JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Özet

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

Giriş

Kolon sonrası türevlendirme (PCD) ile birleştirilen yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) analiz laboratuarda bir dizi konu çözümünde yararlı olan güçlü bir araçtır. Bu, 1,2 uygun dedektörler paketi ile başka bir tespit edilemeyen bileşikler tespit seçici saptanması ve nicelenmesi 3-5 alt sınırları sağlar veya hedef analitin sinyal geliştirmek için kullanılabilir önlemek için bir hedef analitin türetmek matriks etkileri 6. Yaygın olarak kullanılan PCD reaksiyonları 9,10 veya floreskamin 11,12, 2,2-difenil-ile reaktif oksijen türlerinin türetme (ROS) ninhidrin orto-phthaladehyde 7-9 olan amino asitler gibi aminlerin reaksiyonu içerir 1-picrylhydrazil kökü (DPPH) • 13,14 veya 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit (ABTS) 15,16 ve sülfür c türetmek için iyodid-azit belirteci kullanılmasıiçeren gruptur bileşikler 17,18.

HPLC sistemleri 6 PCD reaksiyonlarının kullanılması ile pek çok dezavantajları, ancak vardır. Prensip olarak, bu arasında karıştırılması ve reaksiyon, 8 oluşması için zaman tanımak türetme reajan (lar) ve dedektör, ilave alanına arasındaki reaksiyon, rulo kullanılmasıdır. Bu reaksiyon genellikle HPLC sistemi 19 geri kalan hacmi ile karşılaştırıldığında önemli 500 ul ya da daha fazla, hacimleri var döngüler. Bu yüksek hacim, reaksiyon bölgesinin kullanımı Reaksiyon bağın varlığı olmaksızın gözlenebilir etkilere kıyasla artırılmış tepe genişletilmesi sonuçları döngüler. Bu kantitatif ve algılama yüksek sınırları var kısa, daha geniş zirveleri ile sonuçlanır ve olumsuz kromatografik çözünürlüğü etkiler. 1 Rakamlar ve 2 farklı sonrası kolon reaksiyon döngü hacimlerinin yanı sıra kaynaklanan pik şeklinin bozulmasını vurgulayın. Bu analiz,bir cep 94% metanol faz bileşimi ve% 6 Milli-Q su ile yapıldı. Hareketli fazın akış oranı 1 ml / dak, enjeksiyon hacmi 20 ul ve analiz dalga boyu 265 nm idi. 20 ul 1.000 ul ölü hacimleri değişen Rulo sütun ve PCD yöntemleri reaksiyon döngü ölü hacim etkilerini simüle etmek için dedektör arasına yerleştirildi. Bu ilmekler, 0.5 mm iç çapa sahip, paslanmaz çelik boru hazırlandı. Deney, denetleyici (SCL-10AVP) 'den oluşan bir HPLC sistemi üzerinde gerçekleştirilmiştir, bir düşük basınç Gradyan Vana (FCL-10ALVP), bir pompa (LC-20AD), bir enjektör (SIL-10ADVP) ve PDA dedektör ( SPD-M10ADVP). Mobil faz önce HPLC sistemine sokulmadan bir faz giderme yoluyla pompalanmıştır. Ayırma 250 mm x 4.6 mm İD 5 um kolonu kullanılarak gerçekleştirildi. Deney koşulları en son literatürde yayınlanmıştır PCD reaksiyonlar tipik olarak seçilmiştir.

En basit, en yaygın sonrası kolon reaktör kurulum etkili bir sıvı akabilir ve reaksiyon gerçekleşebilir hangi aracılığıyla uzun, ince bir tüp olmayan bir parçalı boru şeklinde reaktör denir. Bu sistem, zirve genişleme sadece sisteme eklenen ölü hacim değil, aynı zamanda lijima ve arkadaşları. 8 tarafından belirtildiği gibi borunun iç çapına bağlıdır. Ayrıca, bobin geometrisi gözlenen marka genişlemesi bir rol oynar. Reaktörün sarma ölü hacim minimize edilebilir, yani daha iyi bir karıştırma sonucu, ikincil akış profilleri değiştirir Stewart 20 belirtti. 21 bobin örme açık boru şeklinde kullanırken pik genişlemesi önemli olmadığı ifade edilmiştir. Pik genişletilmesi aşırı büyük olduğunda, başka reaktör tipleri de 20,22 düşünülebilir. Bunlar yatak reaktörleri veya parçalı akış reaktörleri içerebilir. Bu reaktörler, ki bunlar aksi takdirde requir olur yavaş reaksiyonlar için özellikle yararlı olane'nin büyük tepki döngüler. olmayan parçalı boru şeklinde reaktörler PCD uygulamalarında kullanılan reaktörlerin en yaygın türleri, reaktör kurulum bu tür ile bu makalede fırsatlar geri kalanı gibi.

