Isolement de murin coronaire vasculaires cellules de muscle lisse

Résumé

Le but de ce protocole est de démontrer les techniques d'isolement et de culture de cellules murines primaires musculaires lisses vasculaires (CMLV) de la circulation coronaire. Une fois que les CMLV ont été isolés, ils peuvent être utilisés pour de nombreuses techniques de culture standard.

Résumé

Bien que l'isolement et la culture des cellules vasculaires musculaires lisses (CMLV) de grands navires est bien établi, nous avons cherché à isoler et la culture CMLV de la circulation coronaire. Coeurs avec des arcs aortiques intacts ont été enlevés et perfusées via rétrograde Langendorff avec une solution de digestion contenant 300 unités / ml de collagénase de type II, de 0,1 mg / inhibiteur de trypsine de soja ml et 1 M CaCl _2. Les perfusats ont été prélevés à intervalles de 15 minutes pendant 90 min, centrifugées, remises en suspension dans un milieu de plaquage et étalées sur des boîtes de culture tissulaire. CMLV ont été caractérisées par la présence de SM22α, α-SMA et vimentine. L'un des principaux avantages de l'utilisation de cette technique est la possibilité d'isoler les CMLV de la circulation coronaire chez la souris. Bien que le petit nombre de cellules obtenues peuvent limiter certaines des applications pour lesquelles les cellules peuvent être utilisées, les CMLV coronaires isolés peuvent être utilisés dans une variété de techniques et assa bien établies culture cellulaireys. Les études portant sur les CMLV de souris génétiquement modifiées peuvent fournir de plus amples informations sur la structure-fonction et des processus de signalisation associés aux pathologies vasculaires.

Introduction

Le but de cette méthode consiste à isoler les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) à partir de la circulation coronaire murin pour une utilisation dans une culture cellulaire standard et des analyses de culture cellulaire. Nous avons développé cette technique pour évaluer les mécanismes moléculaires de remodelage vasculaire dans le diabète. Nous avons précédemment rapporté à l' intérieur un remodelage hypertrophique dans les artérioles coronaires septal dans le modèle de souris db / db de diabète ^1. En raison de la quantité limitée de tissu trouvés dans les coronaries septal murins, des techniques expérimentales classiques enquête changements de protéines (par exemple de Western blot) chez la souris db / db et de contrôle sont difficiles au mieux. En outre, nous avons précédemment montré que l'inhibiteur des récepteurs de l' angiotensine (ARA) losartan réduit le remodelage observé chez les souris db / db ^2. Par conséquent, l'isolement des CMLV primaires de la circulation coronaire nous permet d'étudier en outre des changements dans les CMLV phénotype ou voies activées de signalisation chez les souris diabétiques, qui peuvent être contributing à défavorable coronaire artériole remodelage.

De nombreuses études ont permis d'élucider les voies de signalisation canoniques utilisant CMLV isolées à partir de l'aorte de rongeurs, plutôt que dans chaque lit vasculaire spécifique. Cependant, nous avons démontré vasculaire lit remodelage spécifique dans coronaire, l' aorte et circulations mésentériques de souris db / db ^1, suggérant les CMLV dans chaque lit vasculaire peut être différent. Par conséquent, il est nécessaire d'isoler les CMLV de chaque lit vasculaire afin de mieux comprendre les changements pathologiques qui se produisent dans chaque ensemble de CMLV. Il y a une pléthore de méthodes différentes pour isoler et cultiver les CMLV aortiques. Cependant, actuellement, il n'y a qu'une seule étude qui a été publiée sur l'isolement de CMLV de la souris de la circulation coronaire ^3. Teng et al. a été le premier à signaler un procédé pour isoler les CMLV de la circulation coronaire de souris; cependant, nous avons modifié le protocole de manière significative car ils ont également isolé cel endothélialels. D' autres laboratoires ont également utilisé le protocole de Teng et al. , Afin d' isoler les myocytes artérielles coronaires et des voies aériennes des cellules musculaires lisses de ^4,5. Les modifications que nous avons incorporés donneront une population de cellules hautement enrichi pour CMLV de la circulation coronaire.

La perfusion rétrograde du cœur de mammifère isolé, ou la technique de Langendorff, a été créé en 1897 par ⁶ Oscar Langendorff et est encore largement utilisé aujourd'hui pour l'isolement des cellules cardiovasculaires. La technique présentée ici, couplé avec l'avancement des modifications génétiques murins modernes, fournit un outil précieux pour examiner de plus près le comportement moléculaire de CMLV de la circulation coronaire.

Protocole

Déclaration éthique: Cette étude a été réalisée en conformité avec les instituts nationaux de lignes directrices de Santé, et il a été approuvé par l'institution de protection des animaux et l'utilisation Comité à l'Hôpital pour enfants Nationwide.

1. Préparation / Mise en place

Remarque: Cette technique d'isolement nécessite deux bobines de chauffage Langendorff positionnés côte à côte sur un support annulaire, et est relié en parallèle à un bain d'eau en circulation.

1. Allumez bain à circulation d'eau et d'ajuster la température pour atteindre une température finale de 33-34 ° C à la pointe de la canule Langendorff (le bain d'eau utilisée dans cette mise en place est fixé à 40 ° C en raison d'une perte C 6-7 ° en température à travers un tube). Allumez les pompes à perfusion et régler le débit de perfusion à 0,5 ml / min.
   1. Nettoyer les deux bobines de chauffage à double enveloppe à l'eau, et un tube attaché de calibre 25 en rinçant chaque canule avec 50 ml d'éthanol à 70%, suivis par 100 ml d'eau ultrapure à l'autoclave.
   2. Effacer les serpentins de chauffageen poussant l'air avec une seringue et laver avec 10 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) sans rouge de phénol. Laisser HBSS dans les serpentins de chauffage et les tubes.
   3. Joindre un 10 ml luer-lock seringue stérile rempli de température ambiante HBSS sans rouge de phénol à la tubulure. Veiller à ce que les bulles d'air sont piégés à l'intérieur des tubes et de chauffage bobines lors de la fixation de la seringue HBSS remplie car cela pourrait provoquer des embolies d'air lors de la digestion d'avoir un impact négatif sur l'isolement de CMLV.
2. Retirer la canule de calibre 25 des serpentins de chauffage et les placer sur une autre seringue de 10 ml stérile rempli de glace-froid HBSS sans rouge de phénol. Gardez cela sur la glace jusqu'à utilisation. Répétez l'opération pour l'autre canule.
3. Préparer la solution de digestion enzymatique.
   1. Peser collagénase de type 2 selon le numéro de lot spécifique pour 75 ml de solution de digestion pour atteindre une concentration finale de 300 unités / ml.
   2. Dissoudre la collagénase dans 75 ml de HBSS avec du rouge de phénol. Ensuite, ajoutez 1,5 ml de 00,1 mg / inhibiteur de trypsine de soja ml et 75 pl de 1 M de CaCl ₂ au mélange.
4. Si vous utilisez immédiatement la solution de digestion, chauffer à 37 ° C. Sinon, la placer à 4 ° C pendant jusqu'à 6 heures. Cette solution doit être fait frais tous les jours.
5. Préparer les médias solution d'arrêt / placage.
   1. Ajouter 100 ml de FBS inactivé par la chaleur, 5 ml de L-glutamine, 5 ml d'acides aminés non essentiels, 5 ml de HEPES et 1 ml de primocin à 500 ml d'une haute teneur en glucose (4,5 g / L), DMEM. Filtre de stérilisation est recommandée.
   2. Aliquoter 6 ml de la solution d'arrêt dans chacun des douze 15 ml tubes coniques, numérotés A1-A6 et B1-B6, et lieu à 4 ° C. Aliquote de 50 ml de solution d'arrêt dans une forme conique de 50 ml et dans 37 ° C incubateur.
      Remarque: Cette étape peut également être préparé le jour avant l'isolement si nécessaire. Cette solution d'arrêt est utilisé comme support de placage après l'isolement des cellules.
6. Préparer deux seringues de 1 ml équipée d'une aiguille 30 Gavec 100 pi d'héparine (1000 unités / ml).
7. Coupez un morceau de soie 5-0 chirurgicale de 5 cm. Attachez un nœud lâche dans la soie chirurgicale avec une extrémité deux fois plus long que l'autre. Placer sur la canule de calibre 25, mais ne pas serrer. Répétez l'opération pour l'autre 25 G canule.
8. Remplissez quatre 35 mm des boîtes de Pétri stériles (# 1-4) avec 2 ml de solution stérile, glacée, HBSS sans rouge de phénol. Gardez sur la glace.

