Идентификация критических условий для Иммуноокрашивание в гороховой тли эмбрионов: Повышение проницаемости тканей и уменьшения фонового окрашивания

Резюме

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

Аннотация

Гороха тля гороховая тля, с геномом, последовательность и обильным фенотипической пластичности, стала моделью для новых геномных исследований и развития. Как и другие тли, А. Pisum быстро распространяться с помощью партеногенетической живородящих воспроизводства, где эмбрионы развиваются в течение яичных камер в сборочной линии в яйцевая трубка. Ранее мы создали надежную платформу всей горе-гибридизация, позволяющий обнаруживать экспрессии мРНК в эмбрионы тлей. Для анализа экспрессии белка, хотя, разработали протоколы иммуноокрашивания в овариол бесполого живородящих тлей не дает удовлетворительных результатов. Здесь мы сообщаем условия, оптимизированные для увеличения проницаемости тканей и уменьшения фонового окрашивания, оба из которых были проблемы при применении установленных подходов. Оптимизация включает: (1) инкубацию протеиназы К (1 мкг / мл, 10 мин), который был найден существенный Fили проникновение антител в середине и в конце этапа тли эмбрионов; (2) замена нормальной козьей сыворотке / бычьего сывороточного альбумина с блокирующим реагентом, подаваемой дигоксигенином (DIG) основе буфера установить и (3) применение метанола, а перекись водорода (H _{2 O 2)} для отбеливания эндогенной пероксидазы; что значительно уменьшило окрашивание фона в тлей тканей. Эти критические условия, оптимизированные для иммуноокрашивания позволит осуществлять эффективное выявление генных продуктов в эмбрионах а. PISUM и других тлей.

Введение

Тли hemipteran насекомые с небольшой (1-10 мм) мягких тел. Они питаются растениями, высасывая сок флоэмы с пронзительными ротового аппарата. Кроме того, они полагаются на облигатной эндосимбиотических бактерии, Buchnera aphidicola, синтезировать незаменимые аминокислоты, которые испытывают дефицит флоэмы сока диеты. Тли имеют сложную историю жизни, что включает в себя партеногенетическое живородящих воспроизведение весной и летом длинного дня фотопериодов и сексуальной яйцекладущие воспроизводства, вызванного короткого дня фотопериодов в течение которого они лежали ограниченное количество зимующих яиц ^1,2. Весной эти яйца люк, чтобы произвести первое поколение все женщины тлей (fundatrices), следующая много раундов партеногенетической воспроизводства до осени. Циклический партеногенез в тлей, где бесполое и половое фазы чередуются в годичном цикле жизни, была расценена как эволюционный новизны ^1,2. В партеногенетических живородящие тлей, Эмбриогенез происходит внутри яйца палат яичников канальцев (овариол). Напротив, сексуальные яйценосные эмбрионы развиваются в удобренных яиц. Помимо репродуктивного пластичности, тли может отображать трансгенерационной крыло polyphenism: в ответ на перенаселенность сигналов и хищников угроз, то unwinged бесполые самки могут производить viviparously крылатого потомства для дальней миграции. Публикация генома в гороховой тли гороховая тля -Первый последовательность генома для базальной hemimetabolous насекомых позволяет дальнейшее изучение репродуктивного пластичности, крыла polyphenism и других функций, включая насекомых растений взаимодействий, вирусной векторизации и симбиоза в тлей на молекулярном Основой ^3.

В дополнение к геномом, последовательность, методов структурного гена и экспрессию функцию необходимы для содействия гороховой тли как зрелый модельного организма ^4. Мы описали надежные протоколы всей горе- в гибридизация для определения экспрессии мРНК в тлей эмбрионов ^5-7. РНК-интерференция (RNAi) с помощью двухцепочечной РНК инъекции и кормления был использован для генной глушителей в тлей нимф и взрослых, но стабильные условия для гена нокдаун в эмбрионов пока не сообщается ^8-10. Иммуноокрашивание, подход на основе антител, которые можно обнаружить экспрессию белка в образцах до и после RNAi нокдауна, была выполнена на гороховой тли эмбрионов ^11-13. Тем не менее, увеличение проницаемости тканей и ликвидации фоне окрашивания пока еще неудовлетворительно, используя стандартные протоколы для иммуноокрашивания в бесполых живородящих эмбрионов гороховой тли. Например, мы обнаружили, что проникновение антител к тканям снизилась в gastrulating эмбрионов (стадии 8-10) и, что эмбрионы с морфологически идентифицируемые почки конечностей (стадии 13-14) были едва проницаемой для антител. Кроме того, фон окрашивание визуализировали в бесполого viviparoкомпании эмбрионы гороховой тли окрашенные с помощью антитела против зародышевой линии маркера Васа, а также, что против белка Engrailed / внесенный выраженной в эмбриональных сегментов ^12,13. На самом деле фон окрашивание еще ясно видны в эмбрионах, окрашенных только вторичным антителом.

Для того чтобы увеличить проницаемость без повреждения целостности тканей тли, мы тщательно титруют концентрации протеиназы К, и определяют оптимальные условия для переваривания тканей эмбрионов на тлей. Для того чтобы избежать неспецифического окрашивания в гороховой тли, мы искали соединений, которые могли бы эффективно блокируют эмбрионов и подавления активности эндогенной пероксидазы (POD), фермент, используемый для усиления сигналов во иммунное окрашивание. Блокирующий реагент обеспечивается дигоксигенином (DIG) основе набора буфера, а традиционно используемой нормальной козьей сыворотки (NGS) / бычий сывороточный альбумин (БСА), значительно уменьшается фоновое окрашивание. Кроме того, метанол было обнаружено inhiбит эндогенного POD деятельность более эффективно, чем перекись водорода _(H 2 O _2). Подробнее об этих тлей конкретных условий иммуноокрашивания на зародышах будут описаны в следующих разделах.

протокол

1. Культура тлей

ПРИМЕЧАНИЕ:. Лаборатория штамм партеногенетической живородящих гороховой тли А Pisum был первоначально собраны в центральной части Тайваня и была дыбы на растениях-хозяевах (Сад горох Pisum посевного или бобы Vicia аба) под длинного дня фотопериода более чем 300 поколений (одно поколение: ~ 10 дней).

1. Прорастание семян
   1. Замочите семена растений-хозяев в водопроводной воде в течение 3-5 дней при комнатной температуре. Залейте свежей водой один раз в день.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, положив семена растений-хозяев прямо в влажную почву может вызвать прорастание, а также.
   2. Вырастить 10 прорастающие семена в небольшой горшок (диаметром 9 см х 7 см высотой) с почвой в камере роста при фотопериод 16 ч света / 8 ч темноты при 20 ° С.
   3. Около 10 дней после начала роста, передачи тлей на растениях, высота которых составляет более 8 см.
2. Передача тлей
3. Храните каждый горшок растений в 1 л стеклянный стакан, передавать 8 взрослых тлей на растениях с использованием кисти, а затем запечатать стакан с воздухопроницаемой крышкой, такой как марля сетки для предотвращения тлей от побега.
4. Инкубируйте тлей в ростовой камере при фотопериод 16 ч света / 8 ч темноты при 20 ° С. Воды каждый цветочный горшок растений один раз в день.
5. Для получения следующего поколения тлей, повторяем шаги 1.1.3-1.2.2 десять дней после первичного переноса тли.

2. Разбор и фиксации яичников

1. Свежий получение 4% параформальдегида (PFA) в 1X фосфатно-солевом буфере (PBS) в качестве буфера фиксации.
2. Заполните одну скважину пятна пластины с PFA (около 500 мкл), поместите пластину под стерео микроскоп на малом увеличении, и погрузите взрослую тля в PFA для вскрытия.
3. Проанализируйте яичники, удерживая голову и живот с одним набором щипцов, разрезав спиннойкутикула живота, и перетащив яичники от брюшной полости.
4. Исправление три пары яичников в 1,5 мл пробирку, содержащую 1 мл PFA при комнатной температуре в течение 20 мин.
5. Слить буфер фиксация с пипетки (из стекла или одноразовые), а затем вымыть яичники с 0,2% Тритон-100 в 1x PBS (PBST) 3 раза в течение 10 минут каждый. Легкая дрожь на смеситель / ротатора (угол поворота: 60 ​​° (F60) / скорость вращения: 8 оборотов в минуту) рекомендуется как для фиксации и стирки.

3. Лечение протеиназы К (PK), чтобы увеличить проницаемость эмбриональных тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: лечение ПК применяется для эмбрионов с расширением зоны зародышей дальнейшей стадии (11 развития). Для младших эмбрионов, этот шаг не является обязательным.

1. Серийно разбавить исходный раствор PK (10 мг / мл) с 1x PBS в концентрации 1 рабочий мкг / мл.
2. Инкубируйте яичники с 1 мкг / мл PK (около 500 мкл) в течение 10 мин с умеренным встряхивании.
3. Слить ПК Solutiна и затем промыть яичники 700 мкл глицина (2 мг / мл) 3 раза в течение 5 минут каждый.
4. Промыть яичники с 0,2% PBST в два раза в течение 10 мин каждый.
5. Исправление яичники снова фиксации буфера в течение 15 мин при комнатной температуре при умеренном встр хивании.
6. Удалите супернатант и мыть яичники с 0,2% PBST в два раза в течение 10 мин каждый.

4. Метанол Инкубационный для подавления эндогенной пероксидазы (POD) деятельности

Примечание: Метанол инкубации не применяется к эмбрионов, подвергнутых фаллоидином окрашивания или антитела эпитопов, которые чувствительны метанола.

1. Серийно обезвоживают яичники с различным процентным метанола в 0,2% PBST (объем / объем: 1: 3, 1: 1, 3: 1) путем инкубации яичники при каждой концентрации раствора метанола в течение 10 мин с умеренном перемешивании.
2. Высушить яичники с 100% -ным метанолом в течение 1 часа при комнатной температуре при умеренном встр хивании.
   Примечание: Удовлетворительные результаты окрашивания еще может быть получена из тли тканей, которые были сохранены в 100% метаноле при -20 &# 176; С в течение одного месяца.
3. Серийно увлажняет яичники с различным процентным метанола в 0,2% PBST (объем / объем: 3: 1, 1: 1, 1: 3) путем инкубации яичники при каждой концентрации раствора метанола в течение 10 мин с умеренном перемешивании.

5. Антитела Окрашивание

1. Развести 10x блокирующий раствор из DIG-основе набора буфера (DIG-B), 1x.
   Примечание: Блокирующий раствор 1x DIG-B является более эффективным для снижения фоновое окрашивание, чем стандартным блокирующим реагентом, состоящей из 5% (объем / объем) нормальной козьей сыворотки (NGS) и 0,5% (об / об) альбумина бычьей сыворотки (BSA ) в 0,2% PBST.
2. Инкубируйте яичники с 1x DIG-B блокирующим раствором в течение 2,5 до 4 часов при комнатной температуре или O / N при 4 ° С с мягким встряхиванием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для трех пар яичников в 1,5 мл трубки, 200 мкл минимальный объем для блокирования образца и окрашивания антител.
3. Слейте супернатант и заменить свежим блокирующего 1x DIG-B раствор, содержащий первичное антитело на соответствующей dilutiна соотношение. Пятно яичники в течение 4 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С с мягким встряхиванием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для эксперимента, описанного здесь, используйте следующие оптимальные разведения первичных антител: (1) ApVas1 антител: 1: 500 для окрашивания хромогенным, 1:50 для иммунофлуоресцентного; (2) анти-α тубулина антитела: 1: 500; (3) 4D9 моноклональное антитело: 1:25.
4. Вымойте яичники 0,2% PBST 4 раза в течение 15 мин каждый.
5. Инкубируйте яичники с 1x DIG-B блокирующим раствором в течение 1 часа при комнатной температуре при умеренном встр хивании.
6. Слейте супернатант и заменить свежим 1x блокирование DIG-B раствор, содержащий вторичное антитело на соответствующий коэффициент разбавления. Пятно яичники в течение 4 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С с мягким встряхиванием.
   1. Используйте следующие коэффициенты разбавления вторичных антител: (1) Для иммунофлюоресцентного окрашивания: 1: 500 для Alexa Fluor 633 козьего анти-кроличьего IgG или Alexa Fluor 488 козьего антитела против IgG мыши; (2) Для хромогенного окрашивания: 1: 200 для биотинилированного козьего антитела IgG кролика.
      Примечание: биотинилированный вторичное антитело применяется для взаимодействия с авидин-биотин-комплекса (ABC) в обнаружении подложки на основе (хромогенного), через которые окрашивающие сигналы значительно усиливается.
   2. Для иммунофлуоресцентного, провести окрашивание в темноте, потому что вторичное антитело является светочувствительным.
7. Смыть вторичного антитела с 0,2% PBST 4 раза в течение 10 мин каждый.

6. Ядерная и F-актин Окрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Это применяется только для иммунофлуоресцентного.

1. Пятно яичники с 0,2% PBST, содержащем DAPI (2 нг / мкл) и фаллоидином-TRITC (100 нм) в течение 2 ч при комнатной температуре в темноте.
2. Вымойте яичники 0,2% PBST 4 раза в течение 10 мин каждый.
3. Инкубируйте яичники с монтажной средней O / N при 4 ° С с мягким встряхиванием.

7. Разработка сигнала

ПРИМЕЧАНИЕ: Это применяется только для хромогенным окрашивания.

1. Подготовьте 100 мклРеагент авидин-биотин комплекса (ABC) для усиления сигналов, добавляя 1 мкл реагента А (авидин) в 98 мкл 0,2% PBST, тщательно перемешивая с помощью нежного пипетки, и добавление 1 мкл реагента В (биотин, конъюгированного с пероксидазой хрена ), с последующим немедленным перемешиванием. Выдержите смесь в течение 30 мин при комнатной температуре при умеренном встр хивании.
2. Инкубируйте яичников (в том числе диссоциированного яиц камер) в смеси реагентов А и В в течение 30 мин при комнатной температуре при умеренном встр хивании.
3. Смыть смесь реагентов А и В с 0,2% PBST 4 раза в течение 10 мин каждый.
4. Передача яичники погружен в PBST, чтобы хорошо на месте пластины с пластиковой капельницы.
5. Готовят раствор субстрата 3,3'-диаминобензидина (DAB): растворить одну таблетку DAB плюс еще один, содержащий перекись водорода мочевины в 1 мл DDH _{2 O} через энергичном вортексе в течение 1 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: DAB, осаждающим субстрат пероксидазы, является популярным Хромоген для иммунной окраски. Она производит BRсамостоятельно и нерастворимый осадок после окисления с пероксидазой. Слабые сигналы могут быть расширены путем добавления хлорида никеля в растворе субстрата (конечная концентрация 0,05-0,08%).
6. Удалить PBST Раствор, оставшийся в скважине и залить 100 мкл субстрата DAB раствора для развития сигнала.
7. Монитор интенсивности сигналов с помощью стереомикроскопа при малом увеличении.
8. Остановка реакции путем удаления раствора DAB, с последующим заполнением 1х PBS немедленно. Повторите мыть два раза.
9. Перевести яичники обратно в 1,5 мл трубки и затем промыть 1x PBS или ФБРТ дважды в течение 15 мин каждый.
10. Инкубируйте яичники в глицериновой основе монтажа среды (70% глицерин) O / N при 4 ° С с мягким встряхиванием.

8. Монтаж тли эмбрионов

Примечание: толщина эмбрионов варьирует от тли стадиях развития. Монтажные стратегии, таким образом, модифицированный в соответствии рано (germaria и этапы 0-10), середине (этапы11-18), и в конце эмбрионов (стадии 19-20), которые демонстрируются на рис 2B - D. Эмбриональные постановка последовал Miura и др. ¹²

1. Передача яичники вместе с монтажной среды в лоток клеток с пластиковой капельницы и наблюдать образцы с помощью стереомикроскопа при малом увеличении.
2. Разрежьте чашечек, связанные с боковой яйцевода с использованием насекомых булавками, а затем передать изолированных яйцевая трубка с пустой стакан хорошо капельницей. Составьте окончательный объем до 50-100 мкл при помощи монтажного среду.
3. Перенесите яйцевая трубка на слайде со стеклянной пипетки, а затем рассекают яичные камеры, используя насекомых булавками.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для эмбрионов старше этапе 6 развития, отделение яиц камер предложил; для germaria и первых двух яичных камер моложе этапе 6, разделение не является обязательным.
4. Переезд в расчлененный яйцо камеру на чистую слайд с помощью стеклянной пипетки.
5. Положите покровное (размер: 22 х 22мм) над расчлененным germaria или яйцо камер (содержащий эмбрионов на стадии 1-10 развития) медленно, чтобы избежать пузырей.
   1. Гора яйцо камеры (содержащий эмбрионов на стадии развития 11-18) на слайде с односторонним покровного моста и поместите другой покровное (размер: 18 х 18 мм) в верхней части образца.
   2. Гора яйцо камеры (содержащий эмбрионов старше этапе 19 развития) на слайде с двухсторонней покровного моста и поместите другой покровное (размер: 18 х 18 мм) в верхней части образца.
6. Заполните пространство под верхней покровное с монтажными СМИ, чтобы избежать высыхания образца.
7. Мягко катите эмбрион, сдвинув покровное, чтобы получить правильный ориентацию для наблюдения.
8. Печать по краям покровных (в том числе мостовых покровные) с лаком для ногтей.

9. Анализ изображений

1. Фотография дифференциальный интерференционный контраст (DIC) изображений целом монтажа эмбрионов с compouго микроскопа, снабженного DIC оптики и сухой объектива (10X, 20X, 40X) подключен к камере. Установка программного обеспечения для передачи изображений между камерой и компьютером, используя инструкции производителя.
2. Приобретать проекции флуоресцентно меченных эмбрионов с лазерной сканирующей конфокальной микроскопии ^14. Следуйте инструкциям производителя для фотографирования, г-укладка, проектирование и 3D с программным обеспечением обработки изображений.
   1. Включите слайд вниз, найти установленный образец с 10-кратным цель, и обведите область образец с ручкой маслом на основе тонкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это делает идентификации образца легче при поиске его через целей конфокальной микроскопии.
   2. Добавить каплю масла в верхней части области покровное которого противоположная сторона обозначается как описано в разделе 9.2.1.
3. Найти фокальной плоскости при 40-кратном нефти погружения цели, то изменить к 63x нефти погружения цели. Двигаться вручную мелкий контроля фокуса и сделатьWn, чтобы захватить лучший фокальной плоскости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для соблюдения структурные детали germaria и ранних эмбрионов, мы предлагаем использовать 40х или тех, с большим увеличением.
4. Сканирование эмбриона в различных каналах возбуждения и получить г-стека изображение.
   Примечание: В гороховой тли тканей, уменьшить толщину каждого оптического участка до 1,5 мкм или менее.

Результаты

В этом исследовании, мы провели целый монтажа иммуноокрашивания на эмбрионах бесполого гороха тлей (Рис. 1А) Эти женщины производят потомство партеногенетически и viviparously. Эти женщины эмбрионы развиваются в течение яичных палат яичников канальцев (овариол)

Обсуждение

Мы определили оптимальные условия решающее значение для успешного иммуноокрашивания в гороховой тли А. Pisum, появляющаяся модельный организм для геномных исследований и развития ^3,15. Оптимизированные условия для увеличения проницаемости тканей и уменьшения окрашивани?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% hydrogen perxidase (H2O2)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	11585762001	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.