Reaksiyon akışı (RF) sütunun tasarımı mobil faz dış bulunan radyal merkez kolonun bölge veya üç limanlarında bulunan tek bir bağlantı noktası aracılığıyla ya sütunu çıkmak (veya girmek) için izin veren bir çok portlu sonu uydurma içermektedir sütunun duvar kısmı (bakınız Şekil 3). Bu iki akım deliklerden dışarı uzanan bir dış gözenekli cam malzeme ile çevrili da bir su geçirmez halka tarafından çevrelenen bir merkezi gözenekli cam malzeme ihtiva eden bir uç teçhizatı kullanılarak ayrılır. Santral geçirmeyen bir halka çapraz akışına iki gözenekli bölgeler arasında mümkün değildir.

Reaksiyon akış kromatografisi sırasında, türetme reaktif (ler) bir veya TW olarak mobil faz akış yönüne karşı pompalanırReaksiyon akış sütunun dış limanlarından o. Elüsyon maddesi serbest bir dış port üzerinden dış frit türetme reajan (lar) ile karıştırılmış ve dedektör geçirilir. Reaksiyon akımı ya tek reaktif türetme için kullanılabilir ya da ikili bir madde sistemi (türevlendirme reaktifleri 2 portu ve 1 bağlantı noktası (türetme reaktifin 1 bağlantı noktasına 1 bağlantı dedektörü ve 1 bağlantı bloke kolon eluent geçmek için) ) dedektöre sütun eluent geçmektedir. Merkezi akıştan akış ya da türetilmemiş Elüsyon maddesi etkin çoklayıcı algılama 23 ya da atık geçer tespit etmek için kullanılabilir.

RF-PCD kromatografisi çalışan santral ve periferik akımlarının oranı olduğunda kullanılabilir bir büyük ayar tekniği. Her bir türetme için en uygun oranı, merkezi akış tespit edilmesi veya atık geçilecek olmadığı gibi bir dizi faktöre bağlıdır. Bu nedenle, optimum oranı tespit edildikten sonra, Doğru akım oranı her çalışma gerçekleştirildiğini önce elde edilir sağlanmalıdır.

Bir cam hamuru kullanımı Elüsyon maddesi akışı ve tipik olarak sıfır ölü hacim T parçasını ya da düşük bir ölü hacmi kullanılması, geleneksel karıştırma teknikleri ile karşılaştırıldığında, daha etkili karıştırma RF-PCD sonuçlarında türetme reaktif karışımı olduğu bulunmuştur W- parça iki akışları karıştırmak için. Bu nispeten küçük Reaksiyon döngüleri kullanımı için izin verilen ya da tamamen reaksiyon, döngünün bile ortadan kaldırılması yer alır. Geleneksel sonrası sütun türevlendirme yöntemlerine göre daha keskin zirveleri reaksiyon döngü boyutu sonuçlarının azaltılması. Bu, tüm sütun elüsyon türetilmiş olmasına rağmen, gürültü oranı daha büyük bir sinyal gözlenir ve saptanması ve nicelenmesi dolayısıyla alt sınırları elde edilebilir olduğu anlamına gelir.

Reaksiyon akış kromatografisi PCD reaksiyon adaptasyonu ile zorlukların üstesinden gelmek için geliştirilmiştirnedeniyle büyük hacimli reaksiyon döngüler istihdam ihtiyacı nedeniyle büyük yazılan sütun ölü hacimleri modern HPLC kolon ve sistemleri, genişletilmesi bant kaynaklanan verimlilik özellikle kaybına s. Geleneksel PCD göre RF-PCD daha verimli karıştırma işlemleri daha az, reaksiyon döngüsü hacimleri gözlenen ayırma veriminde bir artışa yol kullanılabilir anlamına gelir. Ayrıca, RF-PCD kromatografisi her iki sinyal artan geleneksel PCD yöntemlerine göre saptanması ve nicelenmesi alt sınırları ile sonuçlanan klasik PCD tekniklere kıyasla gürültü azalması gösterir. Geleneksel PCD yöntemlerine göre RF PCD ilave bir avantajı, RF sütun merkez noktası olarak kolonun çevre bölgesinde elute olur türevlendirilmiş akımından ayrılır be türetilmemiş akışı izleme yeteneği. RF-PSD geleneksel PCD yöntemlerine göre birçok avantaj görüntüler nispeten yeni ama gelecek vaat eden bir tekniktir.

