert. RF-PCD Methoden wurden auch Verbesserungen in der Signalantwort in Bezug auf Nachweisverfahren gezeigt. Camenzuli et al. ²⁸ war die erste die Verwendung von Reaktionsströmungsspalten mit DPPH ^• zum Nachweis von ROS in einer Espressokaffeeprobe zu me...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPLC instrument	Agilent	1290 Series HPLC
Additional Pump(s) for derivatization system	Shimadzu	LC-20A
RF colum			Non-commercial
PEEK tubing	Sigma Aldrich	Z227307
Column stoppers			Provided with column
PEEK tube cutter	Sigma Aldrich	Z290882
Analytical Scale Balance			4-point analytical balance
Stop watch			Non-Scientific equiptment
Eluent collection vials			Any Small vial with a flat bottom will do, e.g., HPLC vials
HPLC Vials			Will depend on instrument used
Vessels for mobile phase and derivatization solution(s)	Sigma Aldrich	Z232211
General Laboratory glassware			Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method.
Methanol	Sigma Aldrich	34860
DPPH	Sigma Aldrich	D9132
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	17836
Ammonia	Sigma Aldrich	320145	Corrosive
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Fluorescamine	Sigma Aldrich	F9015
4-aminoantipyrene	Acros Organics BVBA	AC103151000
Potassium ferricyanide	AnalaR	B10204-30