Zebrafisch als Modell zur Bewertung der teratogene Potenzial von Nitrit

Zusammenfassung

Die Exposition gegenüber Teratogenen kann Geburtsfehler verursachen. Zebrafische sind nützlich für das teratogene Potential von Chemikalien zu bestimmen. Wir zeigen die Nützlichkeit von Zebrafisch-Embryonen durch zu verschiedenen Ebenen von Nitrit und auch zu verschiedenen Zeiten der Belichtung ausgesetzt wird. Wir zeigen, dass Nitrit giftig sein können und schwere Entwicklungsstörungen verursachen.

Zusammenfassung

Hohe Nitratwerte in der Umgebung können in angeborenen Defekten oder Fehlgeburten bei Menschen führen. Vermutlich ist dies auf die Umwandlung von Nitrat zu Nitrit von Darm und Speichelbakterien. Aber auch in anderen Säugetier-Studien, hohe Nitritwerte nicht Geburtsfehler verursachen, obwohl sie zu einer schlechten reproduktiven Ergebnissen führen kann. Somit ist das teratogene Potential von Nitrit nicht klar. Es wäre sinnvoll, ein Wirbeltier-Modellsystem zu haben, um leicht fruchtschädigende Wirkung von Nitrit oder ähnliche chemische meisten interessieren. Hier zeigen wir die Nützlichkeit von Zebrafisch (Danio rerio) Verbindungen zur Toxizität und embryonalen Mängel zu untersuchen. Zebrafisch-Embryonen werden extern befruchtet und haben die rasante Entwicklung, ihnen ein gutes Modell für teratogene Studien zu machen. Wir zeigen, dass die Zeit der Belichtung zu erhöhen negativ Überleben beeinflusst zu Nitrit. die Konzentration von Nitrit Erhöhung wirkt sich auch negativ auf das Überleben, während Nitrat nicht. Für Embryonen that überleben Nitrit Belichtung können verschiedene Defekte auftreten, einschließlich Herzbeutel und Dottersack Ödeme, Schwimmblase noninflation sowie Schädel- und Gesichtsfehlbildung. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der Zebrafisch ein bequemes System ist das teratogene Potential von Nitrit zu studieren. Dieser Ansatz kann leicht für ihre Auswirkungen auf die frühe Entwicklung von Wirbeltieren zu testen, andere Chemikalien angepasst werden.

Einleitung

Teratogenese ist ein Prozess, der die normale Entwicklung des Embryos oder Fötus ^{1 durch} was zu dauerhaften strukturellen und funktionellen Störungen, Wachstumsverzögerung oder Fehlgeburt in schweren Fällen stört. Es kann durch bestimmte natürliche Substanzen (teratogen) hervorgerufen werden, die ^zwei in mehrfacher Hinsicht mit der embryonalen Entwicklung stören. Während menschliche fetale Entwicklung, gemeinsame Teratogenen wie Strahlung, Infektionserreger, toxische Metalle und organische Chemikalien berichtet Mängel in Epikanthus (die Hautfalte im oberen Augenlid) und Klinodaktylie (gekrümmte Finger oder Zehen) durch morphogenetische Fehler zu verursachen ^1.

den molekularen Mechanismus der teratogenesis zu verstehen, ist der erste Schritt zur Behandlung und Prävention zu entwickeln. Mehrere Wirbeltiermodellen wie dem afrikanischen Krallenfrosch (Xenopus laevis) und Zebrafisch (Danio rerio) verwendet worden, um die molekularen Signalwege betroffen zu bestimmen, indem teratOgens. Frühere Studien haben für Epidemiologie, Toxikologie und teratogenesis ^7.3 Zebrafisch als Modell verwendet. Scholz et al. betrachtet Zebrafisch als "Goldstandard" für Umwelttoxizität Beurteilung. Dies ist darauf zurückzuführen, zum Teil auf die Transparenz des Zebrafischembryo, die Forscher können die Entwicklungsdefekt sichtbar zu machen, wie es ⁸ auftritt. Etwa 70% der menschlichen Gene haben Orthologe im Zebrafisch, Zebrafisch macht eine wünschenswerte Wirbeltiermodell für die Untersuchung menschlicher Mängel ^9.