RF sütunun bağlantısı önemli bir fark, bir RF kolonu üzerinde son parçaları sayısı olmak geleneksel bir HPLC kolonu ile hemen hemen aynı şekilde elde edilir. HPLC sistemi standart bir HPLC kolonu bağlamak için kullanılan Bağlantı HPLC sistemine RF sütun bağlamak için kullanılabilir edebiliyoruz.

Protokol

Dikkat: (metanol, yani MSDS) kullanmadan önce tüm malzeme ve reaktifler için malzeme güvenlik veri sayfaları (MSDS) bakınız. çözücüler ve Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) yıkayıcı işlerken tüm uygun güvenlik uygulamalarının kullanımını sağlamak. HPLC, analitik terazi ve dedektör enstrümantasyon mühendislik kontrollerinin uygun kullanımını sağlamak ve kişisel koruyucu ekipman (koruyucu gözlük, eldiven, laboratuvar önlüğü, tam uzunlukta pantolon ve kapalı parmak ayakkabı) kullanımını sağlamak.

Not: Bu protokol, ilgi konusu bir kimyasal bileşiğin doğası özgü, farklı bir reaktif ile reaksiyonu akış kolon sonrası türevlendirme 3 yöntem (RF-PCD) teknikleri açıklanmaktadır. ROS analizi için "floreskamin kullanarak birincil aminler 2. Tespiti" bölümüne bakın birincil aminler analizi için, "ROS 1. Tespit DPPH • kullanarak" bölümüne gidin ve fenolik bileşiklerin analizi için bölüm "3 gidin . fenollerin algılama4-aminoantipiren ve potasyum ferrisiyanürünü "seçeneğini kullanarak. boyunca ultra saf su (örneğin, Milli-Q su) kullanınız.

Not: RF sütunun bağlantısı önemli bir fark, bir RF kolonu üzerinde son parçaları sayısı olmak geleneksel bir HPLC kolonu ile hemen hemen aynı şekilde elde edilir. HPLC sistemi standart bir HPLC kolonu bağlamak için kullanılan Bağlantı HPLC sistemine RF sütun bağlamak için kullanılabilir edebiliyoruz.

