זיהוי של תנאים קריטיים לImmunostaining באפונה בכנימות עוברים: הגדלת רקמות חדירות והפחתת מכתים רקע

Summary

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

Abstract

Pisum Acyrthosiphon כנימת האפון, עם הגנום רצף וגמישות פנוטיפית שפע, הפך מודל מתעורר ללימודים הגנומי והתפתחותיים. כמו כנימות אחרות,. Pisum להפיץ במהירות באמצעות רבייה משריצה פרתנוגנטית, שבו עובר לפתח בתוך תאי ביצה באופנת פס ייצור בovariole. בעבר הקמנו פלטפורמה חזקה של כל הר הכלאה באתר המאפשרת זיהוי של ביטוי mRNA בעוברי הכנימה. לניתוח הביטוי של חלבון, אם כי, הוקם פרוטוקולים לimmunostaining ovarioles של כנימות משריצות מיניות לא הניב תוצאות משביעות רצון. כאן אנו מדווחים תנאים מותאמים להגדלת חדירות רקמות ולהפחית מכתים רקע, אשר שניהם היו בעיות בעת החלת גישות הוקמו. אופטימיזציות כוללות: (1) דגירה של K (1 מיקרוגרם / מיליליטר, 10 דקות) proteinase, שנמצא F החיוניאו חדירת נוגדן בעוברי אמצע וכנימה בשלב מאוחר; (2) החלפה של אלבומין בסרום סרום עז / שור הרגיל עם מגיב חסימה מסופק על ידי digoxigenin (DIG) מבוסס חיץ להגדיר ו( 3) יישום של מתנול ולא מי חמצן (H ₂ O ₂₎ להלבנת peroxidase אנדוגני; אשר הקטין באופן משמעותי את מכתים הרקע ברקמות הכנימה. תנאים אלה קריטיים מותאמים לimmunostaining יאפשר איתור יעיל של מוצרי גן בעוברים של. pisum וכנימות אחרות.

Introduction

כנימות הן חרקים hemipteran עם גופים רכים (1-10 מ"מ) קטנים. הם ניזונים צמחים על ידי מציצת לשד השיפה עם איברי פה פירסינג. בנוסף, הם מסתמכים על חיידק endosymbiotic לחייב, aphidicola Buchnera, לסנתז חומצות אמינו חיוניות שחסרות בתזונת SAP השיפה. יש כנימות היסטורית חיים מורכבות הכוללת רבייה משריצה פרתנוגנטית במהלך האביב וphotoperiods ארוך ביום הקיץ ורבייה מינית מֵטִיל בֵּיצִים מופעלת על ידי photoperiods קצר-היום שבמהלכו הם שכבו במספר מוגבל של ביצי overwintering ^1,2. באביב ביצים אלה בוקעים לייצר הדור הראשון של כל הנקבה הכנימות (fundatrices), הבאות סיבובים רבים של רבייה פרתנוגנטית עד סתיו. רביית הבתולים המחזוריות בכנימות, שם חלופי שלבים מיניים ומיניים במחזור החיים השנתי, כבר נחשבו ^1,2 חידוש אבולוציוני. בכנימות המשריצות פרתנוגנטית, עובר מתרחש בתוך תאי ביצה של צינוריות השחלות (ovarioles). לעומת זאת, עובר מֵטִיל בֵּיצִים מיני לפתח בביציות המופרות. מלבד פלסטיות רבייה, כנימות יכולות להציג polyphenism אגף הבין דור: בתגובה לאותות צפיפות ואיומי טורף, הנקבות מיניות unwinged יכולות viviparously לייצר צאצאים מכונפים להגירה למרחקים ארוכים. פרסום רצף הגנום של כנימת אפון Acyrthosiphon pisum חור' רצף הגנום הראשון לבסיס חרקים מאפשר hemimetabolous חקירה נוספת של פלסטיות רבייה, polyphenism אגף, ותכונות אחרות כוללים אינטראקציות חרקים צמח, vectoring הנגיפי וסימביוזה בכנימות על מולקולרי בסיס ^3.

בנוסף להגנום רצף, כלים לאפיון ביטוי גנים ותפקוד נדרשים לקידום כנימת האפונה כאורגניזם מודל בוגר ^4. שתארנו פרוטוקולים חזקים של כל הר הכלאה באתר לאיתור ביטוי של mRNA בעוברי כנימה ^5-7. התערבות RNA (RNAi) באמצעות הזרקת RNA פעמיים תקועים והאכלה שמשה במשך השתקת גנים בנימפות כנימה ומבוגרים, אבל תנאים יציבים לגן מציאה בעוברים לא דווחו ^8-10 עדיין. Immunostaining, גישה מבוססת נוגדנים שיכולים לזהות ביטוי חלבון בדגימות לפני ואחרי מציאה RNAi, שבוצע בעוברי כנימת האפונה ^11-13. עם זאת, גידול בשיעור של חדירות וחיסול מכתים רקע רקמה הוא עדיין לא מספק תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים לimmunostaining בעוברים המשריצים מיניים של כנימת האפון. לדוגמא, מצאנו כי החדירה של נוגדן לרקמות ירידה בעוברי gastrulating (שלבי 8-10) ושעובר עם ניצני איבר מורפולוגית לזיהוי (שלבי 13-14) היו בקושי חדיר לנוגדן. בנוסף, מכתים רקע היה דמיין בviviparo מינישלנו עובר כנימת אפונה מוכתמת באמצעות נוגדנים נגד סמן germline Vasa כמו גם שנגד חלבון Engrailed / Invected הביע במגזרים העובריים ^12,13. למעשה מכתים רקע עדיין היה נראה בבירור בעוברים מוכתמים עם הנוגדנים משני בלבד.

על מנת להגדיל את החדירות מבלי לפגוע שלמות רקמות כנימה, אנחנו טיטרציה זהירות ריכוז proteinase K ונקבעו תנאים אופטימליים לעיכול רקמה על עוברי כנימה. על מנת להימנע מהכתמה אינה ספציפית בכנימת האפון, חיפשנו תרכובות שיכולים לחסום ביעילות עוברים ולדכא פעילות של peroxidase אנדוגני (POD), אנזים מועסק להגברת אותות במהלך immunostaining. מגיב חסימה הניתן על ידי קבוצת חיץ מבוססת digoxigenin (DIG), ולא עז בסרום הנורמלי משמש באופן מסורתי (NGS) / אלבומין בסרום שור (BSA), צמצם באופן משמעותי מכתים רקע. יתר על כן, מתנול נמצא inhiנשך את פעילות POD אנדוגני בצורה יעילה יותר מאשר מי חמצן (H ₂ O _2). פרטים בדבר תנאי כנימה ספציפית אלה לimmunostaining על עוברים יהיו מתוארים בסעיפים הבאים.

Protocol

1. תרבות של כנימות

הערה:. זן המעבדה של כנימת אפון המשריצה פרתנוגנטית pisum נאסף במקור בטייוואן המרכזי וכבר גדל על צמחי מארח (sativum Pisum האפונה הגינה או פול שעועית הרחב) תחת photoperiod ארוך יום ליותר מ -300 דורות (דור אחד: ~ 10 ימים).

1. נביטה של ​​זרעים
   1. משרים את הזרעים של צמחי מארח במים ברז למשך 3-5 ימים על RT. למלא במים טריים פעם ביום.
      הערה: לחלופין, לשים זרעים של צמחי מארח ישר לתוך אדמה לחה יכול לגרום לנביטה גם כן.
   2. לגדול זרעים נובטים 10 בסיר קטן (בקוטר סנטימטר 9 x 7 ס"מ) עם אדמה בתא הצמיחה תחת photoperiod 16 שעות אור / חושך שעה 8 ב 20 ° C.
   3. כ -10 ימים לאחר הצמיחה מתחילה, להעביר כנימות על צמחים שגובהם הוא יותר מ -8 סנטימטרים.
2. העברת הכנימות
   1. שמור כל סיר של צמחים בתוך כוס זכוכית 1 ליטר, להעביר 8 כנימות בוגרות על צמחים באמצעות מכחול, ולאחר מכן לאטום את הכוס עם חיפוי אווירי חדירה כגון רשת גזה כדי למנוע כנימות לברוח.
   2. דגירה כנימות בתא צמיחה תחת photoperiod 16 שעות אור / חושך שעה 8 ב 20 ° C. מים בכל עציץ של צמחים אחת ליום.
   3. לקבלת הדור הבא של כנימות, לחזור צעדי 1.1.3-1.2.2 עשרה ימים לאחר העברת הכנימה העיקרית.

2. Dissection וקיבוע של השחלות

1. טרי להכין paraformaldehyde% 4 (PFA) ב1x שנאגרו מלוח פוספט (PBS) כחיץ הקיבעון.
2. מלא גם אחד של צלחת מקום עם PFA (כ -500 μl), למקם את הצלחת תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה נמוכה, ולצלול כנימה בוגרת בתוך PFA לנתיחה.
3. לנתח השחלות על ידי מחזיק את הראש והבטן עם סט אחד של מלקחיים, חיתוך פתוח הגבציפורן של הבטן, וגורר את השחלות מחלל הבטן.
4. תקן שלושה זוגות של השחלות בצינור 1.5 מיליליטר המכיל 1 מיליליטר של PFA ב RT במשך 20 דקות.
5. חיץ קיבעון למזוג עם טפטפת העברה (או זכוכית או חד פעמי) ולאחר מכן לשטוף השחלות עם 0.2% TritonX-100 ב 1x PBS (PBST) 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד. קל רועד במיקסר / הכתף (זווית סיבוב: 60 ° (F60) מהירות / סיבוב: 8 סל"ד) מומלץ לשני קיבעון וכביסה.

3. טיפול בproteinase K (PK) כדי להגדיל את החדירות של רקמות עובריים

הערה: טיפול PK מוחל על עוברים מהארכה ואילך להקה נבט (שלב 11 של פיתוח). לעוברים צעירים, בשלב זה הוא אופציונאלי.

1. סדרתי לדלל את פתרון המניות של PK (10 מ"ג / מיליליטר) עם 1x PBS ל1 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז עבודה.
2. דגירה השחלות עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר של PK (כ -500 μl) במשך 10 דקות עם רעד קל.
3. soluti למזוג PKעל ולאחר מכן לשטוף את השחלות עם 700 μl של גליצין (2 מ"ג / מיליליטר) 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
4. לשטוף השחלות עם PBST 0.2% פעמיים במשך 10 דקות כל אחד.
5. תקן השחלות שוב עם חיץ קיבעון במשך 15 דקות ב RT עם רעד קל.
6. בטל supernatant ולשטוף השחלות עם PBST 0.2% פעמיים במשך 10 דקות כל אחד.

4. מתנול דגירה לפעילות דיכוי peroxidase אנדוגני (POD)

הערה: הדגירה מתנול אינה מוחלת על עוברים נתון לאפיטופים מכתים או נוגדן Phalloidin שמתנול רגיש.

1. סדרנו ליבש השחלות עם אחוז שונה של מתנול בPBST% 0.2 (V / V: 1: 3, 1: 1, 3: 1) על ידי דוגרים השחלות בכל ריכוז של פתרון מתנול במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה.
2. מייבשים השחלות עם מתנול 100% עבור שעה 1 ב RT עם רעד קל.
   הערה: אפשר עדיין להשיג תוצאות משביעות רצון של מכתים מרקמות כנימה שאוחסנו במתנול 100% ב -20 ו# 176; C למשך חודש אחד.
3. סדרנו רעננות השחלות עם אחוז שונה של מתנול בPBST% 0.2 (V / V: 3: 1, 1: 1, 1: 3) על ידי דוגרים השחלות בכל ריכוז של פתרון מתנול במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה.

5. נוגדן מכתים

1. לדלל את פתרון 10x חסימה מסט החיץ מבוסס DIG (DIG-B) ל1x.
   הערה: פתרון חסימת 1x DIG-B הוא יעילה יותר להפחתת הרקע מכתים מאשר מגיב הסטנדרטי החסימה המורכבת של 5% (V / V) בסרום עז נורמלי (NGS) ו -0.5% (V / V) אלבומין בסרום שור (BSA ) בPBST 0.2%.
2. דגירה השחלות עם פתרון 1x DIG-B החסימה ל2.5-4 שעות על RT או O / N ב 4 ° C עם רעד קל.
   הערה: לשלושה זוגות של השחלות בצינור 1.5 מיליליטר, 200 μl הוא הנפח המינימאלי לחסימת מדגם ומכתים נוגדן.
3. למזוג supernatant ולהחליף עם פתרון 1x DIG-B חסימה טרי המכיל נוגדן ראשוני בdiluti המתאיםעל יחס. להכתים את השחלות ל4 שעות ב RT או O / N ב 4 ° C עם רעד קל.
   הערה: לניסוי המתואר כאן, השתמש בדילולים אופטימליים הבאים של נוגדנים עיקריים: (1) נוגדן ApVas1: 1: 500 לצביעת chromogenic, 01:50 למכתים immunofluorescence; (2) נוגדן אנטי-טובולין α: 1: 500; (3) נוגדנים חד שבטי 4D9: 01:25.
4. לשטוף השחלות עם PBST 0.2% 4 פעמים במשך 15 דקות כל אחד.
5. דגירה השחלות עם פתרון 1x DIG-B חסימה עבור שעה 1 ב RT עם רעד קל.
6. למזוג supernatant ולהחליף עם פתרון DIG-B חסימה טרי 1x המכיל נוגדנים משני ביחס דילול מתאים. להכתים את השחלות ל4 שעות ב RT או O / N ב 4 ° C עם רעד קל.
   1. השתמש ביחסי הדילול הבאים של נוגדנים משני: (1) למכתים immunofluorescence: 1: 500 לIgG אלקסה פלואוריד 633 עיזים נגד ארנב או אלקסה פלואוריד 488 עיזים אנטי העכבר IgG; (2) לצביעה chromogenic: 1: 200 לIgG נגד ארנב העז biotinylated.
      הערה: הנוגדנים משני biotinylated מוחל לאינטראקציה עם avidin ביוטין-המורכב (ABC) בזיהוי מבוסס המצע (chromogenic), שדרכו אותות הצביעה מוגברים באופן משמעותי.
   2. עבור מכתים immunofluorescence, לבצע צביעה בחושך כי הנוגדנים משני הוא רגיש לאור.
7. לשטוף את נוגדנים משני עם PBST 0.2% 4 פעמים במשך 10 דקות כל אחד.

6. מכתים גרעיני וF- אקטין

הערה: זו מיושמת רק למכתים immunofluorescence.

1. כתם השחלות עם PBST 0.2% המכיל DAPI (2 ng / μl) וPhalloidin-TRITC (100 ננומטר) לשעה 2 ב RT בחושך.
2. לשטוף השחלות עם PBST 0.2% 4 פעמים במשך 10 דקות כל אחד.
3. דגירה השחלות עם O ההרכבה הבינוני / N ב 4 ° C עם רעד קל.

7. איתותים פיתוח

הערה: זו מיושמת רק לצביעת chromogenic.

1. הכן של 100 μlמגיב avidin ביוטין-מורכב (ABC) לשיפור האותות על ידי הוספת 1 μl של מגיב (avidin) בμl 98 של PBST 0.2%, ערבוב ביסודיות באמצעות pipetting העדין, והוספת 1 μl של מגיב B (ביוטין מצומדות עם peroxidase חזרת ), ואחריו ערבוב מיידי. דגירה את התערובת למשך 30 דקות ב RT עם רעד קל.
2. דגירה השחלות (כולל תאי ביצה משויך) בתערובת של חומרים כימיים ו- B במשך 30 דקות ב RT עם רעד קל.
3. לשטוף את התערובת של חומרים כימיים ו- B עם PBST 0.2% 4 פעמים במשך 10 דקות כל אחד.
4. העבר את השחלות שקועות בPBST לטוב על צלחת המקום עם טפטפתי פלסטיק.
5. הכן פתרון מצע של 3,3'-diaminobenzidine (DAB): לפזר לוח DAB אחד ועוד אחד אחרת מי מכיל אוריאה מימן ב 1 מיליליטר של DDH ₂ O באמצעות vortexing הנמרץ דקות 1.
   הערה: DAB, מצע מזרז של peroxidase, הוא אַב צֶבַע פופולרי עבור immunostaining. היא מייצרת brמשקע שלו ולא מסיס לאחר שמתחמצן על ידי peroxidase. ניתן לשפר אותות חלשים על ידי הוספת כלוריד ניקל לפתרון המצע (ריכוז סופי 0.05-.08%).
6. הסר את פתרון PBST שנותר בבאר ולמלא עם פתרון מצע DAB לפיתוח אות 100 μl.
7. צג עוצמת האותות תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה נמוכה.
8. עצור תגובות על ידי הסרת פתרון DAB, ואחרי מילוי עם 1x PBS באופן מיידי. חזור על לשטוף פעמיים.
9. העבר את השחלות חזרה לצינור 1.5 מיליליטר ולאחר מכן לשטוף עם 1x PBS או PBST פעמיים במשך 15 דקות כל אחד.
10. דגירה השחלות בהרכבה בינונית מבוסס גליצרול O (70% גליצרול) / N ב 4 ° C עם רעד קל.

8. הרכבה עוברים בכנימות

הערה: העובי של עוברי כנימה משתנה בין שלבי התפתחות. אסטרטגיות ההרכבה ובכך שונה כדי להתאים מוקדם (germaria ושלבים 0-10), אמצע (שלבים11-18), ומאוחר עוברים (שלבים 19-20), שהם הפגינו באיור 2 - D. בימוי עובריים ואחרי מיורה et al. ¹²

1. העבר את השחלות יחד עם הרכבה בינונית למגש התא עם טפטפתי פלסטיק ולבחון דגימות תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה נמוכה.
2. חותך את calyces קשור עם oviduct לרוחב באמצעות סיכות חרקים ולאחר מכן להעביר ovariole מבודד לכוס ריקה גם עם טפטפתי. מרכיבים את הנפח הסופי 50-100 μl באמצעות הרכבה בינונית.
3. העבר את ovariole לשקופית עם טפטפתי זכוכית ולאחר מכן לנתח תאי ביצה באמצעות סיכות חרקים.
   הערה: לעוברים מבוגרים משלב 6 של פיתוח, הפרדת תאי ביצית הציעה; לgermaria ושני תאי הביצה הראשונים צעירים מן השלב 6, הפרדה היא אופציונלית.
4. להעביר את תא ביצה גזור לשקופית נקייה באמצעות טפטפתי זכוכית.
5. שים coverslip (גודל: 22 x 22מ"מ) מעל germaria גזור או תאי ביצה (המכיל עובר בשלבי 1-10 של פיתוח) לאט כדי למנוע בועות.
   1. תאי ביצת ההר (המכילים עוברים בשלבי 11-18 פיתוח) בשקופית עם גשר coverslip חד-צדדי ומניחים coverslip אחר (גודל: 18 x 18 מ"מ) בחלק העליון של המדגם.
   2. תאי ביצת ההר (המכילים עוברים מעל גיל 19 שלב של פיתוח) בשקופית עם גשר דו צדדי coverslip ומניחים coverslip אחר (גודל: 18 x 18 מ"מ) בחלק העליון של המדגם.
6. למלא את החלל מתחת לcoverslip העליון עם תקשורת הרכבה כדי למנוע התייבשות המדגם.
7. במתינות לגלגל את העובר על ידי הזזה coverslip להשיג את הכיוון הנכון להסתכלות.
8. לאטום מסביב לקצה של coverslips (כולל coverslips הגשר) עם לק.

ניתוח 9. הדמיה

1. התערבות ההפרש לעומת זאת תצלום (DIC) תמונות של כל הר עובר עם compouND מיקרוסקופ מצויד באופטיקה דסק"ש ועדשה אובייקטיבית יבשה (10X, 20X, 40X) מחוברת למצלמה. התקן את התוכנה להעברת תמונה בין המצלמה והמחשב באמצעות הוראות יצרן.
2. לרכוש תחזיות של העוברים שכותרתו fluorescently עם מיקרוסקופ confocal לייזר סריקה ^14. עקוב אחר ההוראות של היצרן לצילום, Z-ערימה, ו3D מקרין עם תוכנת הדמיה.
   1. הפעל את השקופית הפוכה, למצוא את המדגם רכוב עם 10X אובייקטיבי, ומקיף את אזור הדגימה עם עט מבוסס משומן בסדר.
      הערה: זה עושה את זיהוי המדגם קל יותר כאשר הוא מחפש את זה דרך יעדים של מיקרוסקופ confocal.
   2. להוסיף טיפה של שמן על החלק העליון של אזור coverslip שהצד נגדי מתויג כמתואר ב9.2.1.
3. מצא את מישור המוקד ב40X מטרת נפט טבילה ואז לשנות למטרת נפט טבילה 63X. באופן ידני להעביר את השליטה להתמקד בסדר ולעשותwn כדי ללכוד את מישור המוקד הטוב ביותר.
   הערה: להתבוננות פרטים מבניים של germaria ועוברים מוקדמים, אנו ממליצים להשתמש 40X יעדים או אלה עם הגדלה גבוהה יותר.
4. סרוק את העובר בערוצי עירור שונים ולקבל תמונת Z- מחסנית.
   הערה: לרקמות כנימת אפון, להפחית את עוביו של כל סעיף אופטי עד 1.5 מיקרומטר או פחות.

תוצאות

במחקר זה, ביצענו שלם ההר-immunostaining על עוברים של כנימות מיניות אפונה (איור 1 א). נקבות אלה לייצר צאצאי רביית בתולים וviviparously. נקבת עוברים אלה מתפתחים בתוך תאי ביצה של צינוריות השחלות (ovarioles) (איור 1 ואיור 2 א). לפני מיקרוסקופיה, ovario...

Discussion

זיהינו תנאים אופטימליים קריטיים לimmunostaining המוצלח בכנימת האפונה. Pisum, אורגניזם מודל מתעורר ללימודים הגנומי והתפתחותיים ^3,15. תנאים אופטימליים להגדלת חדירות רקמות והפחתת מכתים רקע משופר העצמה וספציפיות של אותות. הם שונים מפרוטוקולים סטנדרטיים לimmunostaining במודל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% hydrogen perxidase (H2O2)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	11585762001	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.