2. Euthanasie, Coeur Isolement et Cannulation

1. Avant l'isolement du cœur, veiller à ce que la solution de digestion et 50 ml conique de solution d'arrêt sont chauds. Retirer la seringue HBSS-remplie de joint 25 G canule de la glace et dans une burette clamp (ou support de bague de serrage) sur un support de bague.
2. Anesthetize souris en utilisant 3% isofluorane. Confirmer la souris est anesthésiée par une touche d'orteil sur chaque membre postérieur. Si les secousses de la jambe, la souris n'a pas encore été anesthésié afin d'attendre 1 min et répéter la toe touch.
3. Exposer la veine jugulaire en enlevant la fourrure d'unnd peau sur la partie antérieure du cou avec des ciseaux. Ensuite, utilisez une pince pour enlever soigneusement toute la graisse qui entoure la veine jugulaire. Après avoir enlevé la graisse, injecter lentement 100 ul d'héparine (1000 unités / ml). Placez une éponge chirurgicale sur la veine pour éviter un saignement excessif.
4. Après 1 min, la poitrine ouverte pour exposer le cœur, le cœur de levage avec des pinces incurvées et exciser à l'aide de ciseaux, en veillant à garder l'aorte ascendante intacte à travers la première branche brachiocéphalique. Placer immédiatement coeur dans un plat de 35 mm (n ° 1) avec de la glace froide HBSS sans rouge de phénol et rincer.
   Remarque: Effectuez les 4 étapes suivantes à l'aide d'un champ de dissection.
5. Positionner le 25 G canule qui est montée sur la bague support à un angle de 45 °, de sorte que la pointe se trouve juste sous la surface de la glace froide HBSS dans un plat # 2 et est clairement visible à travers le microscope de dissection. Transférer le cœur à plat # 2.
6. En utilisant des pinces Dumont, exposer l'aorte en retirant doucement l'excès de tissu adipeux par dissection à prevent poinçonnement ou de déchirure de l'aorte. Ensuite, utilisez une pince pour glisser l'aorte au cours de la 25 G canule.
7. Guide de la canule vers le bas à travers l'aorte, à proximité, mais pas au-delà de la valve aortique, ce qui risque de compromettre l'intégrité de la vanne et par conséquent, la perfusion rétrograde. Une fois que la canule est en place, faites glisser la soie pré-noué sur l'aorte, et serrer. Attachez un deuxième noeud pour former un noeud carré autour de l'aorte pour fixer le cœur.
8. Une fois que l'aorte est solidement attaché, rincer délicatement le reste du sang de la circulation coronaire avec la glace froide HBSS dans la seringue attachée à la 25 G canule. Prenez soin de ne pas pousser trop pour éviter une pression excessive coronarienne. Seule une couleur très lente et douce est nécessaire pour compléter la chasse d'eau. canulation aortique sans fuite peut également être observé au cours de cette chasse d'eau douce.
9. Mettre la pompe de perfusion pour commencer l'écoulement du HBSS. Retirez le 25 G canule (avec le coeur ci-joint) de la seringue HBSS remplie, en prenant soin degarder le moyeu de canule remplie de HBSS, et le connecter à des serpentins de chauffage HBSS remplis chauds. Commencer la perfusion du coeur avec la pompe de perfusion à un débit de 0,5 ml / min pendant 8 min.
10. Après le premier coeur est canulée et est perfusé sur le système, répétez les étapes 2.1-2.8 pour le second coeur. Ces isolations seront décalées pour chaque coeur donc la planification et le calendrier attention sont nécessaires.

3. Digestion

1. Après le rinçage avec du HBSS, changer la seringue 10 ml de HBSS actuellement sur la pompe à une rempli avec 10 ml de solution de digestion préchauffée. Perfuser chaque coeur avec une solution de digestion pendant 12 minutes à un débit de 0,5 ml / min. Ne pas recueillir des fractions issues de cette première digestion car cela va contenir du sang reste et les cellules endothéliales.
2. Après 12 minutes, changer le débit de perfusion de 0,4 ml / min, placer un cône de 15 ml (tube A1 ou B1, qui correspond au premier ou au deuxième coeur pour chaque digestion) remplie de solut d'arrêt à froidion dans un seau à glace sous le coeur afin de commencer CMLV enrichi collection perfusat.
3. Après 15 min, changer la collection conique pour le tube A2 ou d'un tube B2 et de spin conique A1 et B1 à 89 xg pendant 10 minutes immédiatement après le prélèvement des deux fractions. Lorsque la seringue remplie de la solution de digestion de la pompe est inférieure à 1 ml de solution, le remplacer par un 10 ml fraîchement seringue remplie de solution de digestion.
4. Après centrifugation, aspirer le surnageant de chaque tube de collecte, laissant environ 0,5 ml. Resuspendre le culot de A1 avec 2 ml de solution d'arrêt à chaud (ou un support de placage). Ajouter resuspension de A1 tube à B1 et placer le tube 37 ° C incubateur avec le bouchon lâche.
5. Répéter les étapes 3.3 et 3.4 jusqu'à ce que tous les tubes (à A6, B6) sont utilisés pour une durée totale de collecte de 90 min. A 80 min de la digestion, ouvrir le sommet du coeur pour débusquer toutes les cellules qui peuvent être piégés à l'intérieur du ventricule et de recueillir ces cellules dans A6 tube et B6, respectively.
   Remarque: Parfois, le coeur va tomber la canule avant le point de temps de 90 min. Si cela se produit, récupérer le coeur et la place dans une boîte de 35 mm de Petri stérile remplie de 2 ml de solution de digestion. Couper la pointe du cœur et rincer doucement le cœur avec une solution de digestion. Ensuite, filtrer les 2 ml de solution de digestion par un tamis 100 pm dans une cellule stérile conique de 50 ml et ajouter à A6 tube ou B6.
6. Après chaque rotation des tubes suivants (A2 et B2), ajouter les CMLV remis en suspension dans le tube de collecte précédente (combinée A1 et B1). Aussi, prenez soin de ne pas laisser la solution de digestion dans la pompe à court et passer les 10 ml seringues que nécessaire tout au long de la digestion.
7. Après que tous les tubes sont combinés, centrifuger la suspension de CMLV riche à 89 xg pendant 10 min.
8. Aspirer autant surnageant de tubes de prélèvement possible. Reprendre le culot restant dans 2 ml de milieux d'étalement et de la plaque sur un plat de culture de 35 mm. Lieu boîte de culture in 37 ° C incubateur pendant 24 heures.

4. Culture cellulaire

Remarque: Effectuez les étapes restantes dans l'enceinte de sécurité biologique.

1. Après 24 h, aspirer délicatement les médias de placage. La culture aura normalement une grande quantité de débris. Pour laver les cellules, ajouter 2 ml de chaud, PBS stérile et tapotez doucement le plat contre deux doigts tout en tournant dans le sens horaire.
2. Après avoir fait tourner à 360 °, aspirez le PBS et répéter une seconde fois. Aspirer le PBS et ajouter un autre 2 ml de solution stérile, PBS chaud. Vérifiez la boîte de culture sous le microscope pour vous assurer qu'il ya peu ou pas de débris sur la plaque. Cellule confluence peut également être déterminée à ce moment.
3. Si des débris reste dans la boîte de culture, répéter l'étape 4.2. Si la boîte de culture est exempt de débris, aspirez le PBS et ajouter 2 ml de milieu de placage chaud.
4. Après 24 h, laver les cellules à nouveau avec chaud, PBS stérile pour éliminer tous les débris final ou les cellules mortes de la culture. Aspirer le PBS et placer encore 2 ml de milieu de placage chaud sur les cellules.
5. Vérifiez sur les cellules tous les jours et nourrir toutes les 48 heures avec les médias de placage frais réchauffé. A ce stade, les cellules peuvent être utilisées pour des dosages standards de culture cellulaire. CMLV doit être d'environ 80% confluentes 4-5 jours après le placage, bien que peut prendre jusqu'à 7 jours jusqu'à ce que la procédure soit parfaite. Si le fractionnement à des passages ultérieurs, utilisez un maximum de 1: 4 35 mm plats (ou à une zone comparable de boîtes de culture).

Résultats

En raison de l'aspect novateur de notre technique d'isolement de CMLV coronarienne, nous avons cherché à déterminer la pureté de l'isolement cellulaire. CMLV coronaires souris ont été identifiées en fonction de leur morphologie et la coloration par immunofluorescence jusqu'au passage 2. En fonction de la morphologie des cellules dans la culture après le premier lavage, la procédure d'isolement élimine efficacement les myocytes cardiaques et des cellules endo...

Discussion

Le but de cette étude était d'adapter les protocoles d'isolement cellulaire existants pour augmenter le rendement des coronaires lisses vasculaires des coeurs murins. La plupart des travaux de pionnier dans la biologie vasculaire lisse musculaire a été réalisée avec des cellules musculaires lisses de l'aorte de rat en culture. Ces études ont fourni des connaissances fondamentales sur les mécanismes moléculaires qui contrôlent la croissance des CMLV, la migration et l' hypertrophie ^7....

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal bovine serum	Life Technologies	16140-071
HEPES 1M solution	Fisher	MT-25-060
Primocin - 20mL	Invivogen	ant-pm-2
DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine)	Life Technologies	11995-065
MEM NEAA 10 mM 100X	Life Technologies	11140-050
L-Glut 200 mM - Gibco	Life Technologies	25030-081
Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh	Fisher	22363549
Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm	Fisher	12-565-91
Harvard Apparatus black silk suture 5-0	Fisher	14-516-124
Collagenase Type-2	Worthington Biochemical	LS004176
Soybean Trypsin Inhibitor 25mg	Sigma	T6522
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear)	Life Technologies	14175-103
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red)	Life Technologies	14170-161
5.0 ml heating coil with degassing bubble trap	Radnoti	158830
11 plus pump	Harvard Apparatus	70-2208
Circulating heated water pump			any brand will work