1. ROS Algılama DPPH • Kullanımı

  1. HPLC aletinin kurmak
    1. A hattı% 100 su ve mobil faz olarak, B hattı üzerindeki% 100 metanol ile HPLC aleti hazırlayın. üreticinin ihtiyaçlarına göre pompaları temizleyin.
    2. HPLC aracı bileşenleri ve Şekil 4A'da gösterildiği gibi, ek bir türetme pompa ayarlayın.
    3. 520 nm'lik bir dalga uzunluğunda analiz edilmesi, UV-Vis detektörü ayarlayın.
  2. Kadar ayarlayınRF sütunu
    1. HPLC aleti RF sütununun girişine bağlayın.
    2. RF sütunu merkezi çıkış limanına 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda bağlayın.
    3. 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda kullanılarak UV-Vis detektörü bir çıkış çevre portunu.
    4. RF sütunun çıkışına bir çevresel bağlantı noktasına DPPH • Pompa hattı bağlayın.
    5. Bir sütun tıpa kullanarak RF sütunun çıkışında kullanılmayan periferik bağlantı noktasını engelleyin.
    6. 1 mi dak HPLC pompası akış oranı getirmek -1% 100 hattı B -% 100 metanol.
    7. Bir 4.6 mm iç çap x 100 mm uzunluk sütun için 10 dakika boyunca% 100 metanol hareketli faz ile sütun dengelenmesi. Bu sefer kullanıcı istihdam diğer sütunların boyutlarına göre ölçeklenebilir olmalıdır.
  3. DPPH • ayıracın hazırlanması
    1. Metanol DPPH • bir 0.1 mg / ml çözelti hazırlayın.
    2. 10 dakika boyunca DPPH • reaktifı ihtiva eden şişenin sonikasyon.
    3. Işığa maruz kalmasını önlemek için folyo balon örtün.
    4. Üreticinin ihtiyaçlarına göre hazırlanan DPPH • reaktif ile DPPH • Pompayı temizleyin.
  4. RF kolon çıkışı Tuning
    1. Doğru iki temiz ve kuru damarları tartın. bir merkezi olarak gemi ve periferik gibi diğer etiketleyin.
    2. 1.0 dakika boyunca orta etiketli kabın içine orta noktasını çıkan atık toplamak.
    3. merkez liman gemi yeniden tartmak ve aşağıdaki gibi merkezi bağlantı noktasından akışının ağırlığı hesaplamak:
      Merkez Liman Gemi başlangıç ​​Ağırlık (g) - Merkez Port (g) Ağırlık Orta Liman Gemi (g) Nihai Ağırlık =
    4. Tekrarlayın UV-Vis RF sütunun çevresel bağlantı noktasına bağlı ve periferik liman gemisi olarak ağırlığını hesaplamak olduğunu çıkan atığın için 1.4.2 ve 1.4.3 adımlarıaşağıdaki gibidir:
      Periferik Liman Gemi başlangıç ​​Ağırlık (g) - Çevresel Port (g) Ağırlık Periferik Liman Gemi (g) Nihai Ağırlık =
    5. aşağıdaki şekilde, merkezi ve periferik bağlantı noktaları gelen akış yüzdesini hesaplayın:
      % Merkezi Port Central Port (g) = Ağırlık / (Merkez Limanı (g) + Çevresel Port (g) Ağırlık Ağırlık) x 100
      % Periferik Liman Periferik Port (g) = Ağırlık / (Merkez Limanı (g) + Çevresel Port (g) Ağırlık Ağırlık) x 100
    6. merkezi akış ve çevresel akış arasındaki segmentasyon oranını sağlamak 30:70 (: periferik santral) 'dir. orta akış% 30 üzerinde ise, merkezi bağlantı çıkışına 0.13 mm ID tüp uzunluğu eklenerek çıkan akış miktarını azaltır. merkezi akış% 30 altında ise merkez limanından 0,13 mm boru uzunluğunu azaltır.
    7. (: Periferik santral) elde edilir 30:70 bir segmentasyon oranı kadar adımı yineleyin 1.4.1 1.4.6 için.
    8. D akış hızını ayarlama0.5 ml dk -1 PPK • reaktif pompası.
      Not: DPPH • reaktif ile kurmak RF sütun artık analiz için hazırdır. Örnekler hemen enjekte edilebilir.
  5. Mesaj çalıştırmak kapatma koşulları
    1. Numunelerin tüm çalışma bittikten belirten enjekte edildikten sonra, türetme reaktif pompa akışını durdurun.
    2. Periferik bağlantı noktasından DPPH • reaktif pompa satırını kaldırın ve bağlantı noktası tıpalayın.
    3. Mobil faz 1 ml dk sütun üzerinden geçirmek için -1, 10 dakika için izin depolanacak olan mobil faz ile sütun dengelenmesi.
    4. HPLC cihazı üzerinde mobil faz pompanın akışını durdurun.
    5. Metanol ile DPPH • reaktifi değiştirin ve ilave pompa temizlemek.
      Not: HPLC sistemi şimdi kapanma olabilir.

