Identification des conditions critiques pour Immunocoloration dans le puceron du pois embryons: L'augmentation de la perméabilité des tissus et la diminution de la coloration de fond

Résumé

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

Résumé

Le Acyrthosiphon pisum du puceron, avec un génome séquencé et la plasticité phénotypique abondante, est devenue un modèle émergent des études de génomique et de développement. Comme d'autres pucerons, A. Pisum propager rapidement par reproduction vivipare parthénogénétique, où les embryons se développent dans des chambres d'œufs dans une chaîne de montage dans le ovariole. Auparavant, nous avons établi une plate-forme robuste de l'ensemble de montage hybridation in situ permettant la détection de l'expression des ARNm dans les embryons de pucerons. Pour l'analyse de l'expression de la protéine, cependant, les protocoles établis pour immunocoloration les ovarioles de pucerons vivipares asexués n'a pas produit de résultats satisfaisants. Nous rapportons ici des conditions optimisées pour augmenter la perméabilité des tissus et la diminution de la coloration de fond, qui étaient tous deux des problèmes lors de l'application des approches établies. Optimisations incluent: (1) l'incubation de la protéinase K (1 pg / ml, 10 min), qui a été trouvé f essentielleou la pénétration d'anticorps dans les embryons à moyen et pucerons en fin de ligne; (2) le remplacement de sérum-albumine de sérum de chèvre / bovin normal avec un réactif de blocage fourni par un Digoxigénine (DIG) à base de jeu de tampons et (3) l'application de méthanol au lieu du peroxyde d'hydrogène (H _{2 O 2)} pour le blanchiment de peroxydase endogène; qui réduit de manière significative le bruit de fond dans les tissus de pucerons. Ces conditions critiques optimisés pour un marquage permettra une détection efficace des produits de gènes dans les embryons de A. Pisum et autres pucerons.

Introduction

Les pucerons sont des insectes hémiptères avec des petits (1-10 mm) corps mous. Ils se nourrissent de plantes en suçant la sève de phloème pièces buccales perçants. En outre, ils comptent sur ​​une bactérie endosymbiotique obligatoire, Buchnera aphidicola, pour synthétiser des acides aminés essentiels qui sont déficients dans le régime alimentaire de la sève du phloème. Les pucerons ont une histoire de vie complexe qui comprend la reproduction vivipare parthénogénétique au printemps et en photopériode longue journée d'été et la reproduction ovipare sexuelle déclenchée par une photopériode de jours courts pendant laquelle ils pondent un nombre limité de ^1,2 œufs d'hiver. Au printemps ces œufs éclosent pour produire la première génération de toutes les femelles fondatrices (pucerons), à la suite de nombreux cycles de reproduction parthénogénétique jusqu'à l'automne. La parthénogenèse cyclique chez les pucerons, où les phases sexuée et asexuée alternent dans le cycle de vie annuel, a été considéré comme une nouveauté ^1,2 évolutif. Dans les pucerons vivipares parthé, L'embryogenèse a lieu dans des chambres d'œufs des tubules ovariens (de ovarioles). En revanche, les embryons ovipares sexuels se développent dans les œufs fécondés. En dehors de la plasticité de la reproduction, les pucerons peuvent afficher polyphénisme aile transgénérationnel: en réponse aux signaux de la surpopulation et des menaces de prédateurs, les femelles asexuées sans ailes peuvent vivipares produire une descendance ailée pour la migration à longue distance. Publication de la séquence du génome du puceron du pois Acyrthosiphon pisum -la première séquence du génome d'une base insectes permet hémimétaboles poursuite de l'exploration de la plasticité de la reproduction, polyphénisme de l'aile, et d'autres fonctionnalités, y compris les interactions insectes-plantes, vectorisation virale et la symbiose de pucerons sur une moléculaire base ^3.

En plus de la séquence du génome, les outils permettant de caractériser la fonction des gènes et l'expression sont nécessaires pour promouvoir le puceron du pois comme un organisme modèle mûre ^4. Nous avons décrit les protocoles robustes de l'ensemble de montage hybridation in situ pour détecter l'expression de l'ARNm dans les embryons de pucerons ^5-7. L'interférence ARN (ARNi) par injection d'ARN double brin et de l'alimentation a été utilisée pour le silençage génique dans nymphes de pucerons et les adultes, mais des conditions stables pour knockdown gène dans les embryons ont pas encore été signalé ^8-10. Immunocoloration, une approche basée sur les anticorps qui peuvent détecter l'expression de la protéine dans des échantillons avant et après knockdown ARNi, a été réalisée sur les embryons du puceron du pois ^11-13. Cependant, l'augmentation de la perméabilité des tissus et l'élimination de la coloration de fond sont encore insatisfaisants utilisant des protocoles standards pour immunocoloration dans les embryons asexués vivipares du puceron du pois. Par exemple, nous avons trouvé que la pénétration des anticorps dans les tissus a diminué chez les embryons gastrulating (étapes 8 à 10) et que les embryons avec bourgeons des membres morphologiquement identifiables (étapes 13-14) ont été à peine perméable à l'anticorps. En outre, la coloration de fond a été visualisée dans le vivíparo asexuéenous pois embryons de pucerons colorées utilisant un anticorps contre le marqueur de la lignée germinale Vasa ainsi que celle contre la protéine Engrailed / invected exprimé dans les segments embryonnaires ^12,13. En fait, la coloration de fond était encore bien visible dans les embryons colorées avec l'anticorps secondaire seul.

Afin d'augmenter la perméabilité sans endommager l'intégrité des tissus de pucerons, nous augmentée avec précaution la concentration de protéinase K et déterminé les conditions optimales pour la digestion du tissu sur les embryons de pucerons. Afin d'éviter la coloration non-spécifique dans le puceron du pois, nous avons cherché des composés qui pourraient bloquer efficacement les embryons et supprimer l'activité de peroxydase endogène (POD), une enzyme utilisée pour amplifier des signaux pendant immunocoloration. Un réactif de blocage fourni par un Digoxigénine (DIG) jeu de tampons à base plutôt le sérum de chèvre normal traditionnellement utilisé (NGS) / sérum albumine bovine (BSA), réduit de façon significative la coloration de fond. En outre, le methanol a été trouvé à INHIbit l'activité de POD endogène plus efficace que le peroxyde d'hydrogène (H _{2 O 2).} Les détails concernant ces conditions spécifiques pucerons pour un marquage sur les embryons seront décrits dans les sections suivantes.

Protocole

1. Culture de pucerons

NOTE:. La souche de laboratoire de l'parthénogénétique vivipare puceron du pois A pisum été initialement collectées dans le centre de Taiwan et a été élevé sur les plantes hôtes (le sativum jardin pois Pisum ou la fève Vicia faba) sous photopériode de jours longs pour plus de 300 générations (une génération: ~ 10 jours).

1. Germination des graines
   1. Faire tremper les graines de plantes hôtes dans l'eau du robinet pendant 3-5 jours à température ambiante. Remplir avec de l'eau fraîche une fois par jour.
      NOTE: Vous pouvez également mettre des graines de plantes hôtes directement dans un sol humide peut induire la germination ainsi.
   2. Croître de 10 graines en germination dans un petit pot (9 cm de diamètre x 7 cm de haut) avec le sol dans la chambre de croissance sous photopériode de 16 heures de lumière / 8 h obscurité à 20 ° C.
   3. Environ 10 jours après le début de la croissance, de transférer les pucerons sur les plantes dont la hauteur est de plus de 8 cm.
2. Transfert des pucerons
   1. Gardez chaque pot de plantes dans un bécher de 1 L de verre, transférer 8 pucerons adultes sur les plantes à l'aide d'un pinceau, puis sceller le bécher avec une couverture perméable à l'air comme de la gaze mailles pour empêcher les pucerons de se échapper.
   2. Incuber les pucerons dans une chambre de croissance sous photopériode de 16 heures de lumière / 8 h obscurité à 20 ° C. Arrosez chaque pot de plantes une fois par jour.
   3. Pour l'obtention de la prochaine génération de pucerons, réitérer les étapes 1.1.3-1.2.2 dix jours après le transfert de pucerons primaire.

2. Dissection et la fixation des ovaires

1. Fraîchement préparer paraformaldehyde à 4% (PFA) dans 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) comme tampon de fixation.
2. Remplir un puits d'une plaque de place avec PFA (environ 500 pi), placer la plaque sous un microscope stéréo à faible grossissement, et plonger un puceron adulte au sein de la PFA pour la dissection.
3. Disséquer ovaires en tenant la tête et l'abdomen avec un jeu de pinces, coupe ouverte la dorsalecuticule de l'abdomen, et en faisant glisser les ovaires loin de la cavité abdominale.
4. Fixer trois paires d'ovaires dans un tube de 1,5 ml contenant 1 ml de PFA à température ambiante pendant 20 min.
5. Tampon de fixation Décanter avec une pipette de transfert (verre ou jetable), puis lavez ovaires avec 0,2% de Triton X-100 dans du PBS 1X (PBST) 3 fois pour 10 minutes chacun. Secouant doux sur un mélangeur / rotateur (angle de rotation: 60 ° (F60) / vitesse de rotation: 8 RPM) est recommandée à la fois pour la fixation et le lavage.

3. traitement à la protéinase K (PK) pour augmenter la perméabilité des tissus embryonnaires

NOTE: le traitement de PK est appliquée à partir d'embryons extension de bande de germe en avant (stade 11 de développement). Pour les plus jeunes embryons, cette étape est facultative.

1. Série diluer la solution stock de PK (10 mg / ml) avec 1x PBS à la concentration de travail 1 pg / ml.
2. Incuber ovaires avec 1 ug / ml de PK (environ 500 ul) pendant 10 minutes sous agitation douce.
3. Décanter PK solutisur, puis lavez les ovaires avec 700 pi de glycine (2 mg / ml) 3 fois pendant 5 minutes chacun.
4. Laver ovaires avec 0,2% PBST deux fois pour 10 minutes chacun.
5. Fixer ovaires nouveau avec un tampon de fixation pour 15 min à température ambiante sous agitation légère.
6. Rejeter le surnageant et laver ovaires avec 0,2% PBST deux fois pour 10 minutes chacun.

4. Méthanol incubation pour la répression de la peroxydase endogène (POD) activité

NOTE: Le méthanol incubation est pas appliquée aux embryons soumis à la phalloïdine coloration ou d'anticorps des epitopes qui sont sensibles methanol.

1. Déshydrater en série avec ovaires pourcentage différent de methanol dans du PBST 0,2% (v / v: 1: 3, 1: 1, 3: 1) en incubant les ovaires à chaque concentration de la solution de methanol pendant 10 minutes avec agitation douce.
2. Déshydrater ovaires avec 100% de méthanol pendant 1 heure à température ambiante sous agitation légère.
   REMARQUE: Les résultats satisfaisants des taches pourraient encore être obtenus à partir de tissus de pucerons qui ont été stockées dans 100% de méthanol à -20 &# 176; C pendant un mois.
3. Réhydrater en série avec ovaires pourcentage différent de methanol dans du PBST 0,2% (v / v: 3: 1, 1: 1, 1: 3) en faisant incuber les ovaires à chaque concentration de la solution de methanol pendant 10 minutes avec agitation douce.

5. Anticorps Coloration

1. Diluer la solution 10x de blocage de l'ensemble de tampon à base-DIG (DIG-B) à 1x.
   REMARQUE: La solution de blocage 1x DIG-B est plus efficace pour réduire l'arrière-plan de la coloration que le réactif de type blocage composée de 5% (v / v) de sérum de chèvre normal (NGS) et 0,5% (v / v) de sérum-albumine bovine (BSA ) dans du PBST à 0,2%.
2. Incuber les ovaires avec la solution DIG-B 1x blocage pendant 2,5 à 4 heures à température ambiante ou O / N à 4 ° C avec une agitation douce.
   NOTE: Pour les trois paires d'ovaires dans un tube de 1,5 ml, 200 pl est le volume minimum pour le blocage de l'échantillon et l'anticorps coloration.
3. Décanter le surnageant et la remplacer par une nouvelle solution de blocage 1x DIG-B contenant l'anticorps primaire à diluti appropriéele ratio. Colorer les ovaires pendant 4 heures à la température ambiante ou O / N à 4 ° C avec une agitation légère.
   REMARQUE: Pour l'expérience décrite ici, utiliser les dilutions optimales suivantes d'anticorps primaires: (1) anticorps ApVas1: 1: 500 pour la coloration chromogène, 1:50 pour immunofluorescence; (2) un anticorps anti-tubuline α: 1: 500; (3) anticorps monoclonal 4D9 de: 01:25.
4. Laver ovaires avec 0,2% PBST 4 fois pendant 15 min chacune.
5. Incuber ovaires avec une solution de blocage 1x DIG-B pendant 1 heure à température ambiante avec une agitation douce.
6. Décanter le surnageant et le remplacer par une solution fraîche 1x de blocage DIG-B contenant l'anticorps secondaire à taux de dilution approprié. Colorer les ovaires pendant 4 heures à la température ambiante ou O / N à 4 ° C avec une agitation légère.
   1. Utilisez les rapports de dilution suivantes d'anticorps secondaires: (1) Pour immunofluorescence: 1: 500 pour Alexa Fluor 633 de chèvre anti-IgG de lapin ou Alexa Fluor 488 de chèvre anti-IgG de souris; (2) Pour la coloration chromogène: 1: 200 de chèvre biotinylé anti-IgG de lapin.
      NOTE: L'anticorps secondaire biotinylé est appliquée pour interagir avec l'avidine-biotine-complexe (ABC) dans le (chromogène) détection à base de substrat, à travers laquelle les signaux de coloration sont considérablement amplifiés.
   2. Pour immunofluorescence, effectuer coloration dans l'obscurité parce que l'anticorps secondaire est sensible à la lumière.
7. Laver anticorps secondaire avec 0,2% PBST 4 fois chacune pendant 10 minutes.

6. nucléaire et F-coloration de l'actine

NOTE: Ceci est appliqué seulement pour immunofluorescence.

1. Colorer ovaires avec du PBST contenant 0,2% DAPI (2 ng / ul) et phalloïdine-TRITC (100 nM) pendant 2 heures à la température ambiante dans l'obscurité.
2. Laver ovaires avec 0,2% PBST 4 fois chacune pendant 10 minutes.
3. Incuber ovaires avec le milieu de montage O / N à 4 ° C avec une agitation légère.

7. Développement Signal

Note: Ceci est appliqué uniquement pour la coloration chromogène.

1. Préparer 100 pi deréactif avidine-biotine-complexe (ABC) pour améliorer les signaux en ajoutant 1 pl de réactif A (avidine) dans 98 ul de 0,2% PBST, mélanger soigneusement par pipetage doux, et en ajoutant 1 pl de réactif B (biotine conjugué à la peroxydase de raifort ), suivi par un mélange immédiat. Incuber le mélange pendant 30 min à température ambiante avec une agitation douce.
2. Incuber ovaires (y compris les chambres d'oeuf dissociés) dans le mélange de réactifs A et B pendant 30 min à température ambiante avec une agitation douce.
3. Laver le mélange des réactifs A et B avec du PBST 0,2% 4 fois pendant 10 min chacune.
4. Transfert ovaires immergés dans du PBST à un puits sur la plaque de place avec un compte-gouttes en plastique.
5. Préparer la solution de substrat de la 3,3'-diaminobenzidine (DAB): dissoudre une pastille de DAB plus une autre contenant de l'urée peroxyde d'hydrogène dans 1 ml de O ₂ ddH par tourbillonnement vigoureux pendant 1 min.
   REMARQUE: DAB, un substrat précipitant de peroxydase, est un chromogène populaire pour immunocoloration. Il produit une brprécipité propre et insoluble après avoir été oxydé par la peroxydase. Des signaux faibles peuvent être améliorées par addition de chlorure de nickel à la solution de substrat (concentration finale de 0,05 à 0,08% de).
6. Retirer la solution de PBST restant dans le puits et le remplir avec 100 ul de la solution de substrat DAB pour le développement du signal.
7. Surveiller l'intensité des signaux sous un microscope stéréo à faible grossissement.
8. Arrêtez réactions en retirant la solution DAB, suivie par le remplissage avec 1x PBS immédiatement. Répéter deux fois le lavage.
9. Transfert ovaires vers le tube de 1,5 ml, puis laver avec 1x PBS ou de PBST deux fois pour 15 minutes chacun.
10. Incuber ovaires dans un milieu de montage à base de glycérol (70% de glycerol) O / N à 4 ° C avec une agitation douce.

8. Montage du puceron embryons

REMARQUE: L'épaisseur des embryons de pucerons varie entre stades de développement. Stratégies de montage sont ainsi modifiées pour tenir début (germaria et les étapes 0-10), MID (stades11-18), et des embryons (stades tardifs 19-20), qui sont démontrées sur la figure 2B - D. Mise en scène embryonnaire suivi Miura et al ^12.

1. Transfert des ovaires avec un milieu de montage sur le plateau de la cellule avec un compte-gouttes en plastique et d'observer les échantillons sous un microscope stéréo à faible grossissement.
2. Couper les calices associés à l'oviducte latéral utilisant des broches insectes et ensuite transférer un ovariole isolé à un verre vide bien avec un compte-gouttes. Compléter le volume final à 50-100 ul en utilisant un milieu de montage.
3. Transférer un ovariole sur la lame avec un compte-gouttes de verre et ensuite disséquer chambres d'œufs d'insectes à l'aide de broches.
   NOTE: Pour les embryons âgés de plus de 6 stade du développement, la séparation des chambres d'œufs est suggéré; pour germaria et les deux premières chambres d'œufs de moins de l'étape 6, la séparation est facultative.
4. Relocaliser une chambre d'oeuf disséqué à une lame propre en utilisant un compte-gouttes en verre.
5. Mettez une lamelle (taille: 22 x 22mm) sur les germaria disséqués ou chambres d'œufs (contenant des embryons à des stades du développement 1-10) lentement pour éviter les bulles.
   1. Mont chambres d'œufs (contenant des embryons à des stades du développement 11-18) sur une diapositive avec pont de lamelle d'un côté et de placer une autre lamelle (taille: 18 x 18 mm) sur le dessus de l'échantillon.
   2. Mont chambres d'œufs (contenant des embryons âgés de plus de 19 stade du développement) sur une lame à double-face pont lamelle et placer un autre lamelle (taille: 18 x 18 mm) sur le dessus de l'échantillon.
6. Remplir l'espace sous la lamelle supérieure avec les médias de montage pour éviter le dessèchement de l'échantillon.
7. Légèrement rouler l'embryon en faisant glisser la lamelle pour obtenir le droit d'orientation pour l'observation.
8. Sceller le pourtour de lamelles (y compris les lamelles de pont) avec du vernis à ongles.

9. Analyse d'imagerie

1. Photo contraste d'interférence différentiel (DIC) des images de l'ensemble du montage embryons avec un compound microscope optique équipé d'DIC et une lentille d'objectif sec (10X, 20X, 40X) relié à une caméra. Installez le logiciel de transfert d'image entre la caméra et l'ordinateur en utilisant les instructions du fabricant.
2. Acquérir projections des embryons marqués par fluorescence avec un laser à balayage microscope confocal ^14. Suivez les instructions du fabricant pour photographier, z-empilage, et 3D projection avec un logiciel d'imagerie.
   1. Tournez la lame à l'envers, trouver l'échantillon monté avec objectif 10x, et encercler la zone de l'échantillon avec un stylo à base huilée bien.
      NOTE: Cela rend l'identification de l'échantillon plus facile lors de la recherche à travers des objectifs d'un microscope confocal.
   2. Ajouter une goutte d'huile sur le dessus de la zone de lamelle dont le côté opposé est marqué comme décrit au point 9.2.1.
3. Trouver le plan focal à 40X objectif à immersion d'huile puis changer pour un objectif à immersion d'huile 63X. Déplacer manuellement le réglage fin de mise au point et faireWN pour capturer le meilleur plan focal.
   NOTE: Pour observer des détails structurels de germaria et embryons précoces, nous vous conseillons d'utiliser 40X objectifs ou ceux avec un plus fort grossissement.
4. Balayez l'embryon dans différents canaux d'excitation et d'obtenir une image z-stack.
   NOTE: Pour les tissus de pucerons du pois, de réduire l'épaisseur de chaque section optique jusqu'à 1,5 um ou moins.

Résultats

Dans cette étude, nous avons effectué tout le montage immunocoloration sur des embryons de pucerons du pois asexuées (figure 1A). Ces femelles produisent progéniture par parthénogenèse et vivipares. Ces embryons femelles se développent dans des chambres d'œufs des tubules ovariens (de ovarioles) (figure 1B et figure 2A). Avant la microscopie, les ovarioles disséqués sont les cibles de coloration; Toutefois, la séparation d...

Discussion

Nous avons identifié des conditions optimales critiques immunocoloration succès dans le puceron du pois A. Pisum, un organisme modèle émergent des études de génomique et de développement ^3,15. Des conditions optimisées pour augmenter la perméabilité du tissu et réduire la coloration de fond amélioré l'intensité et la spécificité des signaux. Ils diffèrent des protocoles standard pour immunocoloration dans d'autres modèles animaux dans les étapes de création de por...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% hydrogen perxidase (H2O2)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	11585762001	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.