Zebrafish come modello per valutare il potenziale teratogeno di nitriti

Riepilogo

L'esposizione a teratogeni può causare difetti alla nascita. Zebrafish sono utili per determinare il potenziale teratogeno di sostanze chimiche. Dimostriamo l'utilità di zebrafish esponendo embrioni a vari livelli di nitriti e anche in diversi tempi di esposizione. Abbiamo dimostrato che il nitrito può essere tossico e causare gravi difetti di sviluppo.

Abstract

Alti livelli di nitrati nell'ambiente può causare difetti congeniti o aborti negli esseri umani. Presumibilmente, questo è dovuto alla conversione dei nitrati in nitriti da intestinali e salivari batteri. Tuttavia, in altri studi di mammiferi, alti livelli di nitriti non causano difetti alla nascita, anche se possono portare a scarsi esiti riproduttivi. Pertanto, il potenziale teratogeno di nitriti non è chiaro. Sarebbe utile avere un sistema modello vertebrato valutare facilmente effetti teratogeni di nitrito o qualsiasi altro prodotto chimico di interesse. Qui, dimostriamo l'utilità di zebrafish (Danio rerio) per lo screening di composti per la tossicità e difetti embrionali. zebrafish embrioni sono fecondati esternamente ed avere un rapido sviluppo, che li rende un buon modello per gli studi teratogeni. Abbiamo dimostrato che aumentando il tempo di esposizione al nitrito influenza negativamente la sopravvivenza. Aumentando la concentrazione di nitrito anche effetti negativi di sopravvivenza, considerando che il nitrato non. Per gli embrioni that sopravvivere l'esposizione nitrito, vari difetti si possono verificare, tra cui pericardico e tuorlo d'edema sac, nuotare noninflation vescica e malformazioni cranio-facciale. I nostri risultati indicano che il zebrafish è un sistema conveniente per studiare il potenziale teratogeno di nitriti. Questo approccio può essere facilmente adattato per testare altre sostanze chimiche per i loro effetti sul primo sviluppo dei vertebrati.

Introduzione

Teratogenesi è un processo che sconvolge il normale sviluppo di un embrione o il feto, provocando anomalie strutturali e funzionali permanenti, ritardo della crescita, o aborto spontaneo nei casi più gravi ^1. Esso può essere causato da alcuni agenti naturali (teratogeni), che interferiscono con lo sviluppo embrionale in diversi modi ^2. Durante lo sviluppo fetale umano, teratogeni comuni come le radiazioni, agenti infettivi, metalli tossici e sostanze chimiche organiche sono stati segnalati per causare difetti di epicanto (la pelle piega nella palpebra superiore) e clinodattilia (dito curvo o tep) attraverso errori morfogenetici ^1.

La comprensione del meccanismo molecolare di teratogenesi è il primo passo verso lo sviluppo di trattamento e la prevenzione. Diversi modelli vertebrati quali la rana africana artigliata (Xenopus laevis) e zebrafish (Danio rerio) sono stati utilizzati per determinare i percorsi molecolari colpite dalla TeratOgens. Studi precedenti hanno utilizzato zebrafish come modello per l'epidemiologia, tossicologia e teratogenesi ^3-7. Scholz et al. zebrafish considerato come un "gold standard" per la valutazione della tossicità ambientale. Ciò è dovuto, in parte, alla trasparenza dell'embrione zebrafish, che permette ai ricercatori di visualizzare il difetto di sviluppo come avviene ^8. Circa il 70% dei geni umani hanno ortologhi in zebrafish, facendo zebrafish un modello vertebrato desiderabile per lo studio di difetti umani ^9.

Alcuni studi epidemiologici hanno suggerito che nitrati e nitriti, comunemente presenti negli alimenti agricoli e acqua, sono associate a difetti di nascita o aborti spontanei ^10,11, mentre altri studi non supportano questa associazione ^12. Nitrati _(NO 3 ^-) e nitriti _(NO 2 ^-) sono naturalmente presenti nel suolo e nell'acqua. Essi sono una fonte di azoto per le piante e sono una parte della nciclo itrogen ^13. Alimenti come fagiolini, carote, zucca, spinaci, bietole e provenienti da allevamenti che utilizzano fertilizzanti ad alto contenuto di nitrati hanno livelli di nitrati e nitriti ⁷ aumentata in modo significativo. Il latte da mucche alimentate con alimenti di nitrati alti e pesci in acqua alta nitrato (principalmente dal deflusso terreno ³⁰⁾ può portare agli esseri umani che consumano grandi quantità di nitrati e nitriti ^14. Nitrati e nitriti sono comunemente utilizzati nella conservazione degli alimenti, che aumenta notevolmente la quantità ingerita dagli esseri umani ^12.

