Peixe-zebra como um modelo para avaliar o potencial teratogênico de nitrito

Resumo

A exposição a teratógenos podem causar defeitos de nascimento. Os peixes-zebra são úteis para a determinação do potencial teratogénico de produtos químicos. Nós demonstrar a utilidade de peixe-zebra, expondo embriões para vários teores de nitritos e também em diferentes tempos de exposição. Mostramos que os nitritos podem ser tóxicos e causar graves defeitos do desenvolvimento.

Resumo

Altos níveis de nitrato no ambiente pode resultar em defeitos congênitos ou abortos espontâneos em humanos. Presumivelmente, isto deve-se a conversão de nitrato em nitrito pelas bactérias intestinais e salivares. No entanto, em outros estudos de mamíferos, altos níveis de nitrito não causar defeitos de nascimento, embora possam levar a resultados reprodutivos pobres. Assim, o potencial teratogénico de nitrito não é clara. Seria útil dispor de um sistema de modelo animal vertebrado para avaliar facilmente efeitos teratogénicos de nitrito ou qualquer outro produto químico de interesse. Aqui, nós demonstrar a utilidade de peixe-zebra (Danio rerio) para rastrear compostos para toxicidade e defeitos embrionárias. embriões de peixe-zebra são fertilizados externamente e ter um desenvolvimento rápido, o que os torna um bom modelo para estudos teratogênicos. Nós mostramos que o aumento do tempo de exposição ao nitrito afecta negativamente a sobrevivência. O aumento da concentração de nitrito também afecta adversamente a sobrevivência, enquanto que o nitrato não. Para tha embriõest sobreviver à exposição nitrito, vários defeitos podem ocorrer, incluindo pericárdio e gema de edema sac, nadar noninflation bexiga, e malformação craniofacial. Os nossos resultados indicam que o peixe-zebra é um sistema conveniente para estudar o potencial teratogénico de nitrito. Esta abordagem pode ser facilmente adaptada para testar outros produtos químicos para os seus efeitos sobre o desenvolvimento dos vertebrados precoce.

Introdução

Teratogénese é um processo que interrompe o desenvolvimento normal de um embrião ou feto por determinação de alterações funcionais e estruturais permanentes, retardamento do crescimento, ou aborto em casos graves ^1. Ela pode ser causada por certos agentes naturais (teratógenos), os quais interferem com o desenvolvimento embrionário de várias maneiras ^2. Durante o desenvolvimento fetal humano, teratogens comum, tais como a radiação, agentes infecciosos, metais tóxicos e químicos orgânicos foram relatados para causar defeitos de dobras epicanthic (a dobra de pele na pálpebra superior) e clinodactilia (dedo curvo ou pés) através de erros morfogenéticos ^1.

Compreender o mecanismo molecular de teratogenesis é o primeiro passo para o desenvolvimento de tratamento e prevenção. Vários modelos de vertebrados, tais como o sapo com garras Africano (Xenopus laevis) e peixe-zebra (Danio rerio) têm sido utilizados para determinar as vias moleculares afectadas por TeratOgens. Estudos anteriores têm usado peixe-zebra como um modelo para a epidemiologia, toxicologia e teratogenesis ^3-7. Scholz et ai. considerada peixe-zebra como um "padrão ouro" para a avaliação da toxicidade ambiental. Isto é devido, em parte, para a transparência do embrião do peixe-zebra, o que permite aos investigadores visualizar o defeito de desenvolvimento, uma vez que ocorre ^8. Aproximadamente 70% dos genes humanos ortólogos tem no peixe-zebra, fazendo com que um modelo de peixe-zebra vertebrado desejável para o estudo de defeitos humanos ^9.

