コンシャスげっ歯類における腎機能の経皮評価

要約

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

要約

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

概要

糸球体濾過率（GFR）は、全体的な腎機能を評価するための最良のパラメータです。 GFRを決定するためのゴールドスタンダードは、イヌリン¹などの外因性腎マーカーの尿中または血漿クリアランスに依存しています。しかしながら、これらの手順は、分析のためにシリアル血液及び/又は尿サンプルの収集および後部室アッセイを必要とする、時間がかかり、複雑です。また、これらの方法は、測定が繰り返されることが可能な時間と周波数の数を制限する、動物のための侵襲的ストレスです。 ^代替のアプローチの数は、GFRを決定するための古典的な手続きを簡略化するために開発されてきたが、それらはまだ尿および血漿サンプル^2-4に依存し、および/ ​​または腎臓の血行動態機能^7に影響^を与えることが知られている深い麻酔^5,6、必要^8。例えば、クレアチニンなどの代謝の最終産物は、広く腎機能を推定するために使用されます。しかし、accurことが知られていますこれらの内因性マーカーのACYはまた、それらを分析するために、尿又は血液採取も不可欠であり、最適ではないと。

ここでは、意識のある動物に腎機能を評価するために経皮的方法論を説明します。この方法は、従来の方法と同様にのみ低侵襲性よりも簡単かつ高速です。小型化された光学素子と、外因性腎マーカーフルオレセインイソチオシアネート（FITC）-sinistrinを使用して、この技術では、血漿または尿サンプルおよび物質投与のための外科用カテーテルなし必要とせずに、ほぼリアルタイムでの腎機能を決定することが可能です。これらの特性には、この方法は、同じ動物において順次測定を行うのに適しています。

FITC-sinistrinは自由がない尿細管再吸収や分泌と、糸球体によってフィルタリング腎マーカーです。小型化された装置の光学部品は、励起する2つの発光ダイオード（LED）から成り投与マーカーフォトダイオードは、皮膚を介して放出される蛍光を検出します。記録されたデータは、デバイスに一体化内部メモリに格納され、それらは、FITC-sinistrin除去速度曲線を生成するために使用することができます。電力が小さいリチウム二次電池から供給されます。デバイスとその個々のコンポーネントの詳細についてはシュライバーら ⁹を参照してください。デバイスは、容易に光学部品のための透明な窓を搬送する両面接着パッチを使用して、動物の体に取り付けられています。記録期間が終わった後の結果は、容易に入手可能です。

ここで提供される方法およびプロトコルでは、我々は研究にも臨床の場だけでなく、GFRを決定するために、現在のゴールドスタンダードに取って代わる可能性が有望な技術をご紹介します。

プロトコル

プロトコルを開発するために必要な実験は、国の規制に従って実施し、地域の倫理科学委員会（Regierungspräsidiumカールスルーエ）によって承認されました。

FITC-sinistrin注射液の調製

1. ストック溶液を調製し、生理食塩水でFITC-sinistrinを溶解します。ラットでは5mg / 100gでBW FITC-sinistrinが好ましいが、マウスにおいて推奨される用量は、7.5ミリグラム/ 100g体重（BW）です。ラット40ミリグラム/ mlの濃度で調製しながらマウスで、15ミリグラム/ mlのFITC-sinistrinストック溶液の溶液を調製します。
   注：FITC-sinistrinストック溶液を予め調製し、遮光し、-20℃で保存することができます。

2.動物の準備

1. いずれの実験ではそれらの導入前に少なくとも1週間のために動物を順応させます。
2. 5 L /分のO _2、5％イソフルランを用いて動物を麻酔 2分間流します。
3. 動物が適切に遅いと深くなるその呼吸を観察することによって麻酔されていることを確認し、つま先の応答の欠如と不応答性を確認します。
4. 動物が眠っているしたら、2リットル/分のO ₂送達速度で2.5％イソフルランの麻酔を軽減し、BWを取ります。
5. 電気シェーバーを使用して、動物の背中の脇腹から毛皮を削除します。 3センチメートル×6センチ寸法を有する両面粘着パッチによって占有される領域よりもわずかに大きい面積を剃ります。
6. 続いて残りの毛皮を除去するために、短期間（2〜3分）のために脱毛クリームを適用します。
7. クリームが完全に除去されるまでクリーム自体が蛍光することができるよう、徹底的に洗います。
   注：それは刺激/浮腫を生成することができますように動物の皮膚に傷をつけないようにしてください。脱毛面積が皮膚に色素沈着を示している場合は、のための非着色スポットまで大きな面積を剃ります装置の光学部品が見出されます。麻酔の露出を最小限にするために、事前に24時間を剃ることをお勧めします。

3.デバイスの準備

1. 保護箔と反対の部分を残して透明窓（ 図1）上記の光学部品を位置決め、両面接着パッチの片面に腎機能を測定するために光学素子を配置します。
   注意：小さなげっ歯類を操作する場合は、図2に示すように、パッチのサイズを小さくしてください。
2. 図3に示すように、バッテリにマッチサイズの両面接着パッチの一枚を取り付けます。

動物でのデバイスの4固定

1. 動物の体重に基づいて、注入の適切な量を計算します。
2. 以前のセクション2.1から2.3に示すように、イソフルランで動物を麻酔。
3. 筒状の弾性ガーゼ包帯oの部分をカットF両面接着パッチの幅よりも長い約1cmを使用します。
4. 明らかに剃った領域を残して、その背中に動物と場所の頭の上に弾性ガーゼ包帯を引き出します。
   、代わりにのみ粘着テープを使用してデバイスを固定しますが、デバイス上の不当な圧力に注意してください 。 注意してください 。
5. デバイス上の対応するポートにバッテリコネクタを差し込むことにより、デバイスにバッテリーを接続します。その後、パッチの片から保護フォイルを取り外し、デバイス（ 図4A）の上面にバッテリーを搭載。電池が正しくデバイスが点滅していることを確認することにより、接続されていることを確認してください。
   注：ラットでは、電池はまた、次のデバイス（ 図4B）に、接着パッチ上に直接取り付けることができます。
6. 操作装置とパッチから保護カバーを取り外し、それを保持している動物の背中に毛を剃っ領域上に配置しますそれが正しく固定されるまで、sが縁。
7. パッチの接着面に付着した筒状の弾性ガーゼの包帯（ 図5）を備えたデバイスをカバーしています。
8. 適切に手足が自由に移動できることを確認して、動物の腹部に筒状包帯を伸ばします。
9. より優れた固定およびデバイスの保護のため、装置の形状次電池の配線を覆う粘着テープのストリップを適用します。
10. デバイスに圧力をかけることなく、1〜3分間のバックグラウンドを測定します

5. FITC-sinistrin管理と測定手順

1. 必要に応じて、注射またはすべての手順に沿って温度制御された加熱プレートの前に暖かい水を使用して、動物の尾を温めます。
2. FITC-sinistrin原液の適切な量尾静脈を介して注入します。注入量は、動物BWに依存し、したがって、それぞれの個々の短所のために計算されなければなりませんセクション1.1で上記の所望の投与量及びストック溶液の濃度を、idering。
3. すべてのFITC-sinistrinソリューションは、静脈内ではなく、皮下に投与されていることを確認してください。
   注：別の方法として、FITC-sinistrinは、事前に移植された静脈内カテーテルを用いて投与することができるげっ歯類またはマウスにおける眼窩注射を介して、首のうなじに終了しました。
4. それは運動アーチファクトを導入するように慎重に、強い動きやデバイス上の任意の圧力を回避し、そのホームケージに動物を返します。
5. 動物が乱されることを避けるために、穏やかな場所にホームケージを置きます。
6. マウス、2時間ラットを用いて作業している場合、少なくとも1時間の間に測定を行います。その期間中、光学装置は、皮膚を介してFITC-sinistrinが発する蛍光を測定します。
   注：記録期間中に動物を単独でホストされる必要があります。さらに、水の供給、ならびに突出このようなワイヤ蓋などの構造は、物体との衝撃に起因する電子機器の損傷や運動アーチファクトを回避するために除去しなければなりません。

6.デバイスの削除

1. 記録期間が終了すると、麻酔なしでデバイスを削除。必要な場合は、2分間、5 L / minのO ₂供給速度で5％イソフルラン下で簡単に動物を麻酔。
2. 慎重に、その後管状の包帯、第1の粘着テープをやってのけます。
3. 優しく皮膚から両面粘着パッチを切り離し、その通常のホームケージに動物を返します。

データのうち7.読みます

1. デバイスからバッテリーを取り外し、接着剤のパッチを削除。
   注：新しい測定が開始されるまでのデータがデバイスに保存されています。バッテリが接続されているときに記憶されたデータは、新しい記録に上書きされます。そのため、データをダウンロードする前に、バッテリーを再接続しないでくださいデバイス。バッテリーの不慮の再接続のために意図された10秒の猶予期間があります。
2. マイクロUSBケーブルを使ってPCにデバイスを接続し、付属のソフトウェアを使用してデータをダウンロードしてください。出力ファイルは、スプレッドシートプログラムで開くと変更することができる.csvファイルです。
3. 光学デバイスのための特定のソフトウェアとのデータファイルを開き、ソフトウェア・プロトコルを使用して除去動態曲線を生成します。
4. 光学デバイスに付属の説明書に従うことによって曲線を分析します。まもなく、データの評価のために、バックグラウンド信号は、前FITC-sinistrin管理を測定し、それぞれマウスおよびラットでは、通常、ボーラス注射後15分及び45分に発生マーカーの指数排泄相の開始をマーク設定。
   注：このソフトウェアは自動的に1-比較例により決定し、R ²値と共にFITC-sinistrin半減期（t _1/2）が表示されますtmentモデル。 T _1/2は、変換係数^9,10を用いてGFRを計算するために利用することができます。

結果

経皮的測定のセットアップは非常にシンプルで早いのが特長です：デバイスはバッテリーが用意され、両面接着パッチ（ 図1）上に配置し、（ 図2）必要に応じてサイズが調整されている（ 図3）と接続されている（ 図4）。

腎機能を評価するためのこの方法は、すでに血漿クリアランス^9,11,12の伝統的なアプローチとの比較により、異なる種で確認されています。ここで露出したプロトコルに続いて、シュライバーら 。すべてのグループが（ 表^{1）9 を}勉強するための経皮的測定および血漿クリアランスの間で非常に匹敵する結果を示し、異なるマウスモデルにおける技術の有効性を実証しました。この作業で得られたT _1/2は 、マウスの特定の半経験的変換を使用してGFRに変換しました。因子。

腎機能の経皮的評価の一貫性はまた、マウスの異なる系統を用いて証明されています。同じ動物で3日以内にシーケンシャル測定値は3.0から6.2パーセント¹³の分散の係数を示しました。本研究でありGFRへの変換ではなかったが、結果は発現し、T _1/2の点で直接解釈しました。

ほぼリアルタイムで結果を有する可能性は、この方法の大きな利点の一つです。記録期間の後、結果は、分析のためにすぐに利用可能であり、提供されるソフトウェアは、瞬時にFITC-sinistrinの排泄曲線（ 図6）が表示されます。同じソフトウェア内FITC-sinistrinのT _1/2を直接GFRに換算の腎機能を評価するためのパラメータとして使用することができる、得ることができる。 図7 は、それが腎機能障害を有する動物に経皮的に測定されたFITC-sinistrin排泄曲線をどのように見えるかを示しています。腎機能が影響を受けている、FITC-sinistrin tの原因物質の減少排泄、曲線の変化の出現に_1/2増加します。一般的に、測定曲線は、バック、バックグラウンドレベルまで来て、曲線下の増加面積を提示しません。同じ動物では、損傷後に前からの測定値は、その減少排泄によって引き起こされるマーカーの蓄積に最大蛍光強度の増加を体験することができます。腎不全の存在下では、FITC-sinistrinの経皮的測定曲線が原因で重度機能障害（ 図7B）に定常状態を表示することができます。

別の健康状態とのげっ歯類のいくつかの株で小型化されたデバイスの使用は、この技術をd、適切な変更を検出するのに十分な感度であることが示されていますUE腎疾患や老化に。 表2は、この方法でこれまでに研究されたマウスモデルの概要を示しています。

両面接着パッチの装置の図1の配置は、装置は、接着パッチの位置に透明な窓での光学部品が取り付けられています。

図2.小型のげっ歯類用接着パッチの適応は。小さな動物での使用のためには、パッチのサイズを小さくすることをお勧めします。 ：正しくパッチをカットするためのガイドとしてデバイスを使用してください。 B：所望のサイズが得られたら、装置は、パッチの粘着性表面上に配置することができる。 Pリースこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

バッテリーの図3.準備が。デバイスにバッテリーを取り付けるには、両面接着パッチ（A及びB）の小片をカットし、バッテリ（C）の表面上に置きます。 ご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。

測定時の電池の図4.接続と配置。（A）マウスのような小型の齧歯類では、減少による空間に、バッテリーは、装置の上部に配置する必要があります。 （B）より大きな動物では、電池Cデバイスの横に置かれる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ラットにおける管状弾性ガーゼ包帯の図5.配置。管状の包帯は、動物の快適さのために手足の自由な移動を妨害することなく、両面接着パッチをカバーする必要があります。 の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。

FITC-sinistrinの脱離曲線の図6.代表的画像。FITC-sinistrinによって生成された信号は、トランスキューを検出しましたtaneouslyデバイスの内部メモリに格納されています。記録されたデータをPCにダウンロードされる場合、ソフトウェアは、画像中に提示されている1つに相当する曲線を生成します。 X軸は時間[分]で測定時間を表すY軸は、注入されたFITC-sinistrinマーカーによって放出された記録蛍光強度[AU]を、示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

腎機能障害を有する動物におけるFITC-sinistrinの脱離曲線の図7.代表的画像。（A）腎機能低下を有する動物におけるFITC-sinistrin除去曲線は、典型的には、内のベースラインに到達するために曲線とできないことの下の増加面積を示しています通常の測定期間 。 （B）重度障害のある動物に経皮的測定曲線は、腎不全を示し、定常状態を表示することができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

伝統的な血漿クリアランスと比較することにより、経皮的測定の 表1 の検証。腎機能の経皮的測定は、異なるマウスモデルで検証された（健康と一方的に（UNX）C57BL / 6から129 SVマウスとnephronophthisisのマウスモデルを（摘出血漿クリアランスとの比較によるPCY））。値は平均±SDです。 GFR、糸球体濾過率^9。

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表2マウスモデルは、経皮的測定を用いて研究 UNX、一方の腎臓を摘出。 ACE、アンジオテンシン変換酵素; T ^{gumodwt /重量} 、トランスジェニックウロモジュリンノックアウト、SD、スプラーグドーリーラット; PKD、多発性嚢胞腎疾患。

ディスカッション

本稿では、小型化、デバイスおよび外因性腎マーカーFITC-sinistrinを使用して、意識的なげっ歯類で腎機能を決定するための手順を説明します。前に述べたように、この方法は、尿および血漿クリアランスの従来の手順と比較していくつかの利点を有します。その一つは、動物のストレスを消耗、時間的に大きな節約につながると、当然の血液および尿サンプルからの独立です。

表2に示されるように、外因性腎マーカーFITC-sinistrinと皮膚を通してその除去速度の測定は、腎臓機能の腎病変の影響は^{9,10,14-18を}研究することを可能にします。血漿クリアランスまたは腎疾患のバイオマーカーを評価するために必要な血液試料の直列コレクションは、動物のためのストレス面倒で時間のかかる研究のためのものです。そのため、同じ動物内のシーケンシャル測定がLIMされています動物や方法論的な理由の福祉によってited。経皮的測定¹³の証明内の動物の再現性は、それにより、疾患の進行や老化に腎機能の変化を検出するための理想的な方法になります。同じ理由で、また、治療法の有効性を研究するために非常に有用であり得ます。

この技術の成功のアプリケーションのための2つの重要なステップは、動物上の光学素子と、マーカーの正しい投与を固定しています。デバイスが適切に運動アーチファクトを回避するために修正する必要があります。それは、動物への接着性の損失、最終的に不適切な固定をもたらすことができるように、その目的のために、両面接着パッチの着脱を防止することが重要です。プロトコルで述べたように、粘着テープで覆うことにより固定化し、光学素子の保護adequatを確保するために有効なアプローチでありますE固定。 FITC-sinistrinボーラス注入を行う際には、静脈内ではなく、皮下、すべての物質を投与することが重要です。皮下組織中のマーカーの放出が容易にFITC-sinistrin自身の色によって生成された動物の尾を周回黄色のリングによって同定することができます。皮下注射は、一般的に平坦曲線と長期のマーカー排泄時間として現れます。この方法の可能な制限は、技術そのものよりも使用されるマーカーに複数の関連です。浮腫は、動物の皮膚に存在する場合、FITC-sinistrinの排泄動態を変化させることができ、追加の区画があるので、腎機能の経皮的評価は、推奨されないであろう。同様に、色素沈着した皮膚は、FITC-sinistrinとメラニンの重複励起および発光スペクトルに起因する技術の使用を制限することができます。しかし、パッチで皮膚の色素沈着を持つ動物で、問題は光を配置することによって解決されます。無着色領域内のデバイスの一部。

異なる動物種及び/又はアプローチする手順を適合させるために腎機能の経皮的評価のさまざまな側面を変更することが可能です。例えば、推奨FITC-sinistrin用量または測定の長さは、実験、ならびに異なる種または動物モデルの目標に応じて調節することができます。この方法の適応性は、既にげっ歯類、様々な健康状態を有する株のいくつかの種類の異なる種での成功したアプリケーションによって確認されています。また、腎機能の経皮的評価は、最近、優秀な成績で犬や猫¹²で検証されています。これらの動物とげっ歯類の間の紛れもない差のために、この研究では、イヌおよびネコの両方のためのFITC-sinistrinの適切な用量を決定し、それが時間を測定はるかに長いを行う、4時間の代わりに、1または2時間の使用げっ歯類中のd。

まとめると、私たちを助けることができるこの技術の使用は、腎疾患の進行の理解と治療の効果を含め、腎臓病でより正確な洞察を得るために。腎機能の経皮的評価の特徴は、将来的にはヒトおよび動物の臨床分野に適用されるのに適した技術としてそれを置き、伝統的なアプローチを置き換えるために有望な技術として考慮されるべきです。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
NIC-Kidney device	Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH		Software, batteries and chargers are provided together with the device/s. Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com
FITC-sinistrin	Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH		Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com
Double-sided adhesive patch	Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH		Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com
Isis Rodent electric shaver	Braun Aesculap	GT420
Isoflurane	Abbott GmbH	PZN4831850
Leukosilk adhesive tape	BSN medical	102200
Tubular elastic gauze bandage	MaiMed Medical GmbH	73012	There are different sizes available. Size 1 is recommended for mice.
Veet depilation cream	Reckitt Benckiser	PZN7768307	Sensitive skin formulation is recommended as is more gentle with the skin of the animals
Micro USB cable	Samsung	APCBU10BBE
Deltajonin Physiologic solution	AlleMan Pharma GmbH	3366954	Alternatively, it can be used saline or PBS