Fluoresc kullanılarak primer aminlerin 2. Tespitamin

  1. Mobil faz hazırlanması
    1. hacme seyreltme öncesi 5 M amonyum hidroksit ile 9.0'a çözeltinin pH'ının ayarlanmasını, 10 mM amonyum asetat çözeltisi bir 1 L hazırlayın.
    2. 95:05 (: ACN tamponu) bir önceden karıştırılmış mobil faz elde etmek için amonyum asetat tampon asetonitril (ACN) ve 52.6 ml ilave edilir.
  2. HPLC aletinin kurmak
    1. mobil faz olarak A hattı üzerindeki önceden karıştırılmış hazırlanan tampon ile HPLC cihazı hazırlayın. üreticinin ihtiyaçlarına göre pompayı temizleyin.
    2. HPLC aracı bileşenleri ve Şekil 4A'da gösterildiği gibi, ek bir türetme pompa ayarlayın.
    3. türetme pompasına bir darbe dampener bobin takın.
    4. Ayar floresans dedektörü (FLD) 475 nm 390 nm ve emisyon dalga bir eksitasyon dalga boyu ile.
  3. RF sütunun kurmak
    1. th bağlayınHPLC aleti RF sütunun e girişi.
    2. RF sütunu merkezi çıkış limanına 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda bağlayın.
    3. 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda kullanılarak FLD detektöre RF sütunu bir çıkış çevre portunu.
    4. RF sütunun çıkışına bir çevresel bağlantı noktasına türetme pompa hattı bağlayın.
    5. Bir sütun tıpa kullanarak RF sütunun çıkışında kullanılmayan periferik bağlantı noktasını engelleyin.
    6. 1 mi dak HPLC pompası akış oranı getirmek -1% 100 hattı A -% 5 ACN ile önceden karıştırılmış, 10 mM amonyum asetat tampon pH 9.
    7. Bir 4.6 mm iç çap x 100 mm uzunluk sütun için 10 dakika boyunca% 100 A hattı hareketli faz ile sütun dengelenmesi. Bu sefer kullanıcı istihdam diğer sütunların boyutlarına göre ölçeklendirilebilir.
  4. Floreskamin ayıracın hazırlanması
    1. Bir 0.1 mg mi -1 floreskamin reaktif 100 ml olun.
      2. <1 dakika boyunca li> sonikasyon.
    2. Işığa maruz kalmasını önlemek için folyo ile örtün.
    3. üreticinin ihtiyaçlarına göre hazırlanmış floreskamin reaktif ile reaktif pompasını temizleyin.
  5. RF kolon çıkışı Tuning
    1. Doğru iki temiz ve kuru damarları tartın. bir merkezi olarak gemi ve periferik gibi diğer etiketleyin.
    2. 1.0 dakika boyunca orta etiketli kabın içine orta noktasını çıkan atık toplamak.
    3. Merkezi damar yeniden tartın ve aşama 1.4.3 şu şekilde merkez limanından akış ağırlığı hesaplamak.
    4. Tekrarlayın RF sütunun çevresel bağlantı noktasına bağlı ve adım 1.4.4 şu şekilde periferik için ağırlığı hesaplamak olduğunu FLD çıkan atığın için 2.5.3 için 2.5.2 adımları.
    5. Adım 1.4.5 şu şekilde santral ve periferik limanlarından gelen akış yüzdesini hesaplayın.
    6. merkezi akış ve periferik arasındaki segmentasyon oranını sağlamakAkış 43:57 (: periferik santral) 'dir. orta akış% 43 üzerinde ise, merkezi bağlantı çıkışına 0.13 mm ID tüp uzunluğu eklenerek çıkan akış miktarını azaltır. orta akış% 43 altında ise, merkezi bağlantı noktasından 0,13 mm boru uzunluğunu azaltır.
    7. (: Periferik santral) elde edilir 43:57 bir segmentasyon oranı kadar adımı yineleyin 2.5.1 2.5.6 için.
    8. 0.7 mi dakika mobil faz pompa akış hızını ayarlama -1.
    9. 0.1 ml dk akış türetme pompa ayarlama -1.
      Not: floreskamin reaktif ile kurmak RF sütun artık analiz için hazırdır. Örnekler hemen enjekte edilebilir.
  6. Mesaj çalıştırmak kapatma koşulları
    1. Numunelerin tüm çalışma bittikten belirten enjekte edildikten sonra, türetme pompayı durdurun.
    2. Periferik liman ve stoper gelen türetme pompa hattını sökün.
    3. mobil fazda ile kolon dengeyebu da mobil faz 1 ml dk sütun üzerinden geçirmek için -1, 10 dakika boyunca izin vererek saklanacaksa.
    4. mobil faz pompanın akışını durdurun.
    5. asetonitril ile floreskamin reaktifi değiştirin ve türetme pompasını temizlemek.
      Not: HPLC sistemi şimdi kapanma olabilir.

4-aminoantipiren ve potasyum ferrisiyanür kullanılması Fenollerin 3. Algılama

  1. Mobil faz hazırlanması
    1. hacme seyreltme öncesi 5 M amonyum hidroksit ile 9.0'a çözeltinin pH'ının ayarlanmasını, 100 mM bir amonyum asetat çözeltisi bir 1 L hazırlayın.
    2. (: Metanol tamponu) 5: 95 bir önceden karıştırılmış mobil faz elde etmek için amonyum asetat tampon metanol 52.6 ml ekleyin.
  2. HPLC aletinin kurmak
    1. mobil faz olarak A hattı üzerindeki önceden karıştırılmış hazırlanan tampon ile HPLC cihazı hazırlayın. üretici başına kadar pompayı Temizle '; S gereksinimleri.
    2. HPLC aracı bileşenleri ve Şekil 4B'de gösterildiği gibi iki ilave belirteci pompaları ayarlayın.
    3. reaktif pompalarının her birine bir darbe dampener bobin takın.
    4. 500 nm'lik bir dalga uzunluğunda analiz edilmesi, UV-Vis detektörü ayarlayın.
  3. RF sütunun kurmak
    1. HPLC aleti RF sütununun girişine bağlayın.
    2. RF sütunu merkezi çıkış limanına 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda bağlayın.
    3. 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda kullanılarak UV-Vis detektörü RF sütunu bir çıkış çevre portunu.
    4. Her reaktifi (yani, 4-aminoantipiren ve potasyum ferrisiyanürle) RF sütunun çıkışına bir çevresel bağlantı noktasına pompa hattı bağlayın.
    5. 1 mi dak HPLC pompası akış oranı getirmek -1% 100 hattı A -% 5 metanol ile önceden 100 mM amonyum asetat tampon pH 9.
    6. w sütunu dengeyeBir 4.6 mm iç çap x 100 mm uzunluk sütun için 10 dakika boyunca% 100 A hattı mobil faz i. Bu sefer kullanıcı istihdam diğer sütunların boyutlarına göre ölçeklendirilebilir.
  4. 4-aminoantipiren ayıracın hazırlanması
    1. adım 3.1.1 izleyerek 9 bir pH değerine sahip bir amonyum asetat tamponu hazırlayın.
    2. 150 mg kadar 4-aminoantipiren tartılır ve hazırlanan amonyum asetat tamponu (pH 9), 100 ml içinde çözülür.
    3. 1 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır.
    4. Işığa maruz kalmasını önlemek için folyo ile örtün.
    5. üreticinin ihtiyaçlarına göre hazırlanmış 4-aminoantipiren reaktif ile ilk reaktif pompasını temizleyin.
  5. Potasyum ferrisiyanür ayıracın hazırlanması
    1. potasyum ferrisiyanür 150 mg ağırlığında ve adım 3.1.1 göre hazırlanan amonyum asetat tamponu, 100 ml (pH 9) içinde çözülür.
    2. 1 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır.
    3. Işığa maruz kalmasını önlemek için folyo örtün.
    4. Purgüreticinin ihtiyaçlarına göre hazırlanmış potasyum ferrisiyanür reaktif ile e ikinci reaktif pompası.
  6. RF sütunun Tuning
    1. Doğru iki temiz ve kuru damarları tartın. bir merkezi olarak gemi ve periferik gibi diğer etiketleyin.
    2. 1.0 dakika boyunca orta etiketli kabın içine orta noktasını çıkan atık toplamak.
    3. Merkezi damar yeniden tartın ve aşama 1.4.3 şu şekilde merkez limanından akış ağırlığı hesaplamak.
    4. Tekrarlayın UV-Vis RF sütunun çevresel bağlantı noktasına bağlı ve adım 1.4.4 şu şekilde periferik için ağırlığı hesaplamak olduğunu çıkan atığın için 3.6.3 için 3.6.2 adımları.
    5. Adım 1.4.5 şu şekilde santral ve periferik limanlarından gelen akış yüzdesini hesaplayın.
    6. merkezi akış ve çevresel akış arasındaki segmentasyon oranını sağlamak 50:50 (: periferik santral) 'dir. orta akış% 50 üzerinde ise, azaltmakçıkış, merkezi noktasına 0.13 mm ID tüp uzunluğu eklenerek çıkan akış miktarı. orta akış% 50 altında ise, merkezi bağlantı noktasından 0,13 mm boru uzunluğunu azaltır.
    7. (: Periferik santral) elde edilir 50:50 bir segmentasyon oranı kadar adımı yineleyin 3.6.1 3.6.6 için.
    8. 0.5 mi dakika 4-aminoantipiren pompa akış hızını ayarlama -1.
    9. 0.25 mi dk potasyum ferrisiyanür pompa akış hızını ayarlama -1.
      Not: İki bileşenli reaktif kurmak RF sütun artık analiz için hazırdır. Örnekler hemen enjekte edilebilir.
  7. Mesaj çalıştırmak kapatma koşulları
    1. Numunelerin tüm çalışma bittikten belirten bittikten çalışma enjekte edildikten sonra, reaktif pompaları hem dur.
    2. Periferik limanlarından reaktif pompa satırları kaldırın ve 0,13 mm boru 15 cm parça ile değiştirin.
    3. WHI mobil faz ile sütun dengeyeCH mobil faz 1 ml dk sütun üzerinden geçirmek için -1, 10 dakika boyunca izin vererek saklanacaksa.
    4. HPLC cihazı üzerinde mobil faz pompanın akışını durdurun.
    5. Değiştir hem ayıraç reaktifler metanol ile pompa ve üretici şartının gibi ek pompaları temizlemek.
      Not: HPLC sistemi şimdi kapanma olabilir.

