JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Аннотация

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

Введение

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) в сочетании с пост колонку дериватизации (PCD) является мощным инструментом, который полезен при решении ряда вопросов, в аналитической лаборатории. Он может быть использован для обнаружения соединений, которые в противном случае невозможно обнаружить с набором детекторов , доступных 1,2, увеличивают сигнал целевого аналита, что позволяет более низкие пределы обнаружения и количественного 3-5 или селективно дериватизации мишень аналит, чтобы избежать матричные эффекты 6. Обычно используемые реакции PCD включают реакцию аминов, таких как аминокислоты, с орто-phthaladehyde 7-9, нингидрином 9,10 или флуорескамином 11,12, дериватизации активных форм кислорода (ROS) с 2,2-дифенил- 1-picrylhydrazil радикал (ДФПГ •) 13,14 или 2,2'-Азино-бис (3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты (БЕСТ) 15,16, а также использование реагента йодо-азида до дериватизации серы грontaining соединения 17,18.

Есть, однако, многочисленные недостатки использования реакций PCD с помощью ВЭЖХ систем 6. Главным из них является использование катушек реакции между точкой добавления дериватизации реагента (ов) и детектора, которые позволяют время для смешивания и реакция протекала 8. Эти реакции петли часто имеют объем 500 мкл или более, что является значительным по сравнению с объемом остальной части системы ВЭЖХ 19. Использование этих реакций в больших объемах петли приводит к увеличению уширению пиков по сравнению с тем, что наблюдалось бы без присутствия реакционного контура. Это приводит к более короткие и более широких пиков , которые имеют более высокие пределы количественному и обнаружения и оказывает отрицательное воздействие на хроматографическое разрешение. На рисунках 1 и 2 подчеркивают ухудшение формы пика , которые являются результатом добавления различных объемов реакционного контура послеколоночной. Этот анализпроводили с помощью подвижной фазы состава 94% метанола и 6% Milli-Q воды. Скорость потока подвижной фазы была 1 мл / мин, объем впрыскивани 20 мкл, а длина волны анализ был 265 нм. Катушки различной мертвых объемов от 20 мкл до 1000 мкл были вставлены между колонной и детектором для имитации влияния реакционного контура мертвого объема в методах ПКА. Эти петли были изготовлены из трубки из нержавеющей стали с внутренним диаметром 0,5 мм. Эксперимент проводили на системе ВЭЖХ, состоящей из контроллера (SCL-10AVP), низкий градиент давления клапан (ГКЛ-10ALVP), насос (LC-20AD), инжектором (СИЛ-10ADVP), и детектор (PDA СПД-M10ADVP). Подвижная фаза прокачивали через дегазатор до введения в систему ВЭЖХ. Разделение проводили с использованием 250 мм х 4,6 мм внутренний диаметр 5 мкм колонку. Экспериментальные условия были выбраны характерные для реакций PCD, которые недавно были опубликованы в литературе.

простой, самый распространенный пост установки колонного реактора, называется несегментированных трубчатый реактор, который эффективно длинная, тонкая трубка, через которую жидкость может протекать и реакци может иметь место. В этой системе уширению пиков зависит от не только мертвого объема добавленной к системе, но и от внутреннего диаметра трубы , как подчеркнуто Иджимы и др. 8. Кроме того, геометрия катушки играет определенную роль в наблюдаемом расширении бренда. Стюарт 20 указано , что смотки реактора изменяет профили вторичный поток, что приводит к лучшему перемешиванию, а это означает , что мертвый объем может быть сведено к минимуму. Было заявлено , что пик расширение не имеет существенного значения при использовании открытого трубчатого трикотажного катушки 21. Когда пик уширения чрезмерно велика, и другие типы реакторов , могут быть также рассмотрены 20,22. Они могут включать реакторы или реакторы слоем сегментированных потока. Эти реакторы особенно полезны для медленных реакций, которые в противном случае были бы RequirE большая реакция петли. Как несегментированных трубчатые реакторы являются наиболее распространенными типами реакторов, используемых в приложениях, PCD, остальная часть этой статьи имеет дело с этим типом установки реактора.

Конструкция реакционной колонны потока (RF) включает в себя концевой заделки многопортовую, который позволяет подвижной фазы для выхода (или ввести) колонну через один порт, расположенный в радиальном центральной части колонны или три отверстия, расположенные на наружном стена область колонны (смотри рисунок 3). Эти два потока разделены с помощью концевой заделки, содержащий центральную пористую фритту, окруженного непроницаемым кольцом, которое, в свою очередь, окруженный наружной пористой фритты, которая простирается наружу к стенке колонны. Благодаря центральному непроницаемой поперечному кольцо потока не представляется возможным между двумя пористыми областей.

Во время потока хроматографии реакции, дериватизации реагент (ы) закачивают против направления подвижной фазы потока в одну или ТВтO внешних портов реакционной колонны потока. Колонку элюент смешивают с дериватизации реагента (ов) во внешнем фритты и передается к детектору через свободный наружный порт. Поток реакции может быть использован для либо дериватизации одиночный реагент (1 порт для реагента дериватизации, 1 порт для передачи столбца в качестве элюента до детектора и 1 порт заблокирован) или двойной системой реагента (2 порта для дериватизации реагентов и 1 порт для проходят колонны в качестве элюента до детектора). Поток из центрального потока может быть либо использованы для обнаружения непроизводного элюент колонку, фактически мультиплексирование обнаружения 23, или передается в отходы.

Одной из основных метод настройки, который доступен при работе РЧ-PCD хроматографии является отношением центральных и периферийных потоков. Оптимальное соотношение для каждого дериватизации зависит от целого ряда факторов, таких как, будут ли обнаружены или переданы в отходы центральный поток. Поэтому, как только оптимальное соотношение было определено, Следует обеспечить, чтобы отношение правильно потока достигается перед каждый прогон выполняется.

Было обнаружено, что использование фритт для смешивания потока колонки элюента и дериватизации реагента в результатах РЧ-PCD в более эффективное перемешивание по сравнению с традиционными методами смешивания, которые обычно используют нулевой мертвый объем тройника или низкий мертвый объем W- кусок, чтобы смешать два потока. Это позволило за использование относительно небольших петель реакции, или даже устранение реакционного контура в целом. Снижение результатов размеров петли реакции в более резких пиков по сравнению с традиционными методами дериватизации пост столбцов. Это означает, что, несмотря на то, что не все из элюента колонки дериватизируется, больше сигнал-шум наблюдаются и поэтому нижние пределы детекции и количественного определения может быть достигнуто.

Поток реакции хроматографии была разработана для преодоления трудностей с адаптацией реакции PCDс современным колонн и систем ВЭЖХ, в частности, потери эффективности, вызванной полосы уширения из-за больших послеколоночной мертвых объемов, вызванных необходимостью использования большого объема реакция петли. Более эффективные процессы смешения в RF-PCD по сравнению с обычными PCD означает, что объемы цикла меньше реакции могут быть использованы что приводит к увеличению наблюдаемой эффективности разделения. Кроме того РЧ-ПКА хроматографии показывает, как увеличение сигнала и снижение шума по сравнению с обычными методами PCD что приводит к снижению предела обнаружения и количественного определения по сравнению с традиционными методами ПКА. Дополнительным преимуществом RF-PCD по сравнению с обычными методами PCD является способность контролировать непроизводного поток, который элюирует из центрального порта колонны РФ, а также дериватизированным поток, который элюируется из периферийной области колонны. RF-PCD является относительно новым, но перспективный метод, который отображает много преимуществ по сравнению с традиционными методами PCD.

Подключение колонки RF достигается практически так же, как в обычной ВЭЖХ колонке с основным отличием, число концевых соединительных элементов на колонке РФ. Фитинги, используемые для подключения стандартной колонки ВЭЖХ в ВЭЖХ-системы могут быть использованы для подключения ВЧ-колонки в систему ВЭЖХ.

протокол

Внимание: Пожалуйста , обратитесь к паспорте безопасности (MSDS) для всех материалов и реагентов перед использованием (т.е. паспорт безопасности для метанола). Обеспечивать использование всех соответствующих правил безопасности при работе с растворителями и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) элюент. Обеспечить надлежащее использование технических средств контроля ВЭЖХ, аналитического баланса и детектора измерительных приборов, а также обеспечить использование средств индивидуальной защиты (защитные очки, перчатки, лабораторный халат, полные штаны длины, и закрытую обувь).

Примечание: Этот протокол описывает 3 способа реакции потока дериватизации после колонки методы (RF-PCD), каждый с другим реагентом с учетом особого характера химического соединения, представляющего интерес. Для анализа ROS перейдите к разделу "1. Обнаружение АФК использованием ДФПГ •" для анализа первичных аминов смотри раздел "2. Обнаружение первичных аминов с использованием флуорескамином", так и для анализа фенольных соединений перейдите в раздел "3 . Обнаружение феноловс использованием 4-aminoantipyrene и феррицианида калия ". С помощью ультра-чистой воды (например, Milli-Q воды) во всем.

Примечание: Подключение колонки RF достигается практически так же, как в обычной ВЭЖХ колонке с основным отличием, число концевых соединительных элементов на колонке РФ. Фитинги, используемые для подключения стандартной колонки ВЭЖХ в ВЭЖХ-системы могут быть использованы для подключения ВЧ-колонки в систему ВЭЖХ.

1. Обнаружение ROS Использование ДФПГ •

  1. Настройка ВЭЖХ инструмента
    1. Подготовка ВЭЖХ-прибор со 100% воды на линии А и 100% метанола на линии В качестве подвижной фазы. Чистки насосов в соответствии с требованиями производителя.
    2. Настройка ВЭЖХ инструментальных компонентов и дополнительного дериватизации насоса , как показано на рисунке 4A.
    3. Установите UV-VIS детектор для анализа на длине волны 520 нм.
  2. Набор изколонка РФ
    1. Подключение входе колонки РФ к инструменту ВЭЖХ.
    2. Подключите длину 15 см трубы 0,13 мм идентификатора к выходному порту центрального столба РФ.
    3. Подключите выходной периферийный порт к UV-VIS детектора с использованием длиной 15 см трубки 0,13 мм идентификатора.
    4. Подключите ДФПГ • линии насоса к периферийному порту на выходе из колонки РФ.
    5. Неиспользованное периферийный порт на выходе из колонки ВЧ с использованием колонки стопора.
    6. Доведите скорость потока ВЭЖХ насоса до 1 мл мин - 1 при 100% линии В - 100% -ном растворе метанола.
    7. Равновесие колонку с 100% -ным раствором метанола подвижной фазы в течение 10 мин для 4,6 мм внутр х 100 колонке длиной мм. На этот раз должно быть соизмеримо в соответствии с размерами других столбцов пользователь может прибегнуть.
  3. Приготовление ДФПГ • реагента
    1. Приготовьте 0,1 мг / мл раствора ДФПГ • в метаноле.
    2. Разрушать ультразвуком колбу , содержащую ДФПГ • реагента в течение 10 мин.
    3. Накройте колбу в фольгу, чтобы не допустить воздействия света.
    4. Выпустите ДФПГ • насос с подготовленной ДФПГ • реагента в соответствии с требованиями завода - изготовителя.
  4. Тюнинг выход колонки RF
    1. Тщательно отвесить две чистые и сухие сосуды. Добавьте одно судно в качестве центрального, а другой, как периферийное устройство.
    2. Сбор выходящего потока, выходящего из центрального порта в сосуд с надписью центральный в течение 1,0 мин.
    3. Повторное взвешивание центрального порта судна и вычислить вес потока от центрального порта следующим образом:
      Вес центрального порта (G) = Конечный вес Центральный Порт сосуда (г) - начальный вес Центральный Порт сосуда (г)
    4. Повторите шаги 1.4.2 и 1.4.3 для выходящего потока, покидающего UV-VIS, который прикреплен к периферийному порту колонны РФ и вычислите вес для периферийного порта судна в качествеследующим образом:
      Масса периферийного порта (G) = Конечный вес периферийного порта судна (г) - начальный вес периферийного порта сосуда (г)
    5. Рассчитывают процент потока поступающей из центральных и периферийных портов следующим образом:
      % Центральный порт = Вес центрального порта (г) / (Вес центрального порта (г) + Вес периферийного порта (г)) х 100
      % Периферийный порт = Вес периферийного порта (г) / (Вес центрального порта (г) + Вес периферийного порта (г)) х 100
    6. Убедитесь, что соотношение сегментации между центральным потоком и периферийного потока 30:70 (центральная: периферические). Если центральный поток превышает 30%, уменьшить количество потока, выходящего путем добавления трубки определенной длины идентификатора 0,13 мм до выхода из центрального порта. Если центральный поток ниже 30% уменьшить длину 0,13 мм трубки из центрального порта.
    7. Повторите шаг 1.4.1 до 1.4.6, пока коэффициент сегментации 30:70 (центральный: периферическая) не будет достигнута.
    8. Установите скорость потока DПРК • Насос реагент 0,5 мл мин -1.
      Примечание: В столбце РФ устанавливается с ДФПГ • реактив теперь готов к анализу. Образцы в настоящее время могут быть введены.
  5. Сообщение выполнения условия завершения работы
    1. После того, как все образцы были введены, указывая, что прогон закончится, остановить поток реагента дериватизации насоса.
    2. Удалите ДФПГ • реактив линии насоса от периферийного порта и закупорить порт.
    3. Уравновешивают колонку с подвижной фазой , в котором он должен быть сохранен, позволяя подвижной фазы через колонку со скоростью 1 мл мин -1 в течение 10 мин.
    4. Остановить поток подвижной фазы насоса на приборе ВЭЖХ.
    5. Заменить ДФПГ • реагента с метанолом и продуть дополнительный насос.
      Примечание: Система ВЭЖХ теперь может быть выключена.