Einige epidemiologische Studien haben vorgeschlagen, dass Nitrat und Nitrit, üblicherweise in landwirtschaftlichen Lebensmitteln und Wasser, sind im Zusammenhang mit Geburtsschäden oder Fehlgeburten ^10,11, während andere Studien nicht unterstützen diese Verbindung ^12. Nitrat _{^{(NO 3 -)}} und Nitrit (NO _{^{2 -)}} sind von Natur aus in Boden und Wasser. Sie sind eine Stickstoffquelle für Pflanzen und sind ein Teil der nitrogen Zyklus ^13. Lebensmittel wie grüne Bohnen, Karotten, Kürbis, Spinat und Rüben aus Betrieben, die Düngemittel reich an Nitrat verwenden haben Gehalte für Nitrat und Nitrit ⁷ deutlich erweitert. Milch von Kühen mit hohen Nitrat Lebensmitteln und Fisch in hohen Nitrat Wasser (vor allem aus dem Boden Abfluss ³⁰⁾ zugeführt wird auf den Menschen führen große Mengen an Nitrat und Nitrit raub ^14. Nitrat und Nitrit sind auch häufig in der Lebensmittelkonservierung verwendet, die drastisch die Menge von Menschen eingenommen ¹² erhöht.

Die optimale Einsatzmenge von Nitrat und Nitrit spielen fundamentale Rolle bei physiologischen Prozessen wie vaskuläre Homöostase und Funktion, Neurotransmission und immunologische Abwehrmechanismen des Wirts ^13-15. Allerdings Exposition gegenüber hohen Nitrat und Nitrit kann zu Nebenwirkungen führen, vor allem bei Säuglingen und Kindern ^16. Ingested Nitrat ist weiter umgewandelt zu Nitrit in der Mundhöhle von der Mikroflora und in the Gastrointestinaltrakt durch Darmflora ^17.

Nitrat setzt Kleinkinder auf einem hohen Risiko für blaues Baby-Syndrom durch Oxidation von Hämoglobin zu Methämoglobin, Hämoglobin von seinem Sauerstoff beeinträchtigt Tragfähigkeit ^18. Daraus ergibt sich die blaue Farbe der Haut, die in schweren Fällen zu peripheren Geweben erstreckt. Gehemmt Sauerstoffversorgung der Gewebe führt zu anderen Symptomen, was am schwersten zu Koma und Tod ^19,20. Ähnliche Symptome sind bei Säuglingen und Erwachsenen bei höheren Konzentrationen an Nitrat ²¹ beobachtet. Erhöhte Konzentrationen von Methämoglobin bei Erwachsenen aufgrund Nitritvergiftung führt zu Zyanose, Kopfschmerzen, Atemstörungen ^{31 und} Tod, wenn nicht aufgrund von Komplikationen behandelt im Zusammenhang mit lebenswichtigen Gewebshypoxie ^32,33.

Nitrat auf höheren Ebenen eingenommen kann auch zu verschiedenen gesundheitlichen Komplikationen. Diabetes bei Kindern, wiederkehrender Durchfall, und wiederkehrenden Infektionen der Atemwegebei Kindern wurden mit hohen Nitrataufnahme ^11,17,22 verbunden. Die chronische Exposition zu einem hohen Niveau von Nitrat wird beim Wasserlassen und Milz Blutungen verbunden. Akute Hochdosis-Exposition gegenüber Nitrat kann im Stuhl und Urin, Ohnmacht und Tod ¹¹ auf ein breites Spektrum von Erkrankungen wie Bauchschmerzen, Muskelschwäche, Blut führen. Pränatalen Exposition gegenüber Nitrat auf hohem Niveau hat mit Neuralrohr und Muskel-Skelett-Defekt ¹¹ in Verbindung gebracht.

Ein kürzlich veröffentlichter Bericht zeigte, dass Zebrafischembryonen mit Nitrit Behandlung führte sac Ödeme, Gesichtsschädel und axiale Fehlbildungen zu Eigelb und Schwimmblase noninflation ^5. In dieser Studie zeigen wir ein Verfahren zur Behandlung Zebrafischembryonen mit Nitrat und Nitrit ihre teratogene Potential zu bestimmen. Die Embryonen wurden bei verschiedenen Konzentrationen und unterschiedlich lange ausgesetzt zu Nitrit. Ethanol wurde als positive Kontrolle verwendet, da es eine etablierte teratogen ²³ ist. Our Verfahren zeigten, dass sowohl hohe Konzentrationen und langen Belichtungszeiten zu Nitrit zu Überleben und führte zu verschiedenen Phänotypen, die von mild (Ödem) zu schweren (brutto Entwicklungsdefekten) schädlich waren. Daher ist der Zebrafisch ein nützliches Modell für direkt die möglichen teratogene Wirkungen von Nitrat und Nitrit an Embryonen zu erkunden epidemiologischen Studien zu ergänzen.

Protokoll

Die Verfahren in diesem Protokoll beschrieben wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Indiana University of Pennsylvania genehmigt.

1. Ernte Embryonen

1. Pflegen Zebrafisch bei 28,5 ° C, pH 7, Leitfähigkeit zwischen 500-1.500 uS, und ein Hell / Dunkel-Zyklus von 14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit ^24. Verwenden Wildtyp-Stämme, wie Di, AB oder TU / AB-Hybrid. Verschiedene Stämme können unterschiedlich auf chemische Behandlung ²⁵ reagieren.
2. Stellen Sie den Fisch bis zum Zusammenpassen der Nacht vor der Ernte Eier von Fischen System Wasser in einen passenden Behälter legen. Fügen Sie eine männliche und weibliche Fische in den Tank und trennen die beiden Fische mit einem Teiler. Jeder Fisch Paar wird eine Reihe von 50-300 Eier produzieren. Um sicherzustellen, dass genug Eier werden 30 Paare von Fischen hergestellt, eingerichtet. Typischerweise werden etwa 50% der Fische paarweise an der Blüte Paarungszeit (6-9 Monate alt) Eier produzieren, was bis zu 200 Eier pro Paar und ein Maximum von bis zu 3000 Eier für dieses Experiment.
3. Am nächsten Morgen, nachdem das Licht eingeschaltet wird, entfernen Sie die Trennlinie Paarung einzuleiten. Schauen Sie sich die passenden Behälter für Eier alle 15 min.
4. Sobald die Fischeier legen, ernten alle Embryonen ein Teesieb verwendet und sie in einen großen Behälter mit E3 Puffer kombinieren (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl _2, 0,33 mM _{MgSO 4).} Bei 1,5 HPF, entfernen und entsorgen unbefruchteten Eier mit einem Plastiktransferpipette unter einem Binokular. Unbefruchteten Eiern sind undurchsichtig, während befruchtete Eier sind transparent ^34.
5. Dann werden 50 Embryonen in einer 100 x 15 mm Glaspetrischale mit 50 ml E3-Puffer für jede Behandlung erhalten. Insgesamt 33 Gerichte werden für 11 Behandlungsbedingungen und 3 Wiederholungen benötigt.

2. Die Behandlung von Embryonen

1. Führen Sie Behandlungen bei 2 Stunden nach der Befruchtung (HPF) ^35. Inkubieren Embryonen / Larven bei 28,5 ° C und die Larven bei 120 HPF untersuchen. Führen Sie bei least drei Wiederholungen jeder Behandlungsbedingung für die statistische Analyse.
2. Für 3 Petrischalen (jeweils 50 Embryonen) in 2 HPF, entfernen Sie die E3-Puffer mit einer Transferpipette und 50 ml 300 mM Ethanol in der E3-Puffer hinzuzufügen. Decken Sie die Petrischalen mit Parafilm der Verdampfung von Ethanol zu minimieren.
   1. Weiter die Embryonen Aussetzen für 22 Stunden zu Ethanol. Dann entfernen Sie das Ethanol mit einer Transferpipette. 50 ml E3-Puffer und schwenken Sie die Schale mehrmals um das Ethanol zu waschen. Entfernen Sie diesen E3-Puffer mit einer Transferpipette und wiederholen Sie den Waschschritt 2 weitere Male.
3. Für 3 Petrischalen (jeweils 50 Embryonen) in 2 HPF, entfernen Sie die E3-Puffer mit einer Transferpipette und 50 ml neue Puffer E3 hinzuzufügen.
4. Für 9 Petrischalen (jeweils 50 Embryonen) in 2 HPF, entfernen Sie die E3-Puffer mit einer Transferpipette und 50 ml von 1.000 mg / l Natriumnitrit in der E3-Puffer gelöst. Bestätigen Sie die Konzentration der Stammnitritlösung vorher ein mitModifikation der Diazotierung (US-EPA-Methode 354.1) spektrophotometrische Methode ^28.
   1. Weiter dahinter 3 Gerichte für 46 Stunden, 3 Gerichte für 70 Stunden und 3 Gänge für 94 Stunden. Ersetzen Sie den Nitritlösung mit frisch zubereiteten Nitritlösung täglich.
   2. Nach jeder Belichtungszeit, entfernen Sie das Nitrit mit einer Transferpipette. 50 ml E3-Puffer und schwenken Sie die Schale mehrmals das Nitrit auszuwaschen. Entfernen Sie diesen E3-Puffer mit einer Transferpipette und wiederholen Sie den Waschschritt 2 weitere Male.
5. Für 3 Petrischalen (jeweils 50 Embryonen) in 2 HPF, entfernen Sie die E3-Puffer mit einer Transferpipette und 50 ml 200 mg / l Natriumnitrit hinzu. Wiederholen Sie dies mit 400, 600, 800 und 1000 mg / l Natriumnitrit.
   1. Weiter die Embryonen zu Nitrit für 70 Stunden ausgesetzt. Ersetzen Sie den Nitritlösung mit frisch zubereiteten Nitritlösung täglich.
   2. Nach der Einwirkzeit, entfernen Sie das Nitrit mit einer Transferpipette. 50 ml E3-Puffer und wirbeln die Schale mehrmal die Nitrit auszuwaschen. Entfernen Sie diesen E3-Puffer mit einer Transferpipette und wiederholen Sie den Waschschritt 2 weitere Male.
6. Für 3 Petrischalen (jeweils 50 Embryonen) in 2 HPF, entfernen Sie die E3-Puffer mit einer Transferpipette und 50 ml von 1.000 mg / l Natriumnitrat in der E3-Puffer gelöst. Bestätigen Sie die Konzentration der Stammnitratlösung eine Modifikation der Cadmium Reduktion (US-EPA-Methode 353.3) spektrophotometrische Methode ²⁸ vorher mit.
   1. Weiter die Embryonen zu Nitrat für 70 Stunden ausgesetzt. Ersetzen Sie den Nitratlösung mit frisch zubereiteten Nitratlösung täglich.
   2. Nach der Einwirkzeit, entfernen Sie das Nitrat mit einer Transferpipette. 50 ml E3-Puffer und schwenken Sie die Schale mehrmals den Nitrat auszuwaschen. Entfernen Sie diesen E3-Puffer mit einer Transferpipette und wiederholen Sie den Waschschritt 2 weitere Male.
7. Während jeden Tag der Exposition, zählen die Anzahl der toten Embryo / Larven ein Stereomikroskop. Zeichen des Todesgehören der Mangel an Herzschlag und Blutkreislauf, oder Mangel an Beweglichkeit nach 1 min der Beobachtung. Entfernen abgestorbene Embryonen / Larven mit einer Transferpipette Verunreinigung des E3-Puffer zu reduzieren.
8. Bei Experimenten bei 120 HPF zu beenden, einschläfern die Larven.
   1. Entfernen Sie die E3-Puffer mit einer Transferpipette. Anschließend werden 50 ml von 0,2% MS-222 (gepuffert auf pH 7) und für 10 Minuten warten.
   2. Entfernen Sie die MS-222 mit einer Transferpipette. 50 ml E3-Puffer und Wirbel um die MS-222 auswaschen.
   3. Entfernen Sie die E3-Puffer mit einer Transferpipette und 20 ml von 4% Paraformaldehyd (PFA), um die Larven zu beheben. Swirl das Gericht mehrmals. Verwenden Sie eine Transferpipette die Larven in einen Glaskolben übertragen zusammen mit genug PFA das Fläschchen zu füllen. Bewahren Sie die Fläschchen im Kühlschrank über Nacht (O / N).
9. Machen Sie Fotos von Fest Larven ein Stereoskop mit einer Digitalkamera. Verwenden Sie 30-facher Vergrößerung, ISO 200 und 200 ms Belichtungszeit. Richten Sie die Larven, so dass der vordere zum left und die Rücken ist an die Spitze des Feldes.

Ergebnisse

Die Exposition gegenüber 300 mM Ethanol für 22 h hatte keinen Effekt auf das Überleben (Daten nicht gezeigt) mit früheren Berichten konsistent ^5,23,26. Dies wird erwartet, da Ethanol eine bekannte teratogen ist und diente als Positivkontrolle. Die beobachteten Phänotypen enthalten pericardial Ödeme, Schwimmblase noninflation (Abbildung 1), Schädeldefekten und Entwicklungsverzögerung (Daten nicht gezeigt).

Diskussion

Das hier beschriebene Verfahren zeigt die Nützlichkeit von Zebrafisch in das teratogene Potential von Nitrit und Nitrat zu beurteilen. Im Vergleich zu anderen Wirbeltieren, Zebrafisch Vorteile haben, die hohe Fruchtbarkeit sind, externe Düngung, optische Transparenz und schnelle Entwicklung. Erhältlich Mutanten, die helfen Pigmentierung (wie die Casper ^{Zebrafisch-36)} auch fehlen, um die Sichtbarkeit der inneren Organe zu verbessern. Es ist auch einfach transgene Zebrafisch mit Reportergenen zu erzeugen Ana...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DREL/2010 instrument	Hach	26700-03
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
KIMAX glass Petri Dish	VWR	89001-244
MS-222	Sigma-Aldrich	E10521
NitraVer 5 Nitrate Reagent	Hach	14034-46
NitriVer 3 Nitrite Reagent	Hach	14065-99
Parafilm	Fisher Scientific	3-374-10
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
S6E stereomicroscope	Leica	10446294
Sodium nitrate	Fisher Scientific	S343
Sodium nitrite	Fisher Scientific	S347
Transfer pipets	Laboratory Products Sales	L320072
Glass vials	Fisher Scientific	03-338B