Method Article
Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.
Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.
קצב הסינון הגלומרולרי (GFR) הוא הפרמטר הטוב ביותר כדי להעריך את תפקוד הכליות הכוללת. תקן הזהב לקבוע GFR מסתמך על אישור שתן או פלזמה של סמני כליות אקסוגניים, כגון אינולין 1. עם זאת, נהלים אלה הם זמן רב ומורכב, המחייב את האוסף של דם סדרתי ו / או דגימות שתנו מבחני מעבדה אחוריות לניתוח שלה. בנוסף, שיטות אלה הנן פולשניות מלחיצות עבור בעלי החיים, הגבלה מספר פעמים ובאיזו תדירות המדידות ניתן לחזור. מספר גישות חלופיות פותחו כדי לפשט את ההליכים הקלסיים לקבוע GFR, אבל הם עדיין מסתמכים על דגימה שתן פלזמת 2-4 ו / או לדרוש הרדמה עמוקה 5,6, אשר ידוע להשפיע ופרמטרים המודינמיים כליות ותפקוד 7, 8. תוצרים של חילוף חומרים, כגון קריאטינין, גם נמצאים בשימוש נרחב כדי להעריך את תפקוד כליות. עם זאת, ידוע כי accurACY של סמנים אנדוגני אלה אינו אופטימלי, ויתרה מזאת, לנתח אותם, שתן או דגימת דם הוא גם הכרחי.
כאן אנו מתארים מתודולוגיה transcutaneous להעריך תפקוד כלייתי בחיות מודעות. שיטה זו היא פשוטה ומהירה מאשר שיטות מסורתיות כמו גם רק פולשנית. בעזרת טכניקה זו, באמצעות מכשיר אופטי מיניאטורי ואת isothiocyanate והעמסת סמן כליות אקסוגניים (FITC) -sinistrin, אפשר לקבוע תפקוד הכליות כמעט בזמן אמת ללא צורך פלזמה או דגימה שתן ללא צנתור כירורגית לניהול חומר. בשל תכונותיו אלה, השיטה מתאימה לביצוע מדידות סדרתיות באותה חיה.
FITC-sinistrin הוא סמן כליות מסוננים באופן חופשי על ידי glomerulus, ללא ספיגה חוזרת או הפרשת צינורי. החלק האופטי של המכשיר מיניאטורי מורכב משני דיודות פולטות אור (LED), בהן לרגשדה מרקר מנוהל פוטודיודה כדי לזהות את הקרינה הנפלטת דרך העור. הנתונים נרשמו מאוחסנים בזיכרון הפנימי המשולב במכשיר והם יכולים לשמש כדי ליצור עקומת קינטיקה חיסול FITC-sinistrin. חשמל מסופק על ידי סוללת ליתיום נטענת קטנה. לקבלת מידע מפורט יותר על מכשיר הרכיבים הבודדים שלה מתייחס שרייבר והאח '. 9. המכשיר מותקן בקלות על הגוף החי באמצעות תיקון דבק דו צדדי נושאת חלון שקוף עבור הרכיבים האופטיים. התוצאות זמינות לאחר תקופת ההקלטה נגמרה.
בשיטה והפרוטוקול הניתן כאן, אנו מציגים טכנולוגיה מבטיחה אשר יכול להחליף את תקן הזהב הנוכחי כדי לקבוע GFR, לא רק במחקר אלא גם בתחום הקליני.
ניסויי צורך לפתח את הפרוטוקול בוצעו על פי תקנות לאומיות ואושרו על ידי ועדת המדע האתית המקומית (Regierungspräsidium קרלסרוהה).
1. הכנת פתרון הזרקת FITC-sinistrin
2. הכנת בעלי חיים
3. התקן כנה
קיבוע 4. של ההתקן על בעלי החיים
מינהל 5. FITC-sinistrin ונוהל מדידה
הסרת התקן 6.
7. קראו מתוך נתונים
ההתקנה של מדידת transcutaneous היא מאוד פשוטה ומהירה: המכשיר ממוקם על התיקון הדבק דו-צדדי (איור 1) ומותאם בגודלם במידת צורך (איור 2), הסוללה מוכנה (איור 3) ומחוברת (איור 4).