Livelli ottimali di nitrati e nitriti svolgono un ruolo fondamentale nei processi fisiologici come omeostasi vascolare e la funzione, la neurotrasmissione e meccanismi di difesa ospite immunologici ^13-15. Tuttavia, l'esposizione ad alti livelli di nitrati e nitriti può portare ad effetti negativi, soprattutto nei neonati e nei bambini ^16. nitrato ingerito viene ulteriormente convertito in nitriti nella cavità orale microflora e in the tratto gastrointestinale dalla microflora intestinale ^17.

Nitrato mette i neonati ad alto rischio per la sindrome del bambino blu per ossidazione di emoglobina a metaemoglobina, compromettendo l'emoglobina che trasporta l'ossigeno dalla sua capacità di ^18. Ciò comporta il colore blu di pelle che si estende ai tessuti periferici nei casi più gravi. L'ossigenazione inibito di tessuti risultati in altri sintomi, più gravemente che porta al coma e alla morte ^19,20. Sintomi simili sono stati osservati nei bambini e negli adulti a concentrazioni più elevate di nitrati ^21. Elevati livelli di metaemoglobina negli adulti a causa di risultati di avvelenamento nitrito di cianosi, mal di testa, disturbi respiratori, ³¹ e morte se non trattata a causa di complicazioni legate alla ipossia tissutale vitale ^32,33.

Il nitrato ingerito a livelli più alti può anche tradursi in varie complicazioni di salute. diabete infantile, diarrea ricorrente, e infezioni delle vie respiratorie ricorrentinei bambini sono stati collegati con elevata assunzione di nitrato ^11,17,22. L'esposizione cronica a un alto livello di nitrato è associato con la minzione e della milza emorragie. L'esposizione acuta ad alte dosi di nitrati può portare ad un ampio spettro di condizioni mediche come dolori addominali, debolezza muscolare, sangue nelle feci e nelle urine, svenimenti e morte ^11. L'esposizione prenatale al nitrato ad alti livelli è stato associato con il tubo neurale e difetti muscolo-scheletrico ^11.

Un recente rapporto ha mostrato che il trattamento di embrioni di zebrafish con il nitrito ha portato alla tuorlo edema sac, malformazioni cranio-facciali e assiali, e vescica natatoria noninflation ^5. In questo studio, abbiamo dimostrato un metodo per il trattamento di embrioni di zebrafish con nitrati e nitriti per determinare il loro potenziale teratogeno. Gli embrioni sono stati esposti a nitrito a differenti concentrazioni e periodi di tempo diversi. L'etanolo è stato utilizzato come controllo positivo, poiché è un teratogeno stabilita ^23. Our metodo ha dimostrato che entrambe le concentrazioni elevate e tempi di esposizione lunghi in nitriti erano dannosi per la sopravvivenza e ha portato in vari fenotipi, che vanno da lievi (edema) a gravi difetti di sviluppo (lordi). Pertanto, il pesce zebra è un modello utile per esplorare direttamente i potenziali effetti teratogeni di nitrati e nitriti sugli embrioni per completare gli studi epidemiologici.

Protocollo

Le procedure descritte in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali presso l'Indiana University of Pennsylvania.

1. Harvest embrioni

1. Mantenere zebrafish a 28,5 ° C, pH 7, conducibilità tra 500-1.500 mS, e un ciclo luce / buio di 14 ore di luce e 10 ore scuro ^24. Utilizzare ceppi wild-type, come Tu, AB o TU / AB ibrido. Diversi ceppi possono rispondere in modo diverso al trattamento chimico ^25.
2. Impostare il pesce per l'accoppiamento la sera prima le uova di raccolta con l'aggiunta di acqua sistema di pesce in un serbatoio di accoppiamento. Aggiungere un maschio e femmina di pesce nel serbatoio e separare le due pesci con un divisore. Ogni coppia di pesce produrrà una gamma di 50-300 uova. Per garantire che saranno prodotti abbastanza uova, istituito 30 paia di pesce. In genere, circa il 50% delle coppie di pesce all'età di accoppiamento primo (6-9 mesi) produrrà uova, con conseguente fino a 200 uova per ogni coppia e un massimo di fino a 3, 000 uova per questo esperimento.
3. La mattina seguente dopo che la luce si accende, rimuovere il divisore di avviare l'accoppiamento. Controllare i serbatoi di accoppiamento per le uova ogni 15 min.
4. Una volta che i pesci depongono le uova, raccogliere tutti gli embrioni utilizzando un colino da tè e combinarle in un unico grande contenitore con E3 tampone (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mm CaCl _2, 0,33 mm MgSO _4). A 1,5 HPF, rimuovere ed eliminare le uova non fecondate con una pipetta di plastica sotto un microscopio da dissezione. Uova non fecondate sono opache mentre le uova fecondate sono trasparenti ^34.
5. Trasferire 50 embrioni in una piastra di Petri di 100 x 15 mm di vetro contenente 50 ml E3 buffer per ciascuna condizione di trattamento. Un totale di 33 piatti sono necessari per 11 condizioni di trattamento e 3 repliche.

2. Gli embrioni Trattamento

1. Effettuare trattamenti a 2 ore dopo la fecondazione (HPF) ^35. Incubare gli embrioni / larve a 28,5 ° C ed esaminare le larve a 120 HPF. Eseguire a least tre repliche di ogni condizione di trattamento per l'analisi statistica.
2. Per 3 piastre di Petri (ciascuna contenente 50 embrioni) a 2 HPF, rimuovere il buffer di E3 con una pipetta di trasferimento e aggiungere 50 ml di 300 mm etanolo diluito in tampone di E3. Coprire le piastre di Petri con parafilm per minimizzare l'evaporazione dell'etanolo.
   1. Continuare ad esporre gli embrioni di etanolo per 22 ore. Poi rimuovere l'etanolo con una pipetta di trasferimento. Aggiungere 50 ml di tampone E3 e agitare il piatto più volte per lavare l'etanolo. Rimuovere questo buffer E3 con una pipetta di trasferimento e ripetere la fase di lavaggio altre 2 volte.
3. Per 3 piastre di Petri (ciascuna contenente 50 embrioni) a 2 HPF, rimuovere il buffer di E3 con una pipetta di trasferimento e aggiungere 50 ml di nuovo buffer E3.
4. Per 9 piastre di Petri (ciascuna contenente 50 embrioni) a 2 HPF, rimuovere il buffer di E3 con una pipetta di trasferimento e aggiungere 50 ml di nitrito di sodio 1,000 mg / l disciolti in tampone E3. Confermare la concentrazione della soluzione di riserva di nitriti in anticipo utilizzando unmodifica della diazotazione (US EPA Method 354.1) metodo spettrofotometrico ^28.
   1. Continuare ad esporre 3 piatti per 46 ore, 3 piatti per 70 ore e 3 piatti per 94 ore. Sostituire la soluzione di nitrito con una soluzione di nitrito di fresco tutti i giorni.
   2. Dopo ogni tempo di esposizione, rimuovere la nitriti con una pipetta. Aggiungere 50 ml di tampone E3 e agitare il piatto più volte per lavare la nitriti. Rimuovere questo buffer E3 con una pipetta di trasferimento e ripetere la fase di lavaggio altre 2 volte.
5. Per 3 piastre di Petri (ciascuna contenente 50 embrioni) a 2 HPF, rimuovere il buffer di E3 con una pipetta di trasferimento e aggiungere 50 ml di nitrito di sodio 200 mg / L. Ripetere questa operazione con 400, 600, 800, e 1000 mg / l di nitrito di sodio.
   1. Continuare ad esporre gli embrioni in nitrito per 70 ore. Sostituire la soluzione di nitrito con una soluzione di nitrito di fresco tutti i giorni.
   2. Dopo il tempo di esposizione, rimuovere la nitriti con una pipetta. Aggiungere 50 ml di tampone E3 e agitare il piatto diversivolte per lavare i nitriti. Rimuovere questo buffer E3 con una pipetta di trasferimento e ripetere la fase di lavaggio altre 2 volte.
6. Per 3 piastre di Petri (ciascuna contenente 50 embrioni) a 2 HPF, rimuovere il buffer di E3 con una pipetta di trasferimento e aggiungere 50 ml di nitrato di sodio 1,000 mg / l disciolti in tampone E3. Conferma la concentrazione della soluzione di nitrato anticipo usando una modifica della riduzione cadmio (metodo USEPA 353.3) metodo spettrofotometrico ^28.
   1. Continuare ad esporre gli embrioni per il nitrato di 70 ore. Sostituire la soluzione di nitrato con soluzione di nitrato appena fatto quotidiano.
   2. Dopo il tempo di esposizione, rimuovere il nitrato con una pipetta. Aggiungere 50 ml di tampone E3 e agitare il piatto più volte per lavare il nitrato. Rimuovere questo buffer E3 con una pipetta di trasferimento e ripetere la fase di lavaggio altre 2 volte.
7. Durante ogni giorno di esposizione, contare il numero di morti dell'embrione / larve utilizzando uno stereomicroscopio. Segni di morteincludono la mancanza di battito cardiaco e la circolazione del sangue, o la mancanza di motilità dopo 1 minuto di osservazione. Rimuovere morti embrioni / larve con una pipetta di trasferimento per ridurre la contaminazione del buffer E3.
8. Quando gli esperimenti finiscono a 120 HPF, eutanasia le larve.
   1. Rimuovere il buffer E3 con una pipetta. Quindi aggiungere 50 ml di 0,2% MS-222 (tamponata a pH 7) e attendere 10 min.
   2. Rimuovere il MS-222 con una pipetta di trasferimento. Aggiungere 50 ml di tampone E3 e agitare per lavare la MS-222.
   3. Rimuovere il buffer E3 con una pipetta di trasferimento e aggiungere 20 ml di 4% paraformaldeide (PFA) per fissare le larve. Agitare più volte piatto. Utilizzare una pipetta di trasferimento per trasferire le larve in una fiala di vetro lungo con abbastanza PFA per riempire il flacone. Conservare le fiale in frigorifero per una notte (O / N).
9. Scatta foto di larve fisso con uno stereoscopio con una fotocamera digitale. Utilizzare 30X di ingrandimento, ISO 200, e 200 msec tempo di esposizione. Orientare le larve modo che anteriore alla left e dorsale è all'inizio del campo.

Risultati

L'esposizione a 300 mm di etanolo per 22 ore ha avuto alcun effetto sulla sopravvivenza (dati non mostrati), in linea con le precedenti relazioni ^5,23,26. Questo è previsto, come l'etanolo è un teratogeno conosciuto e servito come controllo positivo. Fenotipi osservati inclusi edema pericardico, noninflation vescica natatoria (figura 1), difetti cranio-facciali e ritardo dello sviluppo (dati non riportati).

Discussione

Il metodo descritto qui dimostra l'utilità di zebrafish nel valutare il potenziale teratogeno di nitriti e nitrati. Rispetto ad altri vertebrati, zebrafish hanno vantaggi che includono alta fecondità, fecondazione esterna, trasparenza ottica e rapido sviluppo. Mutanti disponibili che mancano di pigmentazione (come ad esempio il pesce zebra Casper ³⁶⁾ aiutano anche a migliorare la visibilità degli organi interni. E 'anche facile generare zebrafish transgenico con geni reporter per facilitare l'a...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DREL/2010 instrument	Hach	26700-03
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
KIMAX glass Petri Dish	VWR	89001-244
MS-222	Sigma-Aldrich	E10521
NitraVer 5 Nitrate Reagent	Hach	14034-46
NitriVer 3 Nitrite Reagent	Hach	14065-99
Parafilm	Fisher Scientific	3-374-10
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
S6E stereomicroscope	Leica	10446294
Sodium nitrate	Fisher Scientific	S343
Sodium nitrite	Fisher Scientific	S347
Transfer pipets	Laboratory Products Sales	L320072
Glass vials	Fisher Scientific	03-338B