Sonuçlar

RF-PSD tarafından kullanılmak üzere uyarlanmıştır ilk PCD yöntemi 2,2-difenil-1-picrylhydrazil kökü (DPPH) • 24 ile antioksidanların türetilmesi olmuştur. Bu reaksiyon. Koleva ve ark 25 tanıtıldı ve yaygın beri kullanılmaktadır. Algılama, reaktif oksijen türlerinin varlığında, radikal DPPH • renksizleşme, gözlenen absorbans bir damla antioksidanlar sonuçlar dolayısıyla varlığına dayanır. DPPH • Reaksiyon genell...

Tartışmalar

RF-PCD bant genişletilmesi etkilerinin en aza indirilmesi ve ayırma performansını artırmak, reaksiyon bobinler kullanılmadan HPLC atık sonrası sütun ile türetme reaktif verimli karıştırma sağlar. RF-PCD yöntemler de tespit yöntemi ile ilgili olarak, sinyal yanıt olarak iyileşme göstermiştir. Camenzuli ve ark., 28 espresso kahve numunesinde ROS tespiti için DPPH • reaksiyon akış sütun kullandığını rapor için ilk oldu. Yaptıkları çalışmada çeşitli DPPH <...

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
HPLC instrumentAgilent1290 Series HPLC
Additional Pump(s) for derivatization systemShimadzuLC-20A
RF columNon-commercial
PEEK tubingSigma AldrichZ227307
Column stoppersProvided with column
PEEK tube cutterSigma AldrichZ290882
Analytical Scale Balance4-point analytical balance
Stop watchNon-Scientific equiptment
Eluent collection vialsAny Small vial with a flat bottom will do, e.g., HPLC vials
HPLC VialsWill depend on instrument used
Vessels for mobile phase and derivatization solution(s)Sigma AldrichZ232211
General Laboratory glasswareVolumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method.
MethanolSigma Aldrich34860
DPPHSigma AldrichD9132
Ammonium AcetateSigma Aldrich17836
AmmoniaSigma Aldrich320145Corrosive
AcetonitrileSigma Aldrich34998
FluorescamineSigma AldrichF9015
4-aminoantipyrene Acros Organics BVBAAC103151000
Potassium ferricyanide AnalaRB10204-30