שיטה זו כדי להעריך את תפקוד כליות תאומת כבר במינים שונים על ידי השוואה עם הגישה המסורתית של פינוי פלזמת 9,11,12. בעקבות הפרוטוקול נחשף כאן, שרייבר ואח '. הדגימו את תוקפו של טכניקה במודלים של עכברים שונים, מראה תוצאות דומות מאוד בקרב אישור המדידה פלזמה transcutaneous לכל הקבוצות שנחקרו (טבלה 1) 9. בעבודה זו לא השיגה 1/2 הוסב GFR באמצעות עכבר ספציפי למחצה אמפירי מרהגורם.
העקביות של ערכת transcutaneous של תפקוד כלייתי הוכחה גם באמצעות זנים שונים של עכברים. מדידות רצופות בתוך 3 ימים באותה החיה הראו מקדם של סטיות של 3.0-6.2% 13. במחקר זה לא היה מרת GFR אך התוצאות התבטאו ופרשו ישירות במונחים של t 1/2.
האפשרות לקבל את התוצאות כמעט בזמן אמת היא אחד היתרונות הגדולים של שיטה זו. לאחר תקופת ההקלטה, התוצאות זמינות מיידית לניתוח התוכנה המצורפת מציגה את עקומת הפרשת FITC-sinistrin מיידי (איור 6). בתוך אותה תוכנה יישומים ט 1/2 של FITC-sinistrin ניתן להשיג, אשר ניתן להשתמש בהם ישירות כפרמטר להעריך תפקוד כלייתי של המרה מבחינת GFR. איור 7 שמראה איך זה נראה עקום הפרשת FITC-sinistrin נמדד transcutaneously בבעל חיים עם אי ספיקה כלייתית. כאשר תפקוד כלייתי מושפע, FITC-sinistrin t 1/2 עליות בשל ההפרשה המופחתת של חומר ואת המראה של השינויים העקומים. בדרך כלל, העקומה נמדדת לא תחזור לרמת רקע ומציג שטח מוגבר מתחת לעקומה. באותה החיה, מדידות מראש כדי לאחר פציעה יכולות לחוות גידול בעוצמת הקרינה המרבית עקב הצטברות של הסמן נגרם על ידי ההפרשה המופחתת שלה. בנוכחותו של אי ספיקת כליות, העקומה נמדדת transcutaneously של sinistrin FITC יכול להראות למצב יציב בשל פגיעה בתפקוד קשה (איור 7).
השימוש במכשיר הזעיר בתוך מספר זנים של מכרסמים עם מצב בריאותי שונה הראה כי טכניקה זו מתאימה ורגישה מספיק כדי לזהות שינויי דue על מחלות כליה והזדקנות. טבלה 2 מציגה תמצית המודלים בעכברים למדו עד כה בשיטה זו.
באיור 1. מיקום של המכשיר על המדבקה הדבקה דו-צדדית. המכשיר הוא רכוב על מיצובה התיקון הדבק חלק האופטי שלה בחלון השקוף.
איור 2. התאמת התיקון הדבק מכרסמים קטנים. לשימוש בבעלי חיים קטנים מומלץ להקטין את הגודל של התיקון. ת: השתמש במכשיר כמדריך לחתוך את התיקון כראוי. B: לאחר לגודל הרצוי הושג, המכשיר יכול להיות ממוקם על פני השטח הדביקים של התיקון. Pלחכור לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הכנה איור 3. של הסוללה. כדי לצרף את הסוללה למכשיר, לחתוך חתיכה קטנה של תיקון דבק דו-צדדי (A ו- B) ומניחים אותו על פני השטח של הסוללה (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
חיבור איור 4. ומיקום של הסוללה במהלך המדידה. (א) מכרסמים קטנים כגון עכברים, בשל השטח המופחת, הסוללה חייבת להיות ממוקמת על גבי המכשיר. (ב) בעלי חיים גדולים יותר ג הסוללהלהציב ליד המכשיר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. מיקום של תחבושת גזת צינורי אלסטי חולדה. תחבושת צינורי צריכה לכסות את התיקון הדבק דו-צדדי מבלי להפריע לתנועה החופשית של הגפיים עבור הנוחות של החיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
תמונת נציג איור 6. עקומת חיסול FITC-sinistrin. האות שנוצרה על ידי FITC-sinistrin מזוהה transcuבו-זמנית ומאוחסן בזיכרון הפנימי של המכשיר. כאשר הנתונים שנרשמו הורדו על מחשב, התוכנה יוצרת עקומה דומה לזו שהוצגה בתמונה. ציר ה- Y מציג את עוצמת הקרינה רשמה [AU], נפלטת סמן FITC-sinistrin המוזרק, ואילו ציר ה- X מייצג את משך המדידה בזמן [דקות]. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תמונת נציג איור 7. בעקום חיסול FITC-sinistrin בחיות עם הפרעות בתפקוד הכליתי. (א) עקום חיסול FITC-sinistrin בחיות עם תפקוד כלייתי מופחת בדרך כלל מראה על שטח גדל מתחת לעקומה וחוסר היכולת להגיע לרמת הבסיס בתוך בתקופת מדידה נורמלית . (ב) בעלי חיים נפגעים קשה עקום נמדד transcutaneously יכול להראות למצב יציב אשר מצביע על כשל כליות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלת 1. אימות של מדידת transcutaneous ידי השוואה עם אישור הפלזמה המסורתי. מדידת transcutaneous של תפקוד כלייתי תאומתנה במודלים של עכברים שונים (בריא nephrectomized באופן חד-צדדי (UNX) C57BL / 6-129 SV עכברים במודל עכבר של nephronophthisis ( PCY)) על ידי השוואה עם אישור פלזמה. ערכים הם אמצעי ± SD. GFR, קצב הסינון הגלומרולרי 9.
/53767/53767table2.jpg "/>
מודלים טבלה 2. Murine ללמוד באמצעות מדידת transcutaneous UNX, באופן חד-צדדי nephrectomized.; ACE, אנזים המרת-אנגיוטנסין; T gumodwt / WT, בנוקאאוט uromodulin מהונדס, SD, עכברוש ספראג Dawley; PKD, מחלת כליות פוליציסטיות.
העיתון הנוכחי מתאר את ההליך כדי לקבוע תפקוד כליות אצל מכרסמים מודעים באמצעות מכשיר מיניאטורי ואת FITC-sinistrin סמן כליות אקסוגניים. כפי שנאמר קודם, יש בשיטה זו מספר יתרונות בהשוואה לנהלים המסורתיים של פינוי שתן פלזמה. אחד מהם הוא העצמאות מדגימת הדם ושתן אשר מובילה לחסכון רב במונחים של מוצרים צריכים, זמן, כמובן, מתח חיה.
כפי שניתן לראות בטבלה 2, סמן כליות אקסוגניים FITC-sinistrin ומדידת קינטיקה לחיסולה דרך העור לאפשר את ההשפעה של פתולוגיות כליות על תפקוד הכליות להיחקר 9,10,14-18. אוסף סדרה של דגימות דם נדרשו להעריך אישור פלזמה או סמנים ביולוגיים של מחלות כליה הן מלחיצים עבור החיה, מסורבלים ונדרש זמן רב עבור החוקרים. לכן, מדידות סדרתיות בתוך אותה החיה כבר הגוited ידי לרווחת החיות והסיבות מתודולוגית. שחזור בתוך-החיה הוכיחה מדידת transcutaneous 13 עושה את זה שיטה אידיאלית עבור גילוי שינויים בתפקוד כליות עקב התקדמות מחלה או הזדקנות. מאותה הסיבה, זה גם יכול להיות מאוד שימושי כדי ללמוד את האפקטיביות של גישות טיפוליות.
שני צעדים קריטיים עבור יישום מוצלח של טכנולוגיה זו הם הקיבוע של המכשיר האופטי על החיה והממשל הנכון של הסמן. המכשיר חייב להיות קבוע כראוי כדי למנוע חפצי תנועה. לשם כך, מניעת ההתקשרות והניתוק של התיקון הדבק דו צדדי חיונית כפי שהוא יכול להוביל לאובדן של התכונות הדבקות שלה ובסופו של דבר קיבעון הולם על החיה. כאמור בפרוטוקול, חוסר תנועה והגנה על מכשיר אופטי על ידי כיסוי אותו עם נייר דבק הוא גישה יעילה כדי להבטיח adequatקיבעון דואר. בעת ביצוע FITC-sinistrin הזרקת בולוס זה הוא חיוני כדי לנהל את כל החומר לווריד ולא תת-עורית. השחרור של הסמן בתוך הרקמה התת עורית ניתן לזהות בקלות על ידי טבעת צהובה מקיפה את הזנב של החיה המיוצר על ידי הצבע משלו של FITC-sinistrin. הזרקה תת עורית בדרך כלל באה לידי הביטוי עקום להחמיא זמן הפרשת סמן ממושך. המגבלה האפשרית של שיטה זו היא מפתח נוסף הקשורות למערכת הסמן בשימוש מאשר עם הטכנולוגיה כשלעצמה. כאשר בצקת קיימת בעור של חיה, הערכת transcutaneous של תפקוד כלייתי לא תהיה מומלצת, כפי שיש תא נוסף אשר יכול לשנות את דינמיקת הפרשת FITC-sinistrin. בדומה לכך, עור פיגמנט יכול להגביל את השימוש בטכניקה בשל ספקטרום העירור ופליטה החופף של FITC-sinistrin ו מלנין. עם זאת, אצל בעלי חיים עם פיגמנטציה בעור בטלאים, הבעיה נפתרת על ידי הנחת אופטיחלק של המכשיר באזור חסר צבע.
אפשר לשנות היבטים שונים של הערכה transcutaneous של התפקוד הכלייתי על-מנת להתאים את ההליך מיני בעלי חיים שונים ו / או גישות. לדוגמא, מינון FITC-sinistrin המומלץ או אורך המדידה יכול להיות מותאם בהתאם המטרה של הניסוי, כמו גם עבור מינים שונים או במודלים של בעלי חיים. הסתגלות זו של השיטה כבר אושרה על ידי היישום המוצלח שלה במינים שונים של מכרסמים וכמה סוגים של זנים עם מצבים בריאותיים מגוונים. בנוסף, הערכת transcutaneous של תפקוד כלייתי תאומת לאחרונה בכלבים וחתולים 12 עם תוצאות מצוינות. עקב ההבדלים שאינו מוטל בספק בין חיות ומכרסמים אלה, מחקר זה קבע את המינון המתאים של FITC-sinistrin עבור שניהם, כלבים וחתולים, והוא ביצע מחזיקים מעמד זמן רב מדידה, 4 שעות במקום השימוש 1 או 2 שעותד במכרסמים.
יחדיו, השימוש בטכניקה זו יכולה לעזור לנו לקבל תובנות מדויקות יותר נפרולוגיה, ובכלל זה הבנה טובה יותר של התקדמות מחלת כליות והשפעת טיפולים. המאפיינים של ערכת transcutaneous של תפקוד כלייתי ממקמים אותו כטכניקה מתאימה להיות מיושמת בתחומים קליניים בבני אדם ולשימוש וטרינרים בעתיד, ואת צריך להיחשב טכנולוגיה מבטיחה להחליף את הגישות המסורתיות.
NG מחזיקה בפטנט על ייצור של FITC-sinistrin.
ZHP was supported by the Marie-Curie project: NephroTools.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
NIC-Kidney device | Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH | Software, batteries and chargers are provided together with the device/s. Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com | |
FITC-sinistrin | Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH | Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com | |
Double-sided adhesive patch | Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH | Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com | |
Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
Isoflurane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
Leukosilk adhesive tape | BSN medical | 102200 | |
Tubular elastic gauze bandage | MaiMed Medical GmbH | 73012 | There are different sizes available. Size 1 is recommended for mice. |
Veet depilation cream | Reckitt Benckiser | PZN7768307 | Sensitive skin formulation is recommended as is more gentle with the skin of the animals |
Micro USB cable | Samsung | APCBU10BBE | |
Deltajonin Physiologic solution | AlleMan Pharma GmbH | 3366954 | Alternatively, it can be used saline or PBS |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved