דג הזברה כמודל להעריך את הפוטנציאל טרטוגניות של ניטריט

Summary

חשיפת teratogens עלולה לגרום למומים מולדים. דג זברה היא שימושי לקביעת פוטנציאל טרטוגניות של כימיקלים. אנו להדגים את התועלת של דג זברה על ידי חשיפה עוברת לרמות שונות של ניטריט וגם בזמנים שונים של חשיפה. אנו מראים כי ניטריט יכול להיות רעיל ולגרום ליקויים התפתחותיים חמורים.

Abstract

רמות ניטראט גבוהות בסביבה עלולות לגרום למומים מולדים או הפלות אצל בני אדם. יש להניח, זה נובע מהמרת ניטראט ניטריט ידי חיידקים במעי רוק. עם זאת, במחקרים יונקים אחרים, רמות ניטריט גבוהה לא לגרום למומים מולדים, אם כי הם יכולים להוביל לתוצאות רבייה עניה. לפיכך, פוטנציאל טרטוגניות של ניטריט לא ברור. זה יהיה שימושי יש מערכת מודל חוליות בקלות להעריך השפעות טרטוגניות של ניטריט או כל חומר כימי אחר שיש בו עניין. כאן אנו להדגים את התועלת של דג הזברה (Danio rerio) כדי לסרוק תרכובות המצויות לרעילות ופגמים עובריים. עוברי דג זברה הם מופרים חיצוניים ויש התפתחות מהירה, מה שהופכים אותם מודל טוב מחקרים טרטוגניות. אנחנו מראים כי הגדלת זמן חשיפה ניטריט משפיע הישרדות שלילית. הגדלת ריכוז של ניטריט גם משפיעה לרעה על הישרדות, ואילו חנק לא. עבור עוברי that לשרוד חשיפה ניטריט, פגמים שונים יכולים להתרחש, כוללים קרום לב ואת החלמון בצק צק, לשחות שלפוחית ​​noninflation, ו מום craniofacial. התוצאות שלנו מעיד כי דג הזברה היא מערכת נוחה ללימוד הפוטנציאל טרטוגניות של ניטריט. גישה זו יכולה בקלות להיות מותאמת כדי לבדוק כימיקלים אחרים והשפיע על התפתחות החולייתנים הראשונה.

Introduction

Teratogenesis הוא תהליך המשבש את ההתפתחות הנורמלית של העובר או העובר על ידי גרימת מומים מבניים ותפקודיים קבע, פיגור בגדילה, או הפלה במקרים חמורים ^1. זה יכול להיגרם על ידי סוכנים טבעיים מסוימים (teratogens), אשר מפריעים להתפתחות עוברית מספר דרכי ^2. במהלך התפתחות עובר אנושית, teratogens הנפוצה כגון קרינה, חומרים מזהמים, מתכות רעילות, וכימיקלים אורגניים דווחה לגרום למומים בקפלים מלוכסנים (לקפל עור מכסה העין העליון) ו clinodactyly (אצבע מעוקלת או בוהן) דרך שגיאות המוךפו"גנטי שהולכות ^1.

הבנת המנגנון המולקולרי של teratogenesis היא הצעד הראשון לקראת פיתוח טיפול ומניעה. מודלים חוליות כמה כגון אפריקה שרט צפרדע (laevis Xenopus) ו דג הזברה (Danio rerio) שימשו לקביעת מסלולים מולקולריים מושפע teratogens. מחקרים קודמים השתמשו דג הזברה כמודל אפידמיולוגיה, טוקסיקולוגיה teratogenesis ^3-7. שולץ et al. דג זברה נחשב "תקן זהב" להערכת רעילות סביבתית. הדבר נובע, בין השאר, על השקיפות של העובר דג הזברה, אשר מאפשר לחוקרים לחזות את פגם התפתחותי כפי שהוא מתרחש ^8. כ -70% מן הגנים באדם יש orthologues דג הזברה, מה שהופך דג הזברה כמודל החולייתנים רצוי ללימוד פגמים אנושיים ^9.

כמה מחקרים אפידמיולוגיים הראו כי ניטראט ניטריט, נפוץ במזונות החווה ומים, קשורים עם מומים מולדים או הפלות ספונטניות ^10,11, בעוד מחקרים אחרים אינם תומכים קשר זה ^12. ניטראט _(NO 3 ^-) ו ניטריט (NO ₂ ^-) נוכחים באופן טבעי באדמה ובמים. הם מהווים מקור של חנקן לצמחים והם חלק nitrogen מחזור ^13. מזונות כגון שעועית ירוקה, גזר, דלעת, תרד, סלק מחוות המשתמשות דשנים גבוה חנקתי חיזקו באופן משמעותי רמות ניטראט ניטריט ^7. חלב פרות ניזונים עם מזונות חנקות גבוה ודגים במים חנקות גבוה (בעיקר נגר אדמה ³⁰⁾ יכול להוביל בני אדם לצרוך כמויות גדולות של ניטראט ¹⁴ ניטריט. ניטרט ניטריט גם משמשות לשימור מזון, אשר מגדיל באופן דרמטי את כמות מעובדים על ידי בני אדם ^12.

רמות אופטימליות של ניטראט ניטריט ממלאות תפקידים יסודיים תהליכים פיסיולוגיים כמו הומאוסטזיס וסקולרית ותפקוד, עצבי ומנגנוני הגנה מארחים אימונולוגיים ^13-15. עם זאת, חשיפה לרמות גבוהות של ניטראט ניטריט עלול להוביל לתופעות לוואי, במיוחד אצל תינוקות וילדים ^16. חנקתי נבלעו הוא עוד המרה ניטריט בחלל הפה על ידי מיקרואורגניזמים וב הדואר מערכת העיכול על ידי מיקרופלורת המעי ^17.

ניטראט מכניס תינוקות בסיכון גבוה לתסמונת התינוק הכחולה על ידי חמצון של המוגלובין כדי methemoglobin, וכתוצאה מכך נפגעת המוגלובין מהחמצן שלה נושאת יכולת ^18. זו התוצאה של הצבע הכחול של עור המשתרע לרקמות היקפיות במקרים חמורים יותר. חמצון עכבות של תוצאות רקמות בתסמינים אחרים, בצורה החמורה ביותר שמוביל תרדמת ומוות ^19,20. סימפטומים דומים נצפו אצל תינוקות ומבוגרים בריכוזים גבוהים של ניטראט ^21. רמות גבוהות של methemoglobin במבוגרים בשל התוצאות הרעלת ניטריט ב כיחלון, כאבי ראש, הפרעות נשימה ^31, ומוות אם אינו מטופל בשל סיבוכים הקשורים היפוקסיה רקמות חיוניות ^32,33.

ניטרט בליעה ברמות גבוהות יותר גם יכול לגרום לסיבוכים בריאותיים שונים. סוכרת ילדות, שלשולים חוזרים, וזיהומים בדרכי הנשימה חוזרתאצל ילדים נקשרו עם ^11,17,22 צריכת חנקות הגבוהה. חשיפה כרונית לרמה של חנקות גבוהה קשורה במתן שתן ודימום טחול. חשיפה במינון גבוה אקוטית חנקות יכול להוביל למגוון רחב של בעיות רפואיות כמו כאבי בטן, חולשת שרירים, דם בצואה ושתן, התעלפות, ומוות ^11. חשיפה טרום לידתית חנק ברמות גבוהות כבר משויכת בצינור העצבי פגם שרירים ושלד ^11.

דו"ח שנערך לאחרונה הראה כי טיפול עוברי דג זברה עם ניטריט הוביל חלמון בצק צק, מומי craniofacial ו ציריים, ולשחות שלפוחית ​​noninflation ^5. במחקר זה, אנחנו מדגימים שיטה לטיפול עוברי דג הזברה עם ניטראט ניטריט לקבוע פוטנציאל טרטוגניות שלהם. עוברים שנחשפו ניטריט בריכוזים שונים ואורך זמן שונה. אתנול שמש כביקורת חיובית, שכן הוא teratogen הוקם ^23. Oשיטת ur הראו כי הן ריכוזים גבוהים וזמני חשיפה ארוכה ניטריט היו מזיק הישרדות הביאה פנוטיפים שונים, החל (בצקת) מתון עד חמור (פגמים התפתחותיים ברוטו). לכן, דג הזברה הוא מודל יעיל לבדיקה ישירות השפעות טרטוגניות הפוטנציאל של ניטראט ניטריט בעוברים כדי להשלים מחקרים אפידמיולוגיים.

Protocol

הנהלים המתואר בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת אינדיאנה פנסילבניה.

1. עובר קציר

1. לשמור על דג הזברה על 28.5 מעלות צלזיוס, pH 7, מוליכות בין 500-1,500 מיקרו-שניות, ואת מחזור אור / חושך של 14 אור hr ו -10 שעות חושך ^24. השתמש זני wild-type כגון ט"ו, AB או היברידי ט"ו / AB. זנים שונים עשויים להגיב באופן שונה לטיפול כימי ^25.
2. הגדר את הדגים לצורך הזדווגות אמש ביצי קציר על ידי הוספת מי מערכת דגים לתוך טנק הזדווגות. הוספת זכר ודגי נקבה לתוך הטנק להפריד בין שני דגים עם מחיצה. כל זוג דגים ייצרו מגוון של 50-300 ביצים. כדי להבטיח כי ביצים מספיק תופקנה, להקים 30 זוגות של דגים. בדרך כלל, כ -50% של זוגות דגים בגיל ההזדווגות הממשלה (6-9 חודשים) יהיה לייצר ביציות, וכתוצאה מכך עד 200 ביצים לכל זוג ועד למקסימום של עד 3ביצים, 000 לצורך הניסוי הזה.
3. למחרת בבוקר אחרי האור נדלק, להסיר את המחיצה כדי ליזום הזדווגות. בדקו את טנקי הזדווגות ביצים כל 15 דק '.
4. לאחר הדגים מטילים ביצים, לקצור את כל העוברים באמצעות מסננת תה ולשלב אותם לתוך מכולה אחת גדולה עם חיץ E3 (5 mM NaCl, 0.17 מ"מ KCl, 0.33 מ"מ CaCl _2, 0.33 מ"מ MgSO _4). 1.5 hpf, להסיר ולסלק ביצים מופרות עם pipet העברה פלסטיק תחת מיקרוסקופ לנתח. ביצים מופרות הן אטומות בעוד ביצים מופרות הם שקופות ^34.
5. העברת 50 עוברים לתוך צלחת זכוכית מ"מ 100 x 15 פטרי המכילה 50 מ"ל E3 חיץ עבור כל תנאי הטיפול. סך של 33 מנות נדרשים עבור 11 תנאי טיפול ו -3 משכפל.

2. עובר טיפול

1. ביצוע טיפולים ב -2 שעות לאחר ההפריה (hpf) ^35. עוברים / זחלים לדגור על 28.5 מעלות צלזיוס ולבחון את הזחלים ב 120 hpf. בצע בבית לאהרח שלושה משכפל של כל תנאי הטיפול לניתוח סטטיסטי.
2. במשך 3 צלחות פטרי (כל 50 עוברים המכילים) בשעה 2 hpf, להסיר את החיץ E3 עם pipet העברת ולהוסיף 50 מ"ל של אתנול 300 מ"מ מדולל במאגר E3. מכסים את צלחות פטרי עם Parafilm כדי למזער אידוי של אתנול.
   1. המשך חשיפה עוברת כדי אתנול במשך 22 שעות. ואז להסיר את אתנול עם העברת pipet. הוסף 50 מ"ל של חיץ E3 ו מערבולת צלחת כמה פעמים כדי לשטוף את אתנול. הסר חוצץ E3 זה עם pipet העביר וחזור על שלב כביסה פי 2 יותר.
3. במשך 3 צלחות פטרי (כל 50 עוברים המכילים) בשעה 2 hpf, להסיר את החיץ E3 עם pipet העברת ולהוסיף 50 מ"ל של חיץ E3 חדש.
4. במשך 9 צלחות פטרי (כל 50 עוברים המכילים) בשעה 2 hpf, להסיר את החיץ E3 עם pipet העברת ולהוסיף 50 מ"ל של 1,000 מ"ג / L סודיום ניטריט מומס חיץ E3. אשר את הריכוז של הפתרון ניטריט המניות מראש באמצעותשינוי של diazotization (USEPA שיטה 354.1) שיטת spectrophotometric ^28.
   1. המשך חשיפת 3 מנות במשך 46 שעות, 3 מנות עבור 70 שעות ו 3 מנות עבור 94 שעות. החלף את הפתרון ניטריט עם פתרון ניטריט טרי מדי יום.
   2. לאחר כל זמן החשיפה, להסיר את ניטריט עם pipet העברה. הוסף 50 מ"ל של חיץ E3 ו מערבולת צלחת כמה פעמים כדי לשטוף את ניטריט. הסר חוצץ E3 זה עם pipet העביר וחזור על שלב כביסה פי 2 יותר.
5. במשך 3 צלחות פטרי (כל 50 עוברים המכילים) בשעה 2 hpf, להסיר את החיץ E3 עם pipet העברת ולהוסיף 50 מ"ל של 200 מ"ג / L סודיום ניטריט. חזרו על פעולה זו עם 400, 600, 800, ו -1,000 מ"ג / ליטר של סודיום ניטריט.
   1. המשך חשיפה עוברת ניטריט עבור 70 שעות. החלף את הפתרון ניטריט עם פתרון ניטריט טרי מדי יום.
   2. לאחר זמן החשיפה, להסיר את ניטריט עם pipet העברה. הוסף 50 מ"ל של חיץ E3 ו מערבולת המנה מספרפעמים כדי לשטוף את ניטריט. הסר חוצץ E3 זה עם pipet העביר וחזור על שלב כביסה פי 2 יותר.
6. במשך 3 צלחות פטרי (כל 50 עוברים המכילים) בשעה 2 hpf, להסיר את החיץ E3 עם pipet העברת ולהוסיף 50 מ"ל של 1,000 מ"ג / L נתרן חנקתי מומס חיץ E3. אשר את הריכוז של התמיסה חנקה כסף המניות מראש באמצעות שינוי של הפחתת קדמיום (שיטת USEPA 353.3) שיטת spectrophotometric ^28.
   1. המשך חשיפת העוברים חנקו עבור 70 שעות. החלף את הפתרון חנק עם פתרון חנק טרי מדי יום.
   2. לאחר זמן החשיפה, להסיר את חנקתי עם pipet העברה. הוסף 50 מ"ל של חיץ E3 ו מערבולת צלחת כמה פעמים כדי לשטוף את חנקתי. הסר חוצץ E3 זה עם pipet העביר וחזור על שלב כביסה פי 2 יותר.
7. במהלך כל יום של החשיפה, לספור את מספר עובר / זחלים מתים באמצעות סטראו. סימנים של מוותבין השאר, חוסר דופק ואת זרימת הדם, או חוסר תנועתיות לאחר 1 דקות של התבוננות. סר עובר / זחלים מתים עם pipet העביר להפחתת זיהום של למאגר E3.
8. כאשר ניסויים נגמרים בגיל 120 hpf, להרדים את הזחלים.
   1. הסר את חוצץ E3 עם העברת pipet. לאחר מכן להוסיף 50 מ"ל של 0.2% MS-222 (שנאגרו ל- pH 7) ולחכות 10 דקות.
   2. הסר את MS-222 עם העברת pipet. הוסף 50 מ"ל של חיץ מערבולת E3 לשטוף את MS-222.
   3. הסר את חוצץ E3 עם pipet העברת ולהוסיף 20 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) כדי לתקן את הזחלים. מערבולת פעמים צלחת מספר. השתמש העברת pipet להעביר את הזחלים לתוך בקבוקון זכוכית יחד עם מספיק PFA למלא את הבקבוקון. אחסן את הבקבוקונים במקרר למשך הלילה (O / N).
9. צלם תמונות של זחלים קבועים באמצעות סטריאוסקופ עם מצלמה דיגיטלית. השתמש בהגדלה 30X, ISO 200, ו -200 זמן החשיפה msec. אוריינט הזחלים כך קדמי leרגל ו הגבי הוא לחלק העליון של השדה.

תוצאות

החשיפה אתנול 300 מ"מ במשך 22 שעות לא הייתה השפעה על הישרדות (מידע לא מוצג), עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים ^5,23,26. זה צפוי, כמו אתנול הוא teratogen ידוע ושימש כביקורת חיובית. פנוטיפים שנצפו כללו בצקת קרום לב, noninflation בשלפוחית ​​שחייה (איור 1), פ?...

Discussion

השיטה המתוארת כאן ממחיש את התועלת של דג הזברה בהערכת הפוטנציאל טרטוגניות של הניטריט ו חנקתי. בהשוואת חוליות אחרות, יש דג זברה יתרונות הכוללים פוריות גבוהה, הפריה חיצונית, שקיפות אופטית, ואת התפתחות מהירה. מוטציות זמינות חסרות פיגמנטציה (כגון דג זברת קספר ³⁶⁾ גם ל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DREL/2010 instrument	Hach	26700-03
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
KIMAX glass Petri Dish	VWR	89001-244
MS-222	Sigma-Aldrich	E10521
NitraVer 5 Nitrate Reagent	Hach	14034-46
NitriVer 3 Nitrite Reagent	Hach	14065-99
Parafilm	Fisher Scientific	3-374-10
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
S6E stereomicroscope	Leica	10446294
Sodium nitrate	Fisher Scientific	S343
Sodium nitrite	Fisher Scientific	S347
Transfer pipets	Laboratory Products Sales	L320072
Glass vials	Fisher Scientific	03-338B