Alguns estudos epidemiológicos têm sugerido que o nitrato e nitrito, comumente presente em alimentos agrícolas e água, estão associados a defeitos de nascimento ou abortos espontâneos ^10,11, enquanto outros estudos não suportam essa associação ^12. Nitrato _(NO3 ^-) e nitrito _(NO 2 ^-) estão naturalmente presentes no solo e na água. Eles são uma fonte de nitrogênio para as plantas e são uma parte do nciclo itrogen ^13. Alimentos como feijão verde, cenoura, abóbora, espinafre e beterraba de fazendas que usam fertilizantes ricos em nitrato de ter aumentado significativamente os níveis de nitrato e nitrito ^7. Leite de vacas alimentadas com alimentos à base de nitrato altos e peixes em água de alta nitrato (principalmente de escoamento do solo ³⁰⁾ pode levar a seres humanos que consomem grandes quantidades de nitrato e nitrito ^14. Nitratos e nitritos são também vulgarmente utilizados na conservação de alimentos, o que aumenta dramaticamente a quantidade ingerida pelo ser humano ^12.

Níveis óptimos de nitrato e nitrito desempenham papéis fundamentais em processos fisiológicos como a homeostase vascular e função, neurotransmissão e mecanismos de defesa do hospedeiro imunológicos ^13-15. No entanto, a exposição a altos níveis de nitrato e nitrito pode levar a efeitos adversos, especialmente em lactentes e ^crianças de 16. nitrato ingerido é ainda convertido em nitrito na cavidade oral e pela microflora no the trato gastrointestinal pela microflora intestinal ^17.

Nitrato coloca crianças em um alto risco para a síndrome do bebê azul por oxidação da hemoglobina em metemoglobina, prejudicando a hemoglobina a partir do seu transporte de oxigénio capacidade ^18. Isto resulta em que a cor azul da pele que se estende para os tecidos periféricos, em casos mais graves. Oxigenação inibido de tecidos resulta em outros sintomas, mais severamente levando a coma e morte ^19,20. Sintomas semelhantes são observados em bebés e adultos em concentrações mais altas de nitrato de ^21. Níveis elevados de metemoglobina em adultos devido a resultados de intoxicação de nitrito em cianose, dor de cabeça, distúrbios respiratórios ^31, e morte se não for tratada devido a complicações relacionadas com a hipóxia tecidual vital ^32,33.

Nitrato de ingerido em níveis mais elevados também pode resultar em várias complicações de saúde. diabetes infância, diarreia recorrente e infecções recorrentes do trato respiratórioem crianças têm sido relacionados com alta nitrato ^11,17,22 ingestão. A exposição crônica a um elevado nível de nitrato está associado com a micção e hemorragia do baço. Exposição aguda a doses elevadas de nitratos pode levar a um largo espectro de condições médicas tais como dor abdominal, fraqueza muscular, sangue nas fezes e urina, desmaios, e da morte ^11. A exposição pré-natal ao nitrato em níveis elevados tem sido associada a defeitos do tubo neural e músculo-esquelético ^11.

Um relatório recente mostrou que o tratamento de embriões de peixe-zebra com nitrito levou a gema edema sac, malformações craniofaciais e axiais, e nadar bexiga noninflation ^5. No presente estudo, nós demonstramos um método para o tratamento de embriões de peixes-zebra com nitrato e nitrito para determinar o seu potencial teratogénico. Os embriões foram expostos a nitrito em diferentes concentrações e em diferentes períodos de tempo. O etanol foi utilizado como um controlo positivo, uma vez que é um agente teratogénico ^estabelecido em 23. Our método mostraram que ambas as concentrações elevadas e longos tempos de exposição a nitrito eram prejudiciais à sobrevivência e resultou em vários fenótipos, variando de leve (edema) a graves defeitos de desenvolvimento (bruto). Portanto, o peixe-zebra é um modelo útil para explorar diretamente os potenciais efeitos teratogênicos de nitrato e nitrito em embriões para complementar os estudos epidemiológicos.

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Protocolo

Os procedimentos descritos neste protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade Indiana em Pensilvânia.

