Выделение мышиной коронарных сосудов клетках гладкой мускулатуры

Резюме

Целью данного протокола является демонстрация техники Выделение и культивирование мышиных первичных клеток гладких мышц сосудов (VSMCs) от коронарного кровообращения. После того, как VSMCs были изолированы, они могут быть использованы для многих стандартных методов культуры.

Аннотация

В то время как изоляция и культура клеток гладких мышц сосудов (VSMCs) из крупных сосудов хорошо установлена, мы стремились выделить и культивировать VSMCs от коронарного кровообращения. Сердца с неповрежденными дуги аорты были удалены и перфузию с помощью ретроградной Langendorff с пищеварением раствором , содержащим 300 ед / мл коллагеназы типа II, 0,1 мг / соевого ингибитора трипсина мл и 1 М CaCl _2. В perfusates были собраны с интервалом в 15 мин в течение 90 мин, осаждали центрифугированием, ресуспендировали в гальванических средах и высевали на тканевых культур блюд. VSMCs характеризовались наличием SM22α, a-SMA и виментину. Одним из основных преимуществ использования этого метода является возможность изолировать VSMCs от коронарного кровообращения мышей. Хотя небольшое число клеток, полученных может ограничить некоторые из приложений, для которых могут быть использованы клетки, выделенные коронарные VSMCs могут быть использованы в различных хорошо известных методов культивирования клеток и АссаYS. Исследования, расследующие VSMCs из генетически модифицированных мышей может предоставить дополнительную информацию о структурно-функциональных и сигнальных процессов, связанных с сосудистыми патологиями.

Введение

Целью данного метода является выделение клеток гладких мышц сосудов (VSMCs) из мышиного коронарного кровообращения для использования в культуре клеток и стандартных анализов клеточных культур. Мы разработали эту методику для оценки молекулярных механизмов ремоделирования сосудов у больных сахарным диабетом. Ранее мы уже сообщали внутрь гипертрофической ремоделирования в септальных коронарных артериол в мышиной модели дб / дб диабета ^1. Из - за ограниченного количества ткани , найденного в мышиных септальных коронарные, стандартные экспериментальные методы исследования изменений белка (например , Вестерн - блот) в дБ / дБ и контрольных мышей трудно в лучшем случае . Кроме того, ранее мы показали , что блокаторы рецепторов ангиотензина (БРА) лозартаном уменьшает ремоделирование наблюдаемое в дБ / дБ ² мышей. Таким образом, выделение первичных VSMCs из коронарного кровообращения позволяет в дальнейшем исследовать изменения в VSMC фенотип или активированные сигнальных путей у больных сахарным диабетом мышей, которые могут быть contribuтин неблагоприятных коронарных артериол ремоделирования.

Многочисленные исследования выяснены канонические пути передачи сигналов с использованием VSMCs выделенные из грызунах аорты, а не в каждой конкретной сосудистого русла. Тем не менее, мы продемонстрировали сосудисто-специфическую ремоделирования постель в коронарной, аортального и брыжеечных тиражами БД / DB мышей ^1, предлагая VSMCs в каждой сосудистого русла может быть различной. Поэтому необходимо изолировать VSMCs от каждого сосудистого русла, с тем, чтобы лучше понять патологические изменения, происходящие в каждом наборе VSMCs. Есть множество различных методов выделения и культивирования VSMCs аорты. Тем не менее, в настоящее время существует только одно исследование, которое было опубликовано на выделении VSMCs от мыши коронарное кровообращение ^3. Тэн и др. был первым сообщить способ выделения VSMCs от мыши коронарного кровообращения; Тем не менее, мы значительно внес изменения в протокол, поскольку они также изолированы эндотелиальной CELлевая сторона Другие лаборатории также использовали протокол от Teng и др. , Чтобы изолировать коронарных артерий миоцитов и сократимость гладкомышечных клеток ^4,5. Изменения мы включили будет давать популяцию клеток высоко обогащенные для VSMCs из коронарного кровообращения.

Ретроградной перфузии изолированного сердца млекопитающих, или методу Лангендорфа, была создана в 1897 году ⁶ Оскар Langendorff и до сих пор широко используется в настоящее время для выделения клеток сердечно - сосудистой системы . Техника, представленная здесь, в сочетании с развитием современных мышиных генетических модификаций, представляет собой ценный инструмент для более близкого исследования молекулярного поведения VSMCs из коронарного кровообращения.

протокол

Заявление по этике: Данное исследование было проведено в соответствии с национальными институтами здоровья руководящих принципов, и это было одобрено учреждение и использованию животных комитета на общегосударственном детской больницы.

1. Подготовка / Настройка

Примечание: Этот метод изоляции требует двух Лангендорфа нагревательных катушек, расположенных бок о бок на кольцевом основании и соединены параллельно с ванной циркулирующей воды.

1. Включите циркуляционный водяной бани и регулировать температуру до достижения конечной температуры 33-34 ° С на конце канюли Лангендорфа (водяная баня используется в этом наборе вверх установлен на 40 ° С из-за потери 6-7 ° C температуры через трубку). Включите перфузионных насосов и установить скорость перфузии до 0,5 мл / мин.
   1. Очистите оба нагревательными элементами с водяным охлаждением, прикрепленную трубки и 25 калибра канюлей с помощью промывки каждый с 50 мл 70% -ного этанола, с последующим добавлением 100 мл автоклавного сверхчистой воды.
   2. Очистите нагревательные катушкинажатием воздуха с помощью шприца и промывают 10 мл Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) без фенолового красного. Оставьте HBSS в нагревательных спиралей и трубок.
   3. Приложите стерильный 10 мл Луера шприц, заполненный водой комнатной температуры HBSS без фенола красного к трубопроводу. Убедитесь в том, что пузырьки воздуха не оказались в ловушке внутри насосно-компрессорных труб и нагревательных спиралей при креплении HBSS заполненный шприц, так как это может привести к эмболии воздуха во время пищеварения, чтобы негативно повлиять на изоляцию VSMC.
2. Удалите 25 калибра канюлей из нагревательных катушек и место на другой стерильный шприц объемом 10 мл, заполненную охлажденным льдом HBSS без фенолового красного. Держите это на льду, пока готов к использованию. Повторите эти действия для других канюлей.
3. Подготовить ферментативному перевариванию Solution.
   1. Взвесить коллагеназы типа 2 в соответствии с конкретным номером партии на 75 мл раствора сбраживания для достижения конечной концентрации 300 ед / мл.
   2. Растворите коллагеназы в 75 мл HBSS с фенолового красного. Далее, добавьте 1,5 мл 00,1 мг / мл ингибитора соевого трипсина и 75 мкл 1 М CaCl ₂ к смеси.
4. При использовании раствора пищеварения немедленно, нагрелась до 37 ° С. Если нет, то поместите его при температуре 4 ° С в течение до 6 часов. Это решение должно быть сделано ежедневно свежий.
5. Приготовьте универсальное решение / осажденный носитель.
   1. Добавляют 100 мл инактивированной нагреванием FBS, 5 мл L-глутамина, 5 мл несущественных аминокислот, 5 мл HEPES и 1 мл primocin до 500 мл высоким содержанием глюкозы (4,5 г / л) DMEM. Рекомендуется фильтр стерилизации.
   2. Алиготе 6 мл стоп-раствора в каждую из двенадцати 15 мл конические пробирки, пронумерованных A1-A6 и B1-B6, а также место при 4 ° С. Алиготе 50 мл стоп-раствора в 50 мл коническую и место в 37 ° С инкубатор.
      Примечание: Этот шаг может быть также получен на следующий день до изоляции, если это необходимо. Это универсальное решение будет использоваться в качестве металлизации сред следующих выделения клеток.
6. Приготовьте два 1 мл шприцы, оснащенные 30 G иглы100 мкл гепарина (1000 ед / мл).
7. Отрежьте 5 см кусок 5-0 хирургического шелка. Tie рыхлую сверху узел в хирургическом шелке с одним концом в два раза длиннее другого. Поместите на 25-го калибра канюлей, но не затягивайте. Повторите для другой 25 G канюлю.
8. Заполните четыре 35 мм стерильные чашки Петри (# 1-4) с 2 мл стерильной, ледяной, HBSS без фенолового красного. Держите на льду.

2. Эвтаназия, Сердце Выделение и катетеризацию

1. Перед изоляции сердца, убедитесь, что раствор переваривания и 50 мл коническую стоп раствора тепло. Удалите HBSS заполненный шприц с прикрепленным 25 G канюлю из льда и поместите в бюретки зажим (или зажим кольцо стенд) на кольцевом стенде.
2. Обезболить мышей с использованием 3% изофлуораном. Убедитесь, что мышь под наркозом с помощью пальца прикосновения на каждой задней конечности. Если подергивания ног, мышь не под наркозом, так подождите 1 мин и повторить прикосновение пальца ноги.
3. Выставляют яремную вену путем удаления меха Aй кожи на передней части шеи с помощью ножниц. Затем, используйте пинцет, чтобы аккуратно удалите жир, окружающий яремную вену. После удаления жира, медленно вводят 100 мкл гепарина (1000 ед / мл). Поместите хирургической губкой по вене, чтобы избежать чрезмерного кровотечения.
4. Через 1 мин, открытая грудь, чтобы разоблачить сердце, лифт сердце с изогнутыми щипцами и акцизный его с помощью ножниц, убедившись в том, чтобы сохранить нетронутыми восходящей аорты через