2. Обнаружение первичных аминов с использованием Fluorescамин

  1. Приготовление подвижной фазы
    1. Готовят 1 л 10 раствора ацетата аммония мМ, доводят рН раствора до 9,0 с помощью 5 М раствор гидроксида аммония до разбавления до объема.
    2. Добавить в 52,6 мл ацетонитрила (ACN) в буфер ацетата аммония, чтобы достичь предварительно смешанный качестве подвижной фазы (95:05 буфер: ACN).
  2. Настройка ВЭЖХ инструмента
    1. Подготовить ВЭЖХ прибор с предварительно перемешанной подготовленного буфера на линии А в качестве подвижной фазы. Промойте насос в соответствии с требованиями производителя.
    2. Настройка ВЭЖХ инструментальных компонентов и дополнительного дериватизации насоса , как показано на рисунке 4A.
    3. Приложить импульс демпфера катушку к дериватизации насоса.
    4. Настройка детектора флуоресценции (FLD) с длиной волны возбуждения 390 нм и эмиссионной длине волны 475 нм.
  3. Настройка столбца РФ
    1. Подключение-йе на входе ВЧ колонки в прибор для ВЭЖХ.
    2. Подключите длину 15 см трубы 0,13 мм идентификатора к выходному порту центрального столба РФ.
    3. Подключите выходной периферийный порт столба РФ к детектору ДПД, используя длину 15 см трубы 0,13 мм идентификатора.
    4. Подключение линии дериватизации насоса к периферийному порту на выходе из колонки РФ.
    5. Неиспользованное периферийный порт на выходе из колонки ВЧ с использованием колонки стопора.
    6. Доведите скорость потока ВЭЖХ насоса до 1 мл мин - 1 при 100% линии А - 10 мМ аммоний ацетатный буфер с рН 9, предварительно смешивают с 5% ACN.
    7. Равновесие столбец с 100% линии А подвижной фазы в течение 10 мин для 4,6 мм внутр х 100 колонке длиной мм. На этот раз, может быть расширена в соответствии с размерами других столбцов пользователь может прибегнуть.
  4. Приготовление флуорескамином реагента
    1. Сделать 100 мл мл -1 флуорескамин реагента 0,1 мг.
      2. <литий> Разрушать ультразвуком в течение 1 мин.
    2. Покрытие с фольгой для предотвращения воздействия света.
    3. Промойте насос реагента с подготовленной флуорескамином реагента в соответствии с требованиями завода-изготовителя.
  5. Тюнинг выход колонки RF
    1. Тщательно отвесить две чистые и сухие сосуды. Добавьте одно судно в качестве центрального, а другой, как периферийное устройство.
    2. Сбор выходящего потока, выходящего из центрального порта в сосуд с надписью центральный в течение 1,0 мин.
    3. Повторное взвешивание центрального сосуда и вычислить вес потока от центрального порта следующим образом на этапе 1.4.3.
    4. Повторите шаги 2.5.2 на 2.5.3 для выходящего потока, выходящего из ДПД, который прикреплен к периферийному порту колонны РФ и вычислите вес для периферического следующим образом на этапе 1.4.4.
    5. Рассчитывают процент потока поступающей из центральных и периферийных портов следующим образом на этапе 1.4.5.
    6. Убедитесь, что соотношение сегментации между центральным потоком и периферийнаяпоток 43:57 (центральный: периферические). Если центральный поток превышает 43%, уменьшить количество потока, выходящего путем добавления трубки определенной длины идентификатора 0,13 мм до выхода из центрального порта. Если центральный поток ниже 43%, уменьшить длину 0,13 мм трубки из центрального порта.
    7. Повторите шаг 2.5.1 для 2.5.6 до тех пор, соотношение сегментация 43:57 (центральный: периферическая) не будет достигнута.
    8. Установите скорость потока подвижной фазы насоса до 0,7 мл мин -1.
    9. Установите дериватизации насос течь в количестве 0,1 мл мин -1.
      Примечание: В столбце РФ устанавливается с флуорескамином реагента теперь готов к анализу. Образцы в настоящее время могут быть введены.
  6. Сообщение выполнения условия завершения работы
    1. После того, как все образцы были введены, указывая, что прогон закончится, остановить насос дериватизации.
    2. Удалите строку дериватизации насоса из периферийного порта и пробки.
    3. Равновесие колонку с подвижной фазой вкоторой она должна быть сохранена, позволяя подвижной фазы через колонку со скоростью 1 мл мин -1 в течение 10 мин.
    4. Остановить поток подвижной фазы насоса.
    5. Заменить флуорескамином реагента с ацетонитрилом и продуть дериватизации насос.
      Примечание: Система ВЭЖХ теперь может быть выключена.

3. Обнаружение фенолов с использованием 4-Aminoantipyrene и калия феррицианида

  1. Приготовление подвижной фазы
    1. Готовят 1 л 100 раствора ацетата аммония мМ, доводят рН раствора до 9,0 с помощью 5 М раствор гидроксида аммония до разбавления до объема.
    2. Добавить в 52,6 мл метанола в буфер ацетата аммония, чтобы достичь предварительно смешанный качестве подвижной фазы 95: 5 (буфер: метанол).
  2. Настройка ВЭЖХ инструмента
    1. Подготовить ВЭЖХ прибор с предварительно перемешанной подготовленного буфера на линии А в качестве подвижной фазы. Промойте насос в соответствии с производителем "; Ы требования.
    2. Настройка ВЭЖХ инструментальных компонентов и двух дополнительных насосов для реагентов , как показано на рисунке 4B.
    3. Приложить импульс Демпфер катушку для каждого из насосов для реагентов.
    4. Установите UV-VIS детектор для анализа на длине волны 500 нм.
  3. Настройка столбца РФ
    1. Подключение входе колонки РФ к инструменту ВЭЖХ.
    2. Подключите длину 15 см трубы 0,13 мм идентификатора к выходному порту центрального столба РФ.
    3. Подключите выходной периферийный порт колонки РФ к UV-VIS детектора с использованием длиной 15 см трубки 0,13 мм идентификатора.
    4. Подключение каждого реагента (т.е. 4-aminoantipyrene и феррицианида калия) линии насоса к периферийному порту на выходе из колонки РФ.
    5. Доведите скорость потока ВЭЖХ насоса до 1 мл мин - 1 при 100% линии А - 100 мМ аммоний ацетатный буфер с рН 9, предварительно смешивают с 5% -ным метанолом.
    6. Равновесие столбец шIth 100% линии А подвижной фазы в течение 10 мин для 4,6 мм внутр х 100 колонке длиной мм. На этот раз, может быть расширена в соответствии с размерами других столбцов пользователь может прибегнуть.
  4. Приготовление реагента 4-aminoantipyrene
    1. Готовят ацетатный буфер аммония с рН 9, выполнив пункт 3.1.1.
    2. Взвешивают 150 мг 4-aminoantipyrene и растворяют в 100 мл приготовленного буфера ацетата аммония (рН 9).
    3. Разрушать ультразвуком в течение 1 мин.
    4. Покрытие с фольгой для предотвращения воздействия света.
    5. Чистки первый насос реагента с подготовленным 4-aminoantipyrene реагента в соответствии с требованиями завода-изготовителя.
  5. Приготовление реагента феррицианида калия
    1. Взвешивают 150 мг калия и феррицианида растворяют в 100 мл буферного раствора ацетата аммония (рН 9), подготовленной в соответствии с шагом 3.1.1.
    2. Разрушать ультразвуком в течение 1 мин.
    3. Накройте фольгой для предотвращения воздействия света.
    4. Пурге второй реагент насос с подготовленным феррицианида калия реагентом в соответствии с требованиями завода-изготовителя.
  6. Настройка колонки РФ
    1. Тщательно отвесить две чистые и сухие сосуды. Добавьте одно судно в качестве центрального, а другой, как периферийное устройство.
    2. Сбор выходящего потока, выходящего из центрального порта в сосуд с надписью центральный в течение 1,0 мин.
    3. Повторное взвешивание центрального сосуда и вычислить вес потока от центрального порта следующим образом на этапе 1.4.3.
    4. Повторите шаги 3.6.2 3.6.3 для выходящего потока, покидающего UV-VIS, который прикреплен к периферийному порту колонны РФ и вычислите вес для периферического следующим образом на этапе 1.4.4.
    5. Рассчитывают процент потока поступающей из центральных и периферийных портов следующим образом на этапе 1.4.5.
    6. Убедитесь, что соотношение сегментации между центральным потоком и периферийного потока составляет 50:50 (центральный: периферические). Если центральный поток выше 50%, снижениеколичество потока, выходящего путем добавления трубки определенной длины идентификатора 0,13 мм к выпускному центрального порта. Если центральный поток ниже 50%, уменьшить длину 0,13 мм трубки из центрального порта.
    7. Повторите шаг 3.6.1 для 3.6.6 до тех пор, соотношение сегментация 50:50 (центральный: периферическая) не будет достигнута.
    8. Установите скорость потока 4-aminoantipyrene насоса до 0,5 мл мин -1.
    9. Установите скорость потока кровяной соли насоса до 0,25 мл мин -1.
      Примечание: В столбце РФ устанавливается с двухкомпонентных реагентов теперь готов для анализа. Образцы в настоящее время могут быть введены.
  7. Сообщение выполнения условия завершения работы
    1. После того, как все образцы были введены прогон закончил, указывая, что бег закончил, остановить обоих насосов для реагентов.
    2. Удалите линии реагента насоса из периферийных портов и заменить их на 15 см кусок 0,13 мм трубки.
    3. Равновесие колонку с подвижной фазой в WHIч она должна быть сохранена, позволяя подвижной фазы через колонку со скоростью 1 мл мин -1 в течение 10 мин.
    4. Остановить поток подвижной фазы насоса на приборе ВЭЖХ.
    5. Заменить и реагенты на реактива насосы с метанолом и продуть дополнительные насосы согласно требованию производителя.
      Примечание: Система ВЭЖХ теперь может быть выключена.

Результаты

Первый метод ПКА , который был адаптирован для использования RF-PCD был дериватизации антиоксидантов с использованием 2,2-дифенил-1-picrylhydrazil радикал (ДФПГ •) 24. Эта реакция была введена Koleva и др. 25 и широко используется с тех пор. Обнаружение опирается на обесцвечивания...

Обсуждение

РЧ-ПКА позволяет эффективное перемешивание дериватизации реагента со сточными водами после ВЭЖХ колонки без использования катушки реакции, сводя к минимуму эффекты уширения полос и повышение эффективности сепарации. методы РЧ-PCD также показали улучшение в ответ сигнала относительно...

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
HPLC instrumentAgilent1290 Series HPLC
Additional Pump(s) for derivatization systemShimadzuLC-20A
RF columNon-commercial
PEEK tubingSigma AldrichZ227307
Column stoppersProvided with column
PEEK tube cutterSigma AldrichZ290882
Analytical Scale Balance4-point analytical balance
Stop watchNon-Scientific equiptment
Eluent collection vialsAny Small vial with a flat bottom will do, e.g., HPLC vials
HPLC VialsWill depend on instrument used
Vessels for mobile phase and derivatization solution(s)Sigma AldrichZ232211
General Laboratory glasswareVolumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method.
MethanolSigma Aldrich34860
DPPHSigma AldrichD9132
Ammonium AcetateSigma Aldrich17836
AmmoniaSigma Aldrich320145Corrosive
AcetonitrileSigma Aldrich34998
FluorescamineSigma AldrichF9015
4-aminoantipyrene Acros Organics BVBAAC103151000
Potassium ferricyanide AnalaRB10204-30

Ссылки

  1. Srijaranai, S., et al. Use of 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol as the post column reagent for ion exchange chromatography of heavy metals in environmental samples. Microchem. J. 99, 152-158 (2011).
  2. Kubickova, A., Kubicek, V., Coufal, P. UV-VIS detection of amino acids in liquid chromatography: online post-column solid-state derivatization with Cu(II) ions. J Sep Sci. 34, 3131-3135 (2011).
  3. Quinto, M., Spadaccino, G., Palermo, C., Centonze, D. Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection. J. Chromatogr. A. 1216, 8636-8641 (2009).
  4. Lee, M., Lee, Y., Soltermann, F., von Gunten, U. Analysis of N-nitrosamines and other nitro(so) compounds in water by high-performance liquid chromatography with post-column UV photolysis/Griess reaction. Water Res. 47, 4893-4903 (2013).
  5. Niu, Y., et al. Identification of isoflavonoids in Radix Puerariae for quality control using on-line high performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray ionization-mass spectrometry coupled with post-column derivatization. Food Res Int. 48, 528-537 (2012).
  6. Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. Liquid chromatography coupled to on-line post column derivatization for the determination of organic compounds: a review on instrumentation and chemistries. Anal. Chim. Acta. 798, 1-24 (2013).
  7. Dousa, M., Brichac, J., Gibala, P., Lehnert, P. Rapid hydrophilic interaction chromatography determination of lysine in pharmaceutical preparations with fluorescence detection after postcolumn derivatization with o-phtaldialdehyde. J Pharm Biomed Anal. 54, 972-978 (2011).
  8. Iijima, S., et al. Optimization of an Online Post-Column Derivatization System for Ultra High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) and Its Applications to Analysis of Biogenic Amines. Anal Sci. 29, 539-545 (2013).
  9. Cunico, R. L., Schlabach, T. Comparison of Ninhydrin and o-Phthalaldehyde Postcolumn Detection Techniques for High Performance Liquid Chromatography of Free Amino. J. Chromatogr. A. 1983, 461-470 (1983).
  10. Donahue, E. P., Brown, L. L., Flakoll, P. J., Abumrad, N. N. Rapid Measurement of Leucine-specific Activity in Biological Fluids by Ion-exchange Chromatography and Post-column Ninhydrin Detection. J. Chromatogr. A. 571, 29-36 (1998).
  11. Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: A Reagent for Assay of Amino Acids, Peptides, Proteins and Primary Amines in the Picomole Range. Science. 1972, 871-872 (1972).
  12. Samejima, K. Separation of Fluorescamine Derivitices of Aliphatic Diamines and Polyamines by High Speed Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 96, 250-254 (1974).
  13. Zhang, Y., et al. Evaluation of antioxidant activity of ten compounds in different tea samples by means of an on-line HPLC-DPPH assay. Food Res Int. 53, 847-856 (2013).
  14. Niu, Y., et al. Identification of the anti-oxidants in Flos Chrysanthemi by HPLC-DAD-ESI/MS(n) and HPLC coupled with a post-column derivatisation system. Phytochem Anal. 24, 59-68 (2013).
  15. Raudonis, R., Bumblauskiene, L., Jakstas, V., Pukalskas, A., Janulis, V. Optimization and validation of post-column assay for screening of radical scavengers in herbal raw materials and herbal preparations. J. Chromatogr. A. 1217, 7690-7698 (2010).
  16. Raudonis, R., Raudone, L., Jakstas, V., Janulis, V. Comparative evaluation of post-column free radical scavenging and ferric reducing antioxidant power assays for screening of antioxidants in strawberries. J. Chromatogr. A. 1233, 8-15 (2012).
  17. Zakrzewski, R. Determination of Methimazole in Pharmaceutical Preparations using an HPLC Method Coupled with an Iodine-Azide Post-Column Reaction. J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 32, 383-398 (2008).
  18. Zakrzewski, R. Development and validation of a reversed-phase HPLC method with post-column iodine-azide reaction for the determination of thioguanine. J. Anal. Chem. 64, 1235-1241 (2009).
  19. Gritti, F., Guiochon, G. Accurate measurements of the true column efficiency and of the instrument band broadening contributions in the presence of a chromatographic column. J. Chromatogr. A. 1327, 49-56 (2014).
  20. Stewart, J. T. Post cotumn derivatization methodology in high performance liquid chromatography (HPLC). Trends Anal. Chem. 1, 170-174 (1982).
  21. Rigas, P. G. Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography. Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).
  22. Frei, R. W. Reaction Detectors in Modern Liquid Chromatography. Chromatographia. 15, 161-166 (1982).
  23. Pravadil-Cekic, S., et al. Using Reaction Flow Chromatography for the Analysis of Amino Acid: Derivatisation With Fluorescamine Reagent. Microchem. J. , (2015).
  24. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).
  25. Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures. Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).
  26. Selim, M., et al. A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography. Microchem. J. 116, 87-91 (2014).
  27. Bigley, F. P., Grob, R. L. Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).
  28. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products. J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

110

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены