Évaluation transcutanée de la fonction rénale dans Rongeurs Conscious

Résumé

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

Résumé

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

Introduction

le taux de filtration glomérulaire (DFG) est le meilleur paramètre pour évaluer la fonction rénale globale. L'étalon-or pour déterminer GFR repose sur la clairance urinaire ou plasmatique de marqueurs rénaux exogènes, tels que l' inuline ^1. Cependant, ces procédures sont longues et complexes, ce qui nécessite la collecte de sang en série et / ou des échantillons d'urine et des tests de laboratoire postérieur pour son analyse. En outre, ces procédés sont invasifs et stressante pour l'animal, ce qui limite le nombre de temps et de fréquence dans laquelle les mesures peuvent être répétées. Un certain nombre d'approches alternatives ont été développées pour simplifier les procédures classiques pour déterminer GFR, mais ils comptent encore sur l' urine et le plasma échantillonnage ^2-4 et / ou nécessiter une anesthésie profonde ^5,6, qui est connu pour influencer l' hémodynamique et la fonction rénale ^{7, 8.} Produits finaux du métabolisme, tels que la créatinine, sont également largement utilisés pour estimer la fonction rénale. Toutefois, il est connu que la AccurAcy de ces marqueurs endogènes est pas optimale et, par ailleurs, de les analyser, d'urine ou de prélèvement de sang est également indispensable.

Nous décrivons ici une méthode transcutanée pour évaluer la fonction rénale chez des animaux conscients. Ce procédé est plus simple et plus rapide que les méthodes traditionnelles ainsi que minimalement invasive. Avec cette technique, à l'aide d'un dispositif optique miniaturisée et le rein marqueur isothiocyanate de fluorescéine (FITC) -sinistrin exogène, il est possible de déterminer la fonction rénale presque en temps réel, sans qu'il soit nécessaire pour le plasma ou l'urine d'échantillonnage et sans cathétérisation chirurgicale pour l'administration d'une substance. Grâce à ces caractéristiques, le procédé est adapté pour effectuer des mesures successives dans le même animal.

FITC-sinistrine est un marqueur rénale librement filtré par le glomérule, sans réabsorption tubulaire ou de sécrétion. La partie optique du dispositif miniaturisé est constitué de deux diodes électroluminescentes (DEL), qui excitentle marqueur est administré et une photodiode pour détecter la fluorescence émise à travers la peau. Les données enregistrées sont stockées dans la mémoire interne intégré dans le dispositif et ils peuvent être utilisés pour générer la courbe de cinétique d'élimination FITC-sinistrine. L'alimentation est fournie par une petite pile au lithium rechargeable. Pour plus d' informations sur l'appareil et ses composants individuels se référer à Schreiber et al. ^9. Le dispositif est facilement monté sur le corps de l'animal à l'aide d'un patch adhésif double face portant une fenêtre transparente pour les composants optiques. Les résultats sont facilement disponibles après la période d'enregistrement est terminée.

Avec la méthode et le protocole fourni ici, nous introduisons une technologie prometteuse qui pourrait remplacer l'étalon-or en cours pour déterminer GFR, non seulement dans la recherche mais aussi dans le domaine clinique.

Protocole

expériences nécessaires pour développer le protocole ont été réalisées conformément aux réglementations nationales et ont été approuvés par le comité scientifique d'éthique local (Regierungspräsidium Karlsruhe).

1. Préparation de la solution d'injection de FITC-sinistrine

1. Dissoudre FITC-sinistrine dans du sérum physiologique pour préparer une solution de stock. La dose recommandée chez la souris est de 7,5 mg / poids corporel 100 g (BW), tandis que chez les rats 5 mg / 100 g BW-FITC sinistrine est préférable. Pour les souris, préparer une solution de solution mère FITC-sinistrine à 15 mg / ml, tandis que pour les rats préparer à une concentration de 40 mg / ml.
   Remarque: la solution mère FITC-sinistrine peut être préparé à l' avance et stocké à -20 ° C à l' abri de la lumière.

2. Préparation des animaux

1. Acclimate animaux pendant au moins une semaine avant leur introduction dans toute expérience.
2. Anesthésier l'animal en utilisant 5% d' isoflurane à 5 L / min de O ₂ Circuler pendant 2 min.
3. Assurez-vous que l'animal est correctement anesthésié en observant sa respiration, qui devient plus lent et plus profond, et vérifier l'absence de réponse à une absence de réponse de l'orteil.
4. Une fois que l'animal est endormi, réduire l'anesthésie à 2,5% d' isoflurane à O taux de livraison de 2 L / min ₂ et prendre le BW.
5. Retirer la fourrure du flanc du dos de l'animal à l'aide d'un rasoir électrique. Rasez une zone légèrement plus grande que la zone qui sera occupée par le patch adhésif double face, qui a des dimensions de 3 cm x 6 cm.
6. appliquer ensuite la crème dépilatoire pour une courte période (2-3 min) pour éliminer les poils restants.
7. Laver soigneusement la région jusqu'à ce que la crème a été complètement enlevé, comme la crème elle-même peut être fluorescent.
   Remarque: Évitez de vous gratter la peau de l'animal , car il peut produire une irritation / oedème. Si la zone épilée montre la pigmentation de la peau, de se raser une plus grande zone jusqu'à un endroit non pigmentée pour laune partie optique du dispositif se trouve. Il est recommandé de se raser 24 heures à l'avance pour minimiser l'exposition anesthésie.

3. Dispositif de préparation

1. Placer le dispositif optique pour mesurer la fonction rénale sur un côté du patch adhésif double face, le positionnement de la partie optique au- dessus de la fenêtre transparente (figure 1) en laissant la partie opposée à la feuille de protection.
   Note: Lorsque l'on travaille avec de petits rongeurs, de réduire la taille du patch , comme illustré sur la figure 2.
2. Fixer une feuille de recto-verso patch adhésif de la taille correspondant à la batterie , comme illustré sur la figure 3.

4. Fixation de l'appareil sur l'animal

1. Calculer le volume approprié d'injection sur la base du poids corporel de l'animal.
2. Anesthetize l'animal avec de l'isoflurane comme indiqué précédemment sur les sections 2.1-2.3.
3. Coupez un morceau de gaze tubulaire élastique bandage of environ 1 cm de longueur supérieure à la largeur de la pastille adhésive double face pour être utilisés.
4. Tirez sur la bande de gaze élastique sur la tête de l'animal et le placer sur son dos, en laissant la zone rasée à découvert.
   Remarque: Vous pouvez également fixer le dispositif en utilisant uniquement du ruban adhésif, mais être conscient de la pression excessive sur l'appareil.
5. Connecter la batterie à l'appareil en branchant le connecteur de la batterie au port correspondant sur le périphérique. Après cela , retirer la feuille de protection de la pièce de patch et monter la batterie sur la surface supérieure du dispositif (figure 4A). Assurez-vous que la batterie est correctement branché en vérifiant que l'appareil se met à clignoter.
   Remarque: Chez le rat, la batterie peut également être fixé directement sur ​​la pastille adhésive, à côté du dispositif (figure 4B).
6. Retirez le couvercle de protection de la pièce avec le dispositif de commande et placez-le sur la zone rasée sur le dos de l'animal le tenants bords jusqu'à ce qu'il soit correctement fixé.
7. Recouvrir le dispositif avec le bandage de gaze tubulaire élastique adhérant à la surface adhésive de la pièce (figure 5).
8. Étirer correctement la bande tubulaire sur l'abdomen de l'animal, en veillant à ce que les branches peuvent se déplacer librement.
9. Pour une meilleure fixation et la protection du dispositif, appliquer une bande de ruban adhésif suivant la forme du dispositif et recouvrant les fils de la batterie.
10. Mesurer fond pour 1 à 3 min, sans exercer de pression sur le dispositif

Administration 5. FITC-sinistrine et de la procédure de mesure

1. Si nécessaire, chauffer la queue de l'animal à l'eau chaude avant l'injection ou une plaque chauffante à température contrôlée le long de toute la procédure.
2. Injecter par veine de la queue le volume approprié de solution FITC-sinistrine stock. Le volume d'injection dépend BW animale et doit donc être calculée pour chaque contre individuelsidering la dose souhaitée et la concentration de la solution mère, précédemment mentionnés à l'article 1.1.
3. Assurez-vous que toute la solution FITC-sinistrine est administré par voie intraveineuse et non sous-cutanée.
   Remarque: En variante, FITC-sinistrine peut être administré au moyen d' un cathéter intraveineux de pré-implantation est sorti à la nuque du cou chez des rongeurs ou par injection rétro - orbital des souris.
4. Soigneusement, retourner l'animal à sa cage en évitant des mouvements forts et toute pression sur le dispositif, car il introduirait des artefacts de mouvement.
5. Placez la cage dans un endroit calme pour éviter que l'animal est perturbé.
6. Effectuez la mesure pendant au moins 1 h si l'on travaille avec des souris et 2 h en utilisant des rats. Pendant cette période, le dispositif optique mesurera à travers la peau la fluorescence émise par FITC-sinistrine.
   Remarque: Au cours de la période d'enregistrement de l'animal doit être hébergé seul. En outre l'alimentation en eau, ainsi que protubérantdes structures telles que les couvercles de fils, doivent être retirés pour éviter d'endommager des artefacts de l'appareil et de mouvement électroniques en raison des impacts avec des objets.

Retrait 6. Device

1. Une fois la période d'enregistrement est terminée, retirez le périphérique sans anesthésie; Cependant, si nécessaire, anesthésier l'animal brièvement sous 5% d' isoflurane à / min , débit de distribution 5 L O ₂ pendant 2 min.
2. Avec précaution, retirez le ruban adhésif, puis le bandage tubulaire.
3. détachez délicatement le patch adhésif double face de la peau et de retourner l'animal dans sa cage à la maison normale.

7. Lire sur des données

1. Débranchez la batterie de l'appareil et retirer le patch adhésif.
   Note: Les données sont stockées sur l'appareil jusqu'à ce qu'une nouvelle mesure commence. Quand une batterie est connectée les données stockées sont écrasées par les nouveaux enregistrements. Par conséquent, ne pas rebrancher la batterie avant de télécharger les données de ladispositif. Il y a une période de grâce de 10 sec destinée à reconnexions accidentelle de la batterie.
2. Connectez l'appareil à un PC via un câble micro USB et télécharger les données en utilisant le logiciel fourni. Le fichier de sortie est un fichier .csv qui peut être ouvert et modifié avec un programme de feuille de calcul.
3. Ouvrez le fichier de données avec le logiciel spécifique pour le dispositif optique et de générer la courbe de la cinétique d'élimination en utilisant les protocoles de logiciels.
4. Analyser la courbe en suivant les instructions fournies avec le dispositif optique. Peu de temps pour l'évaluation des données, régler le signal de fond mesuré l'administration FITC sinistrine avant et marquer le début de la phase d'excrétion exponentielle du marqueur, ce qui se produit habituellement 15 min et 45 min après l'injection d'un bol, chez la souris et le rat, respectivement, .
   Remarque: Le logiciel affiche automatiquement la demi-vie FITC-sinistrine (t _1/2) avec une valeur R ^2, déterminée par un 1-comparmodèle timent. t _1/2 peut être utilisé pour calculer GFR en utilisant un facteur de conversion ^9,10.

Résultats

La configuration de la mesure transcutanée est très simple et rapide: le dispositif est placé sur le patch adhésif double face (Figure 1) et ajusté en taille si nécessaire (Figure 2), la batterie est préparée (figure 3) et connecté (Figure 4).

Cette méthode pour évaluer la fonction rénale a déjà été validée dans des espèces différentes par rapport à l'approche traditionnelle de la clairance plasmatique ^9,11,12. En suivant le protocole exposé ici, Schreiber et al. démontré la validité de la technique dans différents modèles de souris, montrant des résultats très comparables entre la mesure et la clairance plasmatique transcutanée pour tous les groupes étudiés (tableau 1) ^9. Dans ce travail , le t obtenu _1/2 a été converti en GFR utilisant une souris de conversion semi-empirique spécifiquefacteur.

La cohérence de l'évaluation transcutanée de la fonction rénale a été également prouvé en utilisant différentes souches de souris. La mesure séquentielle dans les 3 jours chez le même animal a montré un coefficient de variance de 3,0 à 6,2% ^13. Dans cette étude , il n'y avait pas de conversion à GFR mais les résultats ont été exprimés et interprétés directement en termes de t _1/2.

La possibilité d'avoir des résultats presque en temps réel est l'un des grands avantages de cette méthode. Après la période d'enregistrement, les résultats sont immédiatement disponibles pour l' analyse et le logiciel fourni pour afficher la courbe d'excrétion de FITC-sinistrine instantanément (figure 6). Au sein du même logiciel , le t _1/2 de FITC-sinistrine peut être obtenu, qui peut être directement utilisée comme paramètre pour évaluer la fonction rénale de la transformée en termes de DFG. Figure 7 montre comment il regarde la courbe d'excrétion FITC-sinistrine mesurée transcutanée chez un animal présentant une insuffisance rénale. Lorsque la fonction rénale est affectée, FITC-sinistrine t _1/2 augmente en raison de l'excrétion réduite de la substance et l'apparition de la courbe change. En règle générale, la courbe mesurée ne revient pas au niveau de fond et présente une superficie accrue sous la courbe. Dans le même animal, les mesures de pré à post-traumatique peuvent connaître une augmentation de l'intensité de fluorescence maximale due à l'accumulation du marqueur provoquée par son excrétion réduite. En présence d' une insuffisance rénale, la courbe transcutanée mesurée de FITC-sinistrine peut montrer un état ​​stable en raison d' une grave altération de la fonction (figure 7B).

L'utilisation du dispositif miniaturisé dans plusieurs souches de rongeurs avec l'état de santé différents a montré que cette technique est appropriée et suffisamment sensible pour détecter les changements due à la maladie rénale et le vieillissement. Le tableau 2 présente un résumé des modèles murins étudiés à ce jour avec cette méthode.

Figure 1. Mise en place du dispositif sur le patch adhésif double face. Le dispositif est monté sur le patch positionnement adhésive sa partie optique dans la fenêtre transparente.

Figure 2. Adapter le patch adhésif pour de petites rongeurs. Pour une utilisation dans les petits animaux , il est recommandé de réduire la taille du patch. A: Utilisez l'appareil comme un guide pour couper le patch correctement. B: Une fois la taille désirée a été obtenue, le dispositif peut être placé sur la surface collante du patch. Plocation cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Préparation de la batterie. Pour fixer la batterie à l'appareil, couper un petit morceau de timbre adhésif double face (A et B) et le placer sur la surface de la batterie (C). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une une plus grande version de ce chiffre.

Figure 4. Connexion et mise en place de la batterie pendant la mesure. (A) dans de petits rongeurs tels que les souris, en raison de l'espace réduit, la batterie doit être placée sur le dessus de l'appareil. (B) Dans les plus gros animaux de la batterie cun être placé à côté de l'appareil. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. Mise en place de la bande de gaze élastique tubulaire dans un rat. Le bandage tubulaire devrait couvrir le patch adhésif double face , sans interférer avec la libre circulation des membres pour le confort de l'animal. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande ce chiffre.

Figure 6. Représentant l' image d'une courbe d'élimination du FITC-sinistrine. Le signal généré par FITC-sinistrine est détecté transcutanément et stockées dans la mémoire interne de l'appareil. Lorsque les données enregistrées sont téléchargées sur un ordinateur, le logiciel génère une courbe comparable à celui présenté dans l'image. Axe Y montre l'intensité enregistrée par fluorescence [UA], émis par le marqueur FITC-sinistrine injecté, tandis que l' axe des X représente la durée de la mesure dans le temps [min]. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7. Représentant l' image d'une courbe d'élimination du FITC-sinistrine chez les animaux atteints d' insuffisance rénale. (A) courbe d'élimination FITC-sinistrine chez les animaux ayant une fonction rénale réduite montre généralement une augmentation de la superficie sous la courbe et de l' incapacité d'atteindre la ligne de base dans le période de mesure normale . (B) Chez les animaux gravement déficients la courbe transcutanée mesurée peut montrer un état ​​stable qui indique une insuffisance rénale. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1. Validation de la mesure transcutanée en comparant avec la clairance plasmatique traditionnelle. La mesure transcutanée de la fonction rénale a été validée dans différents modèles de souris (santé et unilatéralement néphrectomie (UNX) C57BL / 6-129 SV souris et modèle de souris de nephronophthisis ( pcy)) par rapport à la clairance plasmatique. Les valeurs sont des moyennes ± SD. GFR, le taux de filtration glomérulaire ^9.

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Tableau 2. Les modèles murins étudiés en utilisant la mesure transcutanée UNX, unilatéralement néphrectomie. ACE, l'enzyme de conversion de l'angiotensine; T ^{gumodwt / poids,} transgénique uromodulin KO, SD, Sprague Dawley; PKD, maladie polykystique des reins.

Discussion

Le présent document décrit la procédure pour déterminer la fonction rénale chez les rongeurs conscients à l'aide d'un dispositif miniaturisé et le marqueur rénale FITC-sinistrine exogène. Comme indiqué précédemment, ce procédé présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes traditionnelles de la clairance urinaire et plasmatique. L'un d'eux est l'indépendance du sang et de l'urine d'échantillonnage qui conduit à des économies en termes de consommables, de temps et, bien sûr, le stress des animaux.

Comme on le voit dans le tableau 2, le marqueur FITC rénale sinistrine exogène et la mesure de la cinétique d'élimination à travers la peau permettent l'incidence de pathologies rénales sur la fonction rénale à étudier ^9,10,14-18. La collection série d'échantillons de sang nécessaires pour évaluer la clairance ou biomarqueurs de la maladie rénale plasma sont stressant pour l'animal, lourd et fastidieux pour les chercheurs. Par conséquent, les mesures séquentielles dans le même animal ont été limité par le bien-être des animaux et des raisons méthodologiques. La reproductibilité établie dans animale de la mesure transcutanée ¹³ en fait une méthode idéale pour détecter les changements dans la fonction rénale en raison de la progression ou le vieillissement maladie. Pour la même raison, il peut aussi être extrêmement utile pour étudier l'efficacité des approches thérapeutiques.

Deux étapes essentielles pour une application réussie de cette technologie sont la fixation du dispositif optique sur l'animal et l'administration correcte du marqueur. Le dispositif doit être fixé de manière appropriée pour éviter des artefacts de mouvement. A cet effet, ce qui empêche l'attachement et le détachement du patch adhésif double face est cruciale car elle peut conduire à la perte de ses propriétés adhésives et, finalement, une fixation inappropriée sur l'animal. Comme mentionné dans le protocole, l'immobilisation et la protection du dispositif optique en le couvrant avec du ruban adhésif est une approche efficace pour assurer un adequate fixation. Lorsque vous effectuez une injection en bolus FITC-sinistrine il est essentiel d'administrer toute la substance par voie intraveineuse et non sous-cutanée. La libération du marqueur dans le tissu sous-cutané peut être facilement identifié par un anneau jaune entourant la queue de l'animal produit par sa couleur de FITC-sinistrine. Une injection sous-cutanée se manifeste typiquement comme une courbe plus plate et prolongée marqueur de temps d'excrétion. La limitation possible de cette méthode est plus liée au marqueur utilisé qu'avec la technologie en soi. Quand un oedème est présent dans la peau d'un animal, l'évaluation transcutanée de la fonction rénale ne serait pas recommandé, car il y a un compartiment supplémentaire qui pourrait modifier la dynamique d'excrétion du FITC-sinistrine. De même, la peau pigmentée peut limiter l'utilisation de la technique en raison de l'excitation et des spectres d'émission se chevauchant de FITC-sinistrine et la mélanine. Cependant, chez les animaux ayant une pigmentation de la peau en plaques, le problème est résolu en plaçant l'optiqueune partie de l'appareil dans une zone non pigmentée.

Il est possible de modifier les différents aspects de l'évaluation de la fonction rénale transcutanée afin d'adapter la procédure d'espèces et / ou animales différentes approches. Par exemple, la dose recommandée FITC-sinistrine ou de la durée de la mesure peut être ajustée en fonction du but de l'expérience, ainsi que pour différentes espèces ou des modèles animaux. Cette capacité d'adaptation de la méthode a déjà été confirmé par son application réussie dans différentes espèces de rongeurs et plusieurs types de souches avec des conditions de santé variés. En outre, l'évaluation de la fonction rénale transcutanée a été récemment validée chez les chiens et les chats ¹² avec d' excellents résultats. En raison des différences indéniables entre ces animaux et les rongeurs, cette étude a déterminé la dose appropriée de FITC-sinistrine pour les deux, les chiens et les chats, et il a effectué un temps beaucoup plus long mesure, 4 heures au lieu de 1 ou 2 heures utilisationd chez les rongeurs.

Pris ensemble, l'utilisation de cette technique peut nous aider à mieux comprendre plus précis en néphrologie, y compris une meilleure compréhension de la progression de la maladie rénale et l'effet des thérapies. Les caractéristiques de l'évaluation de la fonction rénale transcutanée lieux comme une technique appropriée pour être appliquée dans les domaines cliniques humains et vétérinaires dans l'avenir, et doivent être considérés comme une technologie prometteuse pour remplacer les approches traditionnelles.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
NIC-Kidney device	Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH		Software, batteries and chargers are provided together with the device/s. Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com
FITC-sinistrin	Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH		Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com
Double-sided adhesive patch	Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH		Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com
Isis Rodent electric shaver	Braun Aesculap	GT420
Isoflurane	Abbott GmbH	PZN4831850
Leukosilk adhesive tape	BSN medical	102200
Tubular elastic gauze bandage	MaiMed Medical GmbH	73012	There are different sizes available. Size 1 is recommended for mice.
Veet depilation cream	Reckitt Benckiser	PZN7768307	Sensitive skin formulation is recommended as is more gentle with the skin of the animals
Micro USB cable	Samsung	APCBU10BBE
Deltajonin Physiologic solution	AlleMan Pharma GmbH	3366954	Alternatively, it can be used saline or PBS