1. Os embriões de colheita

1. Manter peixe-zebra a 28,5 ° C, pH 7, condutividade entre 500-1,500 uS, e um ciclo de luz / escuridão de 14 horas de luz e 10 horas escuro ^24. Use estirpes do tipo selvagem, como a Turquia, AB ou TU / AB híbrido. Diferentes estirpes podem responder de forma diferente ao tratamento químico ^25.
2. Configure o peixe para o acasalamento na noite anterior ovos de colheita por adição de água sistema de peixe em um tanque de acasalamento. Adicione uma peixes machos e fêmeas no tanque e separar os dois peixes com um divisor. Cada par peixe vai produzir uma gama de 50-300 ovos. Para garantir que os ovos suficientes será produzido, criou 30 pares de peixes. Normalmente, cerca de 50% de pares de peixes em idade de acasalamento prime (6-9 meses de idade) vai produzir ovos, resultando até 200 ovos por par e um máximo de até 3, 000 ovos para esta experiência.
3. Na manhã seguinte, após a luz acende, remova o divisor para iniciar o acasalamento. Verifique os tanques de acasalamento para os ovos a cada 15 minutos.
4. Uma vez que os peixes põem ovos, colher todos os embriões utilizando um coador de chá e combiná-los em um recipiente grande com tampão E3 (NaCl 5 mM, KCl 0,17 mM, CaCl 0,33 _2, 0,33 mM MgSO _4). Em 1,5 hpf, remover e descartar ovos não fertilizados com uma pipeta de transferência de plástico sob um microscópio de dissecação. Ovos não fertilizados são opacas, enquanto ovos fertilizados são transparentes ^34.
5. Transferir 50 embriões numa placa de Petri de 100 x 15 mm de vidro contendo 50 ml de tampão de E3 para cada condição de tratamento. Um total de 33 pratos são necessários 11 para as condições de tratamento e 3 repetições.

2. Os embriões Tratar

1. Realizar tratamentos em 2 horas pós-fertilização (hpf) ^35. Incubar os embriões / larvas a 28,5 ° C e examinar as larvas em 120 hpf. Realizar pelo least três repetições de cada condição de tratamento para análise estatística.
2. Para 3 placas de Petri (cada um contendo 50 embriões) em 2 HPF, remover o tampão de E3 com uma pipeta de transferência e adicionar 50 ml de etanol a 300 mM em tampão diluída E3. Cobrir as placas de Petri com Parafilm para minimizar a evaporação do etanol.
   1. Continue expondo os embriões em etanol durante 22 h. Em seguida, remover o etanol com uma pipeta de transferência. Adicionar 50 ml de tampão E3 e agite o prato várias vezes para lavar o etanol. Remover este buffer E3 com uma pipeta de transferência e repita o passo de lavagem mais 2 vezes.
3. Para 3 placas de Petri (cada um contendo 50 embriões) em 2 HPF, remover o tampão de E3 com uma pipeta de transferência e adicionar 50 ml de tampão de novo E3.
4. Para placas de Petri de 9 (cada um contendo 50 embriões) em 2 HPF, remover o tampão de E3 com uma pipeta de transferência e adicionar 50 ml de 1,000 mg / L de nitrito de sódio dissolvido em tampão de E3. Confirmar a concentração da solução de nitrito de antemão usando ummodificação da diazotação (USEPA Método 354.1) método espectrofotométrico ^28.
   1. Continue expondo 3 pratos para 46 hr, 3 pratos para 70 horas e 3 pratos para 94 horas. Substitua a solução de nitrito com uma solução de nitrito acabado de fazer diariamente.
   2. Depois de cada tempo de exposição, remover o nitrito com uma pipeta de transferência. Adicionar 50 ml de tampão E3 e agite o prato várias vezes para lavar o nitrito. Remover este buffer E3 com uma pipeta de transferência e repita o passo de lavagem mais 2 vezes.
5. Para 3 placas de Petri (cada um contendo 50 embriões) em 2 HPF, remover o tampão de E3 com uma pipeta de transferência e adicionar 50 ml de 200 mg / L de nitrito de sódio. Repetir este com 400, 600, 800, e 1000 mg / L de nitrito de sódio.
   1. Continue expondo os embriões de nitrito por 70 h. Substitua a solução de nitrito com uma solução de nitrito acabado de fazer diariamente.
   2. Após o tempo de exposição, remover o nitrito com uma pipeta de transferência. Adicionar 50 ml de tampão E3 e agite o prato váriasvezes para lavar o nitrito. Remover este buffer E3 com uma pipeta de transferência e repita o passo de lavagem mais 2 vezes.
6. Para 3 placas de Petri (cada um contendo 50 embriões) em 2 HPF, remover o tampão de E3 com uma pipeta de transferência e adicionar 50 ml de 1,000 mg / L de nitrato de sódio dissolvido em tampão de E3. Confirmar a concentração da solução de nitrato de estoque de antemão, utilizando uma modificação da redução de cádmio (Método USEPA 353.3) ²⁸ método espectrofotométrico.
   1. Continue expondo os embriões em nitrato por 70 hr. Substitua a solução de nitrato com solução de nitrato acabado de fazer diariamente.
   2. Após o tempo de exposição, remover o nitrato com uma pipeta de transferência. Adicionar 50 ml de tampão E3 e agite o prato várias vezes para lavar o nitrato. Remover este buffer E3 com uma pipeta de transferência e repita o passo de lavagem mais 2 vezes.
7. Durante cada dia da exposição, contar o número de mortos embrião / larvas usando um microscópio estereoscópico. Sinais de morteincluem a falta de batimentos cardíacos e a circulação sanguínea, ou falta de motilidade após 1 min de observação. Remover mortos embriões / larvas com uma pipeta de transferência para reduzir a contaminação do tampão E3.
8. Quando experimentos acabar a 120 hpf, sacrificar as larvas.
   1. Remover o tampão de E3 com uma pipeta de transferência. Em seguida, adicione 50 ml de 0,2% MS-222 (tamponada a pH 7) e esperar por 10 min.
   2. Remover o MS-222 com uma pipeta de transferência. Adicionar 50 ml de tampão E3 e agite para lavar a MS-222.
   3. Remover o tampão de E3 com uma pipeta de transferência e adicionar 20 ml de 4% de paraformaldeído (PFA) para fixar as larvas. Agitar o prato várias vezes. Usar uma pipeta de transferência para transferir as larvas para um frasco de vidro, juntamente com PFA suficiente para encher o frasco. Armazenar os tubos no frigorífico durante a noite (O / N).
9. Tirar fotos de larvas fixo usando um estereoscópio com uma câmera digital. Use 30X ampliação, ISO 200, e 200 tempo de exposição ms. Orientar as larvas de modo que a anterior à lepé e dorsal é para o início do campo.

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Resultados

A exposição ao etanol de 300 mM durante 22 horas não teve nenhum efeito sobre a sobrevivência (dados não apresentados), consistente com relatos anteriores ^5,23,26. Isto é esperado, como o etanol é um agente teratogénico conhecido e serviu como um controlo positivo. Fenótipos observados incluíram edema pericárdico, noninflation bexiga natatória (Figura 1), defeitos craniofaciais, e atraso do desenvolvimento (dados não apresentados).

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Discussão

O método descrito aqui demonstra a utilidade do peixe-zebra na avaliação do potencial teratogênico de nitrito e nitrato. Em comparação com outros vertebrados, zebrafish têm vantagens que incluem alta fecundidade, fecundação externa, transparência óptica e rápido desenvolvimento. Os mutantes que carecem de pigmentação disponíveis (tais como o peixe-zebra) Casper ³⁶ também ajudam a aumentar a visibilidade dos órgãos internos. Também é fácil de gerar peixes-zebra transgénicos com genes rep?...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DREL/2010 instrument	Hach	26700-03
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
KIMAX glass Petri Dish	VWR	89001-244
MS-222	Sigma-Aldrich	E10521
NitraVer 5 Nitrate Reagent	Hach	14034-46
NitriVer 3 Nitrite Reagent	Hach	14065-99
Parafilm	Fisher Scientific	3-374-10
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
S6E stereomicroscope	Leica	10446294
Sodium nitrate	Fisher Scientific	S343
Sodium nitrite	Fisher Scientific	S347
Transfer pipets	Laboratory Products Sales	L320072
Glass vials	Fisher Scientific	03-338B