בידוד של תאי שריר חלק Murine כלילית דם

Summary

מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את טכניקות בידוד וההתרבות של תאי שריר חלק בכלי דם בעכברים עיקריים (VSMCs) מהמחזור כלילית. לאחר VSMCs בודד, הם יכולים לשמש עבור טכניקות תרבות סטנדרטיות רבות.

Abstract

בעוד הבידוד וההתרבות של תאי שריר חלק בכלי דם (VSMCs) מכלי גדול היא מבוססת היטב, חפשנו לבודד ותרבות VSMCs מהמחזור כלילית. לבבות עם קשתות אבי העורקים ללא פגע הוסרו perfused דרך Langendorff מדרדר עם פתרון העיכול המכיל 300 יחידות / מ"ל של סוג collagenase II, 0.1 מ"ג / מעכב טריפסין סויה מ"ל ו 1 M CaCl _2. Perfusates נאספו 15 מרווחי דקה במשך 90 דקות, pelleted ידי צנטריפוגה, resuspended בתקשורת ציפוי, מצופה על מנות בתרבית רקמה. VSMCs התאפיינו בנוכחות SM22α, α-SMA, ו vimentin. אחד היתרונות העיקריים של שימוש בטכניקה זו היא היכולת לבודד VSMCs מהמחזור כלילית של עכברים. למרות שמספר הקטנים של תאים המתקבלים יכול להגביל כמה בקשות אשר התאים יכולים להיות מנוצלים, VSMCs כלילית המבודדת ניתן להשתמש במגוון של טכניקות תרבית תא ומבוססות אסאys. מחקרים החוקרים VSMCs מעכברים מהונדסים גנטי יכולים לספק מידע נוסף אודות פונקציה-מבנה ותהליכי איתות הקשורים פתולוגיות וסקולרית.

Introduction

המטרה של שיטה זו היא לבודד תאי שריר חלק בכלי דם (VSMCs) מהמחזור כלילית murine לשימוש תרבית תאי מבחני תרבית תאים סטנדרטיים. פתחנו בטכניקה זו כדי להעריך את המנגנונים המולקולריים של שיפוץ כלי דם בחולי סוכרת. דיווחנו בעבר פנימה שיפוץ היפרטרופית ב arterioles כלילית במחיצה במודל העכבר db / db של סוכרת ^1. בשל הכמות של רקמה המוגבלת נמצאת התקפי הלב בעכברים במחיצה, ניסיוני בטכניקות תקן חוקר שינויי חלבון (כתם מערבי למשל) בעכברי db / db ובקרה קשות במקרה הטוב. בנוסף, אנו בעבר הראו כי וחסמי רצפטור לאנגיוטנסין (ARB) לוסרטן מפחית את שיפוץ נצפתה בעכברים db / db ^2. לכן, בידוד של VSMCs העיקרי מהמחזור הכליליים מאפשר לנו לבדוק את העניין לעומק שינויים פנוטיפ VSMC או איתות מופעל מסלולים בעכברים סוכרתיים, אשר עשוי להיות contribuטינג שיפוץ עורקיק כלילי לוואי.

מחקרים רבים הובהרו מסלולי איתות הקנונית באמצעות VSMCs מבודד האאורטה מכרסם, ולא כל מיטת כלי דם ספציפית. עם זאת, יש לנו הפגינו וסקולרית-מיטה שיפוץ ספציפיים כלילית, אבי העורקים, ו תפוצה mesenteric של עכברים db / db ^1, דבר המצביע על VSMCs בכל מיטה כלי הדם עשויה להיות שונה. לכן, יש צורך לבודד VSMCs מכל מיטת כלי דם כדי להיטיב להבין את השינויים הפתולוגיים המתרחשים בכל סט של VSMCs. יש שפע של שיטות שונות עבור בידוד culturing VSMCs אבי העורקים. עם זאת, כיום, יש רק מחקר אחד שפורסם על הבידוד של VSMCs מהעכבר כלילית במחזור ^3. טנג et al. היה הראשון לדווח על שיטה לבידוד VSMCs ממחזור העכבר כלילית; עם זאת, יש לנו תוקנו בפרוטוקול באופן משמעותי כפי שהם גם מבודדים cel אנדותלls. מעבדות אחרות גם השתמשו בפרוטוקול מ טנג et al. לבודד מיוציטים עורקים כלילית ותאי שריר חלק בדרכי הנשימה ^4,5. השינויים שאנו נשלב יניבו אוכלוסיית התאים מועשרים עבור VSMCs מהמחזור כלילית.

זלוף המדרדר של לב היונק המבודד, או טכניקת Langendorff, הוקם בשנת 1897 על ידי ⁶ אוסקר Langendorff ועדיין משמש היום נרחב עבור הבידוד של תאים וכלי דם. הטכניקה המוצגת כאן, יחד עם התקדמות שינויים גנטיים בעכברים מודרניים, מספקת כלי רב ערך לחקירה מדוקדקת יותר של ההתנהגות המולקולרית של VSMCs מהמחזור כלילית.

Protocol

משפט ואתיקה: מחקר זה נערך בהתאם המכונים הלאומיים הנחיות בריאות, והיא אושרה על ידי טיפול בבעלי חיים מוסד ועדת שימוש ב- Nationwide בית החולים לילדים.

1. הכנה / גדר

הערה: טכניקת בידוד זה דורש שני סלילי חימום Langendorff ממוצבת Side-by-side על דוכן טבעת, ומחוברת במקביל באמבט מים במחזור.

1. הפעל במחזור אמבט מים ולהתאים טמפרטורה כדי להשיג טמפרטורה סופית של 33-34 מעלות צלזיוס ב קצה צינורית Langendorff (באמבט המים המשמש זה להגדיר מוגדר 40 ° C עקב אובדן C 6-7 ° ב הטמפרטורה על פני צינורות). הפעל המשאבות זלוף ולהגדיר שיעור זלוף 0.5 מ"ל / דקה.
   1. נקו שני סלילי חימום במקטורן מים, צינורות מחוברים ו -25 צינורית מד ידי שטיפה כל אחד עם 50 מ"ל של אתנול 70%, ואחריו 100 מ"ל מים ultrapure autoclaved.
   2. נקה את סלילי החימוםעל ידי דחיפת אוויר עם מזרק ולשטוף עם 10 מ"ל של תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS) ללא פנול אדום. השאר HBSS ב סליל חימום הצינורות.
   3. צרף מזרק luer נעילת סטרילי 10 מ"ל מלא HBSS בטמפרטורת החדר ללא פנול אדום אל צינורות. ודא כי אין בועות אוויר לכודות בתוך סלילי צינורות וחימום בעת צירוף המזרק HBSS המלא שכן הדבר עלול לגרום תסחיפי אוויר במהלך העיכול להשפיע על בידוד VSMC שלילי.
2. הסר את הצינורית 25 מד מן סלילי חימום ומניחים על עוד מזרק 10 מ"ל סטרילי מלא HBSS קר כקרח ללא פנול אדום. שמור את זה על הקרח עד מוכן לשימוש. חזור על פעולה עבור הצינורית האחרת.
3. כן פתרון עיכול אנזימים.
   1. לשקול סוג collagenase 2 על פי מספר פריט ספציפי עבור 75 מ"ל של פתרון העיכול כדי להשיג ריכוז סופי של 300 יחידות / מ"ל.
   2. ממיסים collagenase ב 75 מ"ל של HBSS עם פנול אדום. לאחר מכן, להוסיף 1.5 מ"ל של 0.1 מ"ג / מעכב טריפסין סויה מ"ל ו -75 μl של 1 M CaCl ₂ לתערובת.
4. אם באמצעות פתרון העיכול מיד, לחמם אותו על 37 מעלות צלזיוס. אם לא, למקם אותו על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 שעות. פתרון זה חייב להיעשות טרי מדי יום.
5. כן התקשורת להפסיק פתרון / ציפוי.
   1. הוספת 100 מ"ל חום מומת FBS, 5 מ"ל של L- גלוטמין, 5 מ"ל של חומצות אמינו לא חיוניות, 5 מ"ל של HEPES, ו 1 מ"ל של primocin 500 מ"ל של גלוקוז גבוהה (4.5 גר '/ ל') DMEM. עיקור סנן מומלץ.
   2. Aliquot 6 מ"ל של פתרון להפסיק לתוך כל אחד עשר צינורות חרוטי 15 מ"ל, ממוספרים A1-A6 ו- B1-B6, ומקום ב 4 ° C.. Aliquot 50 מ"ל של תמיסת להפסיק לתוך חרוטי ומקום 50 מ"ל ב 37 ° C חממה.
      הערה: שלב זה יכול גם להיות מוכן היום לפני הבידוד במידת הצורך. להפסיק פתרון זה ישמש תקשורת הציפוי הבאה בידוד תא.
6. הכן שני 1 מ"ל מזרקים מצויד במחט 30 Gעם 100 μl של הפרין (1,000 יחידות / מ"ל).
7. חותכים חתיכה 5 ס"מ של 5-0 משי כירורגית. לקשור קשר בוהן רופף משי כירורגית עם קצה אחד פעמיים כל עוד אחרים. מניחים על צינורית 25-מד, אבל לא להדק. חזור על הפעולה עבור צינורית 25 G אחרים.
8. מלאו ארבע 35 מ"מ צלחות פטרי סטרילי (# 1-4) עם 2 מ"ל של אדום סטרילי, קר כקרח, HBSS ללא פנול. שמור על הקרח.

2. המתת חסד, בידוד לב Cannulation

1. לפני בידוד לב, להבטיח כי פתרון העיכול 50 מיליליטר החרוטים של להפסיק פתרון חמימים. הסר את המזרק HBSS מלא עם 25 מחוברים צינורית G מן הקרח ומניחים מהדק ביורטה (או מהדק טבעת מעמד) על דוכן טבעת.
2. להרדים עכברים באמצעות 3% isofluorane. אשר את העכבר הוא מורדם על ידי מגע אצבע על כל גפיים אחוריים. אם עוויתות הרגל, העכבר עדיין לא הרדים אז תחכה 1 דקות וחזור על קשר הבוהן.
3. לחשוף את וריד הצוואר על ידי הסרת הפרווהעור nd על הקדמי של הצוואר במספריים. לאחר מכן, להשתמש במלקחיים כדי להסיר כל שומן סביב וריד הצוואר בזהירות. לאחר הסרת שומן, להזריק לאט 100 μl של הפרין (1,000 יחידות / מ"ל). מניחים ספוג כירורגית על הווריד כדי למנוע דימום יתר.
4. לאחר 1 דקות, חזה פתוח לחשוף לב, לב טרמפ עם מלקחיים מעוקלים להעיף אותו באמצעות מספריים, והקפד לשמור האאורטה עולה שלם באמצעות סניף brachiocephalic הראשון. מיד למקום הלב לתוך צלחת 35 מ"מ (# 1) עם HBSS קר כקרח ללא פנול אדום ולשטוף.
   הערה: בצע את 4 השלבים הבאים באמצעות היקף ניתוחים.
5. מקם את צינורית 25 G כי הוא רכוב על הטבעת לעמוד בזווית של 45 מעלות, כך הקצה ממוקם רק מתחת לפני השטח של HBSS קר כקרח בצלחת # 2 והוא נראה בבירור מבעד למיקרוסקופ לנתח. מעבירים את הלב בצלחת # 2.
6. בעזרת מלקחיים דומון, לחשוף את אבי העורקים על ידי הסרת שומן עודף בעדינות באמצעות לנתיחה בוטה pניקוב או קריעה יימנע של אב העורקים. לאחר מכן, להשתמש במלקחיים כדי להחליק את אבי העורקים מעל 25 צינורית G.
7. להנחות את הצינורית כלפי מטה דרך אבי העורקים, קרוב, אבל לא מעבר שסתום אבי העורקים, אשר תפגענה שלמות שסתום ולכן, זלוף מדרדר. לאחר הקנייה היא במקום, חלק את המשי מראש קשור על אב העורקים, והדק. לקשור קשר שני כדי ליצור קשר מרובע סביב האאורטה כדי לאבטח את הלב.
8. לאחר האאורטה קשורה באופן מאובטח, בעדינות ולשטוף את הדם שנותר מהמחזור כלילית עם HBSS קר כקרח בתוך המזרק המצורף 25 צינורית G. תשמור על עצמך כדי לא לדחוף יותר מדי כדי למנוע לחץ כלילית מוגזם. רק סומק איטי ועדין מאוד נדרש כדי להשלים את הרצף. דליפה ללא cannulation אבי העורקים יכול להיות גם ציין במהלך סומק עדין זה.
9. הפעל את המשאבה זלוף כדי להתחיל בתהליך של HBSS. הסר את צינורית 25 G (עם הלב המצורף) מן המזרק HBSS המלא, מקפידלשמור על רכזת הצינורית מלאה HBSS, ולחבר אותו סלילי חימום HBSS המלאים החמים. בגין זלוף של הלב עם המשאבה זלוף בשיעור של 0.5 מ"ל / דקה במשך 8 דקות.
10. אחרי הלב הראשון הוא cannulated והוא להיות perfused על המערכת, יש לחזור על שלבי 2.1-2.8 עבור הלב השני. בידודים אלה יהיו מפוצלים עבור כל לב ולכן תכנון ותזמון זהירים נדרשים.

עיכול 3.

1. לאחר שטיפה עם HBSS, לשנות את מזרק 10 מ"ל HBSS כרגע על המשאבה לאחת מלא 10 מ"ל של פתרון העיכול מחומם מראש. Perfuse כל הלב עם פתרון העיכול במשך 12 דקות בקצב של 0.5 מ"ל / דקה. אל תאסוף שברים הנובעים העיכול הראשון כאשר זה יכיל שום דם שריד ותאי האנדותל.
2. לאחר 12 דקות, לשנות את שיעור זלוף 0.4 מ"ל / דקה, להציב חרוטי 15 מ"ל (שפופרת A1 או B1, התואם את הלב הראשון או השני עבור כל מערכת העיכול) מלא solut להפסיק קריון לתוך דלי קרח מתחת ללב כדי להתחיל אוסף perfusate מועשר VSMC.
3. לאחר 15 דקות, לשנות את חרוטי אוסף A2 צינור או B2 ו- A1 צינור ספין חרוטים ו- B1 89 XG במשך 10 דקות מייד לאחר האיסוף של שני השברים. כאשר המזרק מלא עם פתרון העיכול על המשאבה יש פחות מ 1 מיליליטר של תמיסה, להחליף עם מזרק טרי מלא 10 מיליליטר של פתרון עיכול.
4. לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant מהצינור כל אוסף, עוזב כ 0.5 מ"ל. Resuspend גלולה מן A1 עם 2 מ"ל של תמיסת להפסיק חם (או מדיה ציפוי). להוסיף resuspension מהצינור A1 צינור B1 ו- צינור מקום 37 ° C חממה עם כובע רופף.
5. חזור על שלבי 3.3 ו 3.4 עד שכל הצינורות (דרך A6 ו- B6) משמש במשך זמן סך גבייה של 90 דק '. ב 80 דקות של עיכול, לחתוך את קודקוד הלב כדי לשטוף את כל תאים עלולים להילכד בתוך החדר ולאסוף תאים אלה בצינור A6 ו- B6, respectively.
   הערה: לפעמים בלב ייפול הצינורית טרם מועד הזמן 90 הדק '. במקרה כזה, לאחזר את הלב והמקום לתוך צלחת סטרילי 35 מ"מ פטרי מלא 2 מיליליטר של פתרון עיכול. חותכים את הקודקוד של הלב בעדינות ולשטוף את הלב עם פתרון העיכול. לאחר מכן, לסנן את 2 מ"ל של פתרון העיכול דרך מסננת 100 מיקרומטר תא סטרילי לתוך חרוטי 50 מ"ל ולהוסיף צינור A6 או B6.
6. לאחר כל סיבוב של צינורות עוקבים (A2 ו- B2), מוסיף את VSMCs מושעה אל צינור האיסוף הקודם (בשילוב A1 ו- B1). כמו כן, לדאוג לא לתת את פתרון העיכול במשאבה נגמר ולעבור 10 מ"ל המזרקים לפי הצורך ברחבי העיכול.
7. אחרי כל הצינורות משולבים, בצנטריפוגה השעית VSMC העשירי ב 89 XG במשך 10 דקות.
8. לשאוב כמה שיותר supernatant משפופרות אוספות ככל האפשר. Resuspend הגלולה שנותר 2 מיליליטר של ציפוי תקשורת צלחת על צלחת תרבות אחת 35 מ"מ. אני צלחת תרבות מקוםn 37 ° C בחממה במשך 24 שעות.

4. תרבית תאים

הערה: השלם את השלבים הנותרים בארון הבטיחות הביולוגי.

1. לאחר 24 שעות, לשאוב את תקשורת הציפוי בעדינות. התרבות תהיה בדרך כלל יש כמות גדולה של פסולת. כדי לשטוף את התאים, להוסיף 2 מ"ל של חם, PBS סטרילי לטפוח בעדינות את המנה כנגד שתי אצבעות תוך כדי סיבוב בכיוון סיבוב השעון.
2. אחרי סיבוב של 360 מעלות, לשאוב PBS ו חוזר בשנית. לשאוב PBS ולהוסיף 2 מ"ל אחר של PBS סטרילי, חם. בדוק את מנת התרבות תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שיש לא מעט על מנת פסולת על הצלחת. מפגש Cell ניתן לקבוע גם בשלב זה.
3. אם פסולת נשארת בצלחת התרבות, חזור על שלב 4.2. אם מנת התרבות היא ברורה של פסולת, לשאוב PBS ולהוסיף 2 מיליליטר של תקשורת ציפוי החמה.
4. לאחר 24 שעות, לשטוף את התאים שוב עם חם, PBS סטרילי כדי להסיר כל פסולת סופית או תאים מתים מן התרבות. לשאוב PBS ו- pלשרוך עוד 2 מיליליטר של תקשורת ציפוי החמה על התאים.
5. בדוק על התאים בכל יום ולהאכיל כל 48 שעות עם תקשורת ציפוי חממה טריה. בשלב זה, תאים יכולים לשמש מבחני תרבית תאים סטנדרטיים. VSMCs צריך להיות כ -80% ומחוברות 4-5 ימים לאחר הציפוי, למרות עשוי להימשך עד 7 ימים עד ההליך מושלם. אם פיצול לפסוקים הבאים, להשתמש לכל היותר 1: 4 35 מנות מ"מ (או לאזור מקביל תרבות מנות).

תוצאות

בשל ההיבט החדשני טכניקת בידוד VSMC כלילית שלנו, אנחנו בקשנו לקבוע את הטוהר של בידוד התא. עכבר הכליליים VSMCs זוהו מבוסס על מכתים המורפולוגיה immunofluorescence שלהם עד חלוף 2. בהתבסס על המורפולוגיה של התאים בתרבית לאחר הכביסה הראשונה, הליך הבידוד מסיר מיוציטים מה...

Discussion

מטרת המחקר הנוכחי הייתה להסתגל פרוטוקולי בידוד תא קיימים כדי להגדיל את התשואה של כלילית כלי דם החלקה מלבבות בעכברים. רוב העבודה החלוצית בביולוגיה השריר החלק בכלי הדם בוצע עם תאי שריר חלק אבי העורקים חולדה תרבותי. מחקרים אלה סיפקו את הידע הבסיסי של המנגנונים המולקולר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal bovine serum	Life Technologies	16140-071
HEPES 1M solution	Fisher	MT-25-060
Primocin - 20mL	Invivogen	ant-pm-2
DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine)	Life Technologies	11995-065
MEM NEAA 10 mM 100X	Life Technologies	11140-050
L-Glut 200 mM - Gibco	Life Technologies	25030-081
Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh	Fisher	22363549
Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm	Fisher	12-565-91
Harvard Apparatus black silk suture 5-0	Fisher	14-516-124
Collagenase Type-2	Worthington Biochemical	LS004176
Soybean Trypsin Inhibitor 25mg	Sigma	T6522
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear)	Life Technologies	14175-103
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red)	Life Technologies	14170-161
5.0 ml heating coil with degassing bubble trap	Radnoti	158830
11 plus pump	Harvard Apparatus	70-2208
Circulating heated water pump			any brand will work