Referanslar

  1. Srijaranai, S., et al. Use of 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol as the post column reagent for ion exchange chromatography of heavy metals in environmental samples. Microchem. J. 99, 152-158 (2011).
  2. Kubickova, A., Kubicek, V., Coufal, P. UV-VIS detection of amino acids in liquid chromatography: online post-column solid-state derivatization with Cu(II) ions. J Sep Sci. 34, 3131-3135 (2011).
  3. Quinto, M., Spadaccino, G., Palermo, C., Centonze, D. Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection. J. Chromatogr. A. 1216, 8636-8641 (2009).
  4. Lee, M., Lee, Y., Soltermann, F., von Gunten, U. Analysis of N-nitrosamines and other nitro(so) compounds in water by high-performance liquid chromatography with post-column UV photolysis/Griess reaction. Water Res. 47, 4893-4903 (2013).
  5. Niu, Y., et al. Identification of isoflavonoids in Radix Puerariae for quality control using on-line high performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray ionization-mass spectrometry coupled with post-column derivatization. Food Res Int. 48, 528-537 (2012).
  6. Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. Liquid chromatography coupled to on-line post column derivatization for the determination of organic compounds: a review on instrumentation and chemistries. Anal. Chim. Acta. 798, 1-24 (2013).
  7. Dousa, M., Brichac, J., Gibala, P., Lehnert, P. Rapid hydrophilic interaction chromatography determination of lysine in pharmaceutical preparations with fluorescence detection after postcolumn derivatization with o-phtaldialdehyde. J Pharm Biomed Anal. 54, 972-978 (2011).
  8. Iijima, S., et al. Optimization of an Online Post-Column Derivatization System for Ultra High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) and Its Applications to Analysis of Biogenic Amines. Anal Sci. 29, 539-545 (2013).
  9. Cunico, R. L., Schlabach, T. Comparison of Ninhydrin and o-Phthalaldehyde Postcolumn Detection Techniques for High Performance Liquid Chromatography of Free Amino. J. Chromatogr. A. 1983, 461-470 (1983).
  10. Donahue, E. P., Brown, L. L., Flakoll, P. J., Abumrad, N. N. Rapid Measurement of Leucine-specific Activity in Biological Fluids by Ion-exchange Chromatography and Post-column Ninhydrin Detection. J. Chromatogr. A. 571, 29-36 (1998).
  11. Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: A Reagent for Assay of Amino Acids, Peptides, Proteins and Primary Amines in the Picomole Range. Science. 1972, 871-872 (1972).
  12. Samejima, K. Separation of Fluorescamine Derivitices of Aliphatic Diamines and Polyamines by High Speed Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 96, 250-254 (1974).
  13. Zhang, Y., et al. Evaluation of antioxidant activity of ten compounds in different tea samples by means of an on-line HPLC-DPPH assay. Food Res Int. 53, 847-856 (2013).
  14. Niu, Y., et al. Identification of the anti-oxidants in Flos Chrysanthemi by HPLC-DAD-ESI/MS(n) and HPLC coupled with a post-column derivatisation system. Phytochem Anal. 24, 59-68 (2013).
  15. Raudonis, R., Bumblauskiene, L., Jakstas, V., Pukalskas, A., Janulis, V. Optimization and validation of post-column assay for screening of radical scavengers in herbal raw materials and herbal preparations. J. Chromatogr. A. 1217, 7690-7698 (2010).
  16. Raudonis, R., Raudone, L., Jakstas, V., Janulis, V. Comparative evaluation of post-column free radical scavenging and ferric reducing antioxidant power assays for screening of antioxidants in strawberries. J. Chromatogr. A. 1233, 8-15 (2012).
  17. Zakrzewski, R. Determination of Methimazole in Pharmaceutical Preparations using an HPLC Method Coupled with an Iodine-Azide Post-Column Reaction. J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 32, 383-398 (2008).
  18. Zakrzewski, R. Development and validation of a reversed-phase HPLC method with post-column iodine-azide reaction for the determination of thioguanine. J. Anal. Chem. 64, 1235-1241 (2009).
  19. Gritti, F., Guiochon, G. Accurate measurements of the true column efficiency and of the instrument band broadening contributions in the presence of a chromatographic column. J. Chromatogr. A. 1327, 49-56 (2014).
  20. Stewart, J. T. Post cotumn derivatization methodology in high performance liquid chromatography (HPLC). Trends Anal. Chem. 1, 170-174 (1982).
  21. Rigas, P. G. Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography. Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).
  22. Frei, R. W. Reaction Detectors in Modern Liquid Chromatography. Chromatographia. 15, 161-166 (1982).
  23. Pravadil-Cekic, S., et al. Using Reaction Flow Chromatography for the Analysis of Amino Acid: Derivatisation With Fluorescamine Reagent. Microchem. J. , (2015).
  24. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).
  25. Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures. Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).
  26. Selim, M., et al. A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography. Microchem. J. 116, 87-91 (2014).
  27. Bigley, F. P., Grob, R. L. Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).
  28. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products. J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

KimyaSay 110Y ksek Performansl S v KromatografiMesaj S tun derivatizasyonReaksiyon Ak KromatografiS tun TeknolojisiAntioksidanlarDPPHFenollerAmino Asitlerfloreskamin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır