エンドウアブラムシ胚における免疫染色のための重要な条件の同定：組織透過性を増大し、バックグラウンド染色を減少

要約

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

要約

配列決定されたゲノムと豊富な表現型可塑性とエンドウAcyrthosiphonエンドウアブラムシは、ゲノムおよび発達の研究のための新たなモデルとなっています。他のアブラムシ、Aのよう 。 エンドウ胚は卵巣管に組立ライン方式で卵の室内で開発単為生殖胎生再現、を経て急速に伝播します。これまで我々は、アブラムシの胚におけるmRNA発現の検出を可能にするin situハイブリダイゼーションホールマウントの堅牢なプラットフォームを確立しています。タンパク質の発現を分析するために、しかし、満足な結果を生じなかった無性胎生アブラムシのovariolesを免疫染色するためのプロトコルを確立しました。ここでは、組織透過性を増加させ、確立されたアプローチを適用する際に問題があったどちらもバックグラウンド染色を、減少させるための最適化された条件をレポートします。最適化が含まれます：必須のFを発見されたプロテイナーゼK（1 / mlの、10分）、の（1）のインキュベーション中・後期アブラムシ胚または抗体の浸透; （2）ジゴキシゲニン（DIG）により供給されるブロッキング試薬と正常ヤギ血清/ウシ血清アルブミンの交換は、バッファセットと、内因性ペルオキシダーゼを漂白するためにメタノールではなく、過酸化水素（H ₂ O _{2）、（3）}アプリケーションをベース。これはかなりアブラムシ組織におけるバックグラウンド染色を減少させました。免疫染色のために最適化されたこれらの重要な条件は、A。 エンドウ及び他のアブラムシの胚における遺伝子産物の効果的な検出を可能にします。

概要

アブラムシは、小さな（1-10 mm）のソフトボディと半翅目の昆虫です。彼らはピアス口器と師部の樹液を吸引することにより、植物を餌に。さらに、彼らは師部樹液の食事で不足している必須アミノ酸を合成するために、必須の細胞内共生細菌、 ブフネラの aphidicolaに依存しています。アブラムシは、春と夏の長日日長、彼らは越冬卵^1,2の数が限られて横たわっている間、短日の光周期によってトリガ性的卵生再生時の単為生殖胎生再生を含んで複雑 ​​な生活史を持っています。春に秋まで単為生殖の多くのラウンドに続いて、すべての女性のアブラムシ（fundatrices）の第一世代を生成するために、これらの卵が孵化。毎年恒例のライフサイクルにおける無性生殖と有性段階の代替アブラムシの周期的単為生殖は、進化のノベルティ^1,2と見なされてきました。単為生殖胎生アブラムシで、胚発生は、卵巣細管（ovarioles）の卵の室内で行われます。これとは対照的に、性的卵生の胚は受精卵で開発しています。別に生殖可塑性から、アブラムシは、世代間の翼polyphenismを表示することができます。過密信号と捕食者の脅威に対応して、翼のない無性女性はviviparously長距離移動のための翼の子孫を生成することができます。エンドウヒゲナガアブラムシのゲノム配列の公表Acyrthosiphonエンドウ -theの最初のゲノム配列基礎不完全変態の昆虫ができます生殖可塑性、翼polyphenism、分子のアブラムシで昆虫植物の相互作用、ウイルスベクタとの共生など、他の機能のさらなる調査基礎^3。

ゲノム配列決定に加えて、遺伝子発現および機能を特徴づけるためのツールは、成熟したモデル生物として⁴エンドウアブラムシを促進するために必要とされます。我々は全体のマウントの堅牢なプロトコルを記載していますアブラムシ胚^5-7でのmRNAの発現を検出するためのin situハイブリダイゼーション。二本鎖RNAの注入と給電ビアRNA干渉（RNAi）はアブラムシの幼虫及び成虫における遺伝子サイレンシングのために使用されてきたが、胚における遺伝子ノックダウンのための安定した条件がまだ^8-10報告されていません。免疫染色、およびRNAiノックダウン後、エンドウアブラムシ胚^11-13で行われた前のサンプル中のタンパク質の発現を検出することができる抗体に基づくアプローチ。しかし、組織透過性およびバックグラウンド染色の除去の増加は、エンドウアブラムシの無性胎生胚における免疫染色のための標準プロトコルを使用して、まだ不十分です。たとえば、私たちは、組織への抗体の浸透が（ステージ8-10）胚をgast​​rulatingに減少し、形態学的に識別可能な肢芽（ステージ13〜14）との胚は、抗体にほとんど透過性であることがわかりました。また、バッ​​クグラウンド染色は無性viviparoで可視化されました私たちエンドウアブラムシの胚は、生殖細胞系列マーカーヴァーサだけでなく、胚性セグメント^12,13で表現エングレイルド/半円形の波形のタンパク質に対するそのに対する抗体を用いて染色しました。実際にはバックグラウンド染色は、まだ二次抗体のみで染色した胚ではっきりと見えました。

アブラムシ組織の完全性に損傷を与えることなく、透過性を高めるために、我々は慎重にプロテイナーゼKの濃度を滴定し、アブラムシの胚における組織消化のための最適条件を決定しました。エンドウアブラムシに非特異的な染色を避けるために、我々は、効率的に胚をブロックし、免疫染色の間、信号を増幅するために用いられる酵素の内因性のペルオキシダーゼ（POD）の活性を抑制し得る化合物について検索しました。伝統的に使用される通常のヤギ血清ではなく（NGS）、ジゴキシゲニン（DIG）ベースのバッファセットによって提供されるブロッキング試薬/ウシ血清アルブミン（BSA）は、有意にバックグラウンド染色を減少させました。また、メタノールはINHIことが見出されましたより効果的に過酸化水素（H ₂ O _2）に比べ、内因性POD活性をビット。胚の免疫染色のためにこれらのアブラムシ、特定の条件に関する詳細は、以下のセクションで説明します。

プロトコル

アブラムシの1.文化

注：単為生殖胎生エンドウアブラムシAの実験室株エンドウは、もともと台湾中部に回収し、300以上の世代のために長日の光周期の下で宿主植物（エンドウのエンドウのマメやソラマメソラマメ ）で飼育されています（一世代：〜10日）。

1. 種子の発芽
   1. 室温で3〜5日間水道水に宿主植物の種子を浸します。 1日1回、新鮮な水を補充します。
      注：別の方法として、ストレート湿った土壌に宿主植物の種子を置くことだけでなく、発芽を誘導することができます。
   2. 光周期16時間の明/ 20℃で8時間の暗闇の下で成長チャンバー内の土壌を持つ小さなポット（直径9cm×7センチ）で10発芽種子を栽培。
   3. 成長が始まる約10日後に、その高さが8つ以上センチ、植物にアブラムシを移します。
2. アブラムシの譲渡
   1. 絵筆を使用して植物に8大人のアブラムシ転送、1リットルのガラスビーカー内の植物のそれぞれの鍋を保持し、その後、逃げるのアブラムシを防ぐために、このようなガーゼメッシュなどの通気性のカバーでビーカーをシール。
   2. 20℃での光周期16時間明/ 8時間暗下で成長チャンバー内のアブラムシをインキュベートします。毎日一回植物の各植木鉢に水を。
   3. アブラムシの次の世代を得るために、手順を繰り返す1.1.3-1.2.2 10日の一次アブラムシ転送後。

2.解剖と卵巣の固定

1. 新たに固定緩衝液として1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中4％パラホルムアルデヒド（PFA）を調製。
2. PFA（約500μL）と、スポットプレートの1つのウェルを記入し、低倍率での立体顕微鏡下でプレートを配置し、解剖用のPFA内の大人のアブラムシを沈めます。
3. 背の切開、鉗子の一組で頭と腹部を保持することによって卵巣を解剖腹部のクチクラ、および腹腔から離れて卵巣をドラッグします。
4. 室温で20分間PFAの1ミリリットルを含む1.5 mlチューブに卵巣の3組を修正しました。
5. トランスファーピペット（ガラスまたは使い捨てのいずれか）で固定バッファをデカントした後、10分間毎に1×PBS（PBST）中で0.2％トリトンX-100で3回卵巣を洗います。マイルドミキサー/ローテーターに揺れ（回転角：60°（F60）/回転数：8 RPM）は、固定および洗浄の両方をお勧めします。

3.プロテイナーゼK（PK​​）での処置は、胚組織の透過性を高めるために

注：PK処理は、生殖帯域拡張以降（開発段階11）からの胚に適用されます。若い胚の場合、このステップはオプションです。

1. 直列作業濃度を1μg/ mlから1×PBSでPKのストック溶液（10mg / ml）に希釈します。
2. 穏やかな振盪しながら10分間、PK（約500μL）を1μg/ mlの卵巣をインキュベートします。
3. デカントPK solutiそしてその後、グリシン700μlの（2 mg / mlの）5分ごとに、3回と卵巣を洗いに。
4. 10分ごとに二回、0.2％PBSTで卵巣を洗ってください。
5. 軽度に振盪しながら室温で15分間固定緩衝液で再び卵巣を修正しました。
6. 上清を捨て、10分間ずつ二回、0.2％PBSTで卵巣を洗います。

内因性ペルオキシダーゼ（POD）活性を抑制するための4メタノールインキュベーション

注：メタノールのインキュベーションは、メタノールに敏感であるファロイジン染色または抗体エピトープを施した胚には適用されません。

1. 直列0.2％PBST中のメタノールの異なる割合で卵巣を脱水（3：1：1：1、3：V / V 1）穏やかに撹拌しながら10分間、メタノール溶液の各濃度で卵巣をインキュベートすることによって。
2. 穏やかな振盪しながら室温で1時間、100％メタノールで卵巣を脱水。
   注：染色の良好な結果がまだで、100％メタノール中に保存したアブラムシの組織から得ることができる-20＃176; C 1ヶ月。
3. 直列0.2％PBST中のメタノールの異なる割合で卵巣を再水和（1：1：3：1：1 v / v 3）穏やかに撹拌しながら10分間、メタノール溶液の各濃度で卵巣をインキュベートすることによって。

5.抗体染色

1. 1XのDIGベースのバッファセット（DIG-B）から10倍のブロッキング溶液を希釈します。
   注：1×DIG-Bブロッキング溶液は、5％（v / v）の正常ヤギ血清（NGS）からなる標準的なブロッキング試薬に比べ染色のバックグラウンドを低減し、0.5％（v / v）のウシ血清アルブミンに対してより効果的である（BSA ）0.2％PBSTインチ
2. 穏やかな振盪しながら4℃でRTまたはO / Nで2.5〜4時間、1X DIG-Bブロッキング溶液で卵巣をインキュベートします。
   注：1.5ミリリットルチューブ内の卵巣の三対のために、200μlのサンプルブロッキングと抗体染色のための最小量です。
3. 上清を除去し、適切なdilutiで一次抗体を含む新鮮な1X DIG-Bのブロッキング溶液と交換比に。穏やかな振盪しながら4℃で、RTまたはO / Nで4時間のために卵巣を染色。
   注：ここで説明する実験では、一次抗体の次の最適な希釈液を使用します（1）ApVas1抗体：1：発色性染色のための500を、免疫蛍光染色のために1時50分。 （2）抗αチューブリン抗体：1：500; （3）4D9モノクローナル抗体：1：25。
4. 15分ごとに0.2％PBSTで4回の卵巣を洗ってください。
5. 1X DIG-Bは、穏やかな振盪しながら室温で1時間ブロッキング溶液で卵巣をインキュベートします。
6. 上清を除去し、適切な希釈率で二次抗体を含む新鮮な1X DIG-Bのブロッキング溶液と交換してください。穏やかな振盪しながら4℃で、RTまたはO / Nで4時間のために卵巣を染色。
   1. 二次抗体の以下の希釈比を使用する：（1）免疫蛍光染色の場合：1：アレクサフルオロ633ヤギ抗ウサギIgGまたはAlexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgGについて500。 （2）発色性染色のために1：ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG 200。
      注：ビオチン化二次抗体を染色シグナルが著しく増幅されるを通して基板ベース（発色）の検出にアビジン - ビオチン複合体（ABC）と対話するために適用されます。
   2. 二次抗体は、光に敏感であるため、免疫蛍光染色のために、暗所で染色を行います。
7. 10分ごとに0.2％PBSTで4回、二次抗体を洗い流します。

6.核とF-アクチン染色

注：これは、免疫蛍光染色のために適用されます。

1. 暗所で室温で2時間、DAPI（2 NG /μL）およびファロイジンTRITC（100 nM）を含む0.2％PBSTで染色卵巣。
2. 10分ごとに0.2％PBSTで4回の卵巣を洗ってください。
3. 穏やかな振盪しながら4℃で封入O / Nで卵巣をインキュベートします。

7.シグナル開発

注：これは、発色性染色のために適用されます。

1. 100μlの準備試薬アビジン - ビオチン複合体（ABC）、0.2％PBSTの98μlの試薬A（アビジン）の1μLを加え穏やかにピペッティングを経由して十分に混合し、試薬Bを1μlを追加することにより、信号を向上させるための（西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートビオチン）、即座に混合し​​ました。穏やかな振盪しながら室温で30分間混合物をインキュベートします。
2. 穏やかな振盪しながら室温で30分間、試薬AとBの混合物に（関連付けを解除卵室を含む）の卵巣をインキュベートします。
3. 10分ごとに0.2％のPBSTで4回試薬A及びBの混合物を洗い流します。
4. プラスチックスポイトでスポットプレート上のウェルに、PBST中に沈め卵巣を転送します。
5. 3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）の基質溶液を調製：1 DABタブレットを加え、1分間激しくボルテックスを経由してのddH ₂ O 1ml中の尿素過酸化水素を含む別のものを溶解させます。
   注：DAB、ペルオキシダーゼの沈殿させる基板は、免疫染色のために人気の色原体です。これは、BRを生成ペルオキシダーゼによって酸化された後の自分と不溶性の沈殿物。弱い信号は、基質溶液（最終濃度0.05〜0.08％）と塩化ニッケルを添加することによって高めることができます。
6. ウェル内に残っているPBST溶液を除去し、信号の開発のためのDAB基質溶液100μlを補充します。
7. 低倍率での実体顕微鏡下で信号の強度を監視します。
8. すぐに1×PBSで再充填が続くDAB溶液を除去することにより反応を停止します。二回洗浄を繰り返します。
9. 1.5mlチューブに戻って卵巣を転送した後、15分間ずつ二回、1×PBSまたはPBSTで洗浄します。
10. 穏やかな振盪しながら4℃でグリセロールベースの​​封入剤（70％グリセロール）、O / Nで卵巣をインキュベートします。

8.アブラムシ胚をマウントします

注：アブラムシ胚の厚さは、開発の段階との間で変化します。マウントの戦略は、このように、中間（ステージ、早期（germariaやステージ0-10）を合わせて変更されています11-18）、および図2Bに示されてい後期胚（ステージ19〜20）、 - D。胚のステージングは、三浦らを追った^。12

1. プラスチックスポイト付きセルトレイにメディアをマウントするとともに卵巣を移し、低倍率でステレオ顕微鏡でサンプルを観察します。
2. 虫ピンを使用して横方向の卵管に関連する腎杯をカットした後、スポイトでよく空のグラスに分離された卵巣管を転送します。マウンティング培地を用いて50〜100μlに最終容量をアップしてください。
3. ガラススポイトでスライド上に卵巣管を転送して、虫ピンを使用して卵室を分析。
   注：開発のステージ6よりも古い胚の場合、卵室の分離が提案されています。 germariaとステージ6歳未満の最初の二つの卵室のために、分離はオプションです。
4. ガラススポイトを使ってきれいなスライドに解剖卵室を再配置します。
5. カバースリップ（サイズを置く：22×22ゆっくりと泡を避けるために、解剖germariaまたは卵室mm以上）（発達の段階1-10で胚を含みます）。
   1. 片側カバーガラスの橋でスライド上の（開発段階11-18で胚を含む）マウント卵室と他のカバーガラス（サイズ：18×18 mm）を置き、試料の上に。
   2. マウント卵室両面カバーガラスの橋でスライドに（開発のステージ19よりも古い胚を含む）および他のカバーガラス（サイズ：18×18 mm）を置き、試料の上に。
6. サンプルの乾燥を避けるために取り付けたメディアとトップカバースリップの下のスペースを埋めます。
7. 軽度の観察のための正しい方向を得るために、カバースリップをスライドさせて胚をロールバックします。
8. マニキュアと（ブリッジカバーガラスを含む）カバーガラスのエッジの周りにシール。

9.イメージング解析

1. compouでホールマウント胚の写真微分干渉コントラスト（DIC）画像NDカメラに接続され、DIC光学系および乾燥系対物レンズ（10X、20X、40X）を備えた顕微鏡。製造元の指示を使用して、カメラとパソコンの画像転送用のソフトウェアをインストールします。
2. レーザー走査共焦点顕微鏡¹⁴と、蛍光標識された胚の投影を取得します。 、Z-スタッキングを撮影し、3Dがイメージングソフトウェアを投影するための製造元の指示に従ってください。
   1. 逆さまにスライドを回して、10倍の対物レンズとマウントされたサンプルを見つけ、細かい油を塗ったベースのペンでサンプル領域を一周。
      注：これは、共焦点顕微鏡の対物レンズを介してそれを検索するときにサンプルが容易に識別することができます。
   2. 反対側9.2.1で説明したようにラベル付けされたカバースリップ領域の上に油の滴を追加します。
3. 63×油浸対物レンズに変更し、その後40X油浸対物レンズで焦点面を検索します。手動で微細なフォーカス制御を移動して行いますWNは、最良の焦点面をキャプチャします。
   注：germariaと初期胚の構造の詳細を観察するために、我々は40X目的または高倍率のものを使用することをお勧め。
4. 異なる励起チャンネルで胚をスキャンし、zスタック画像を得ます。
   注：エンドウアブラムシの組織のために、1.5μm以下にまで、各光学部の厚さを薄くします。

結果

本研究では、無性エンドウアブラムシ（ 図1A）の胚のホールマウントの免疫染色を行いました。これらの女性は、単為生殖とviviparously子孫を生産します。これらの女性の胚は、卵巣細管（ovarioles）（ 図1Bおよび図2A）の卵の室内で開発しています。顕微鏡検査の前に、解剖ovariolesは染色標的です。しかし、卵室の分離は、顕微鏡?...

ディスカッション

私たちは、エンドウヒゲナガアブラムシAの成功免疫染色するために重要最適な条件を特定した。 エンドウ 、ゲノムおよび発達研究^3,15のための新たなモデル生物。組織透過性を増加させ、バックグラウンド染色を低減するための最適化された条件は、信号の強度および特異性を増強しました。それらは、細胞膜の孔を作成して、非特異的抗体結合をブロックするための?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% hydrogen perxidase (H2O2)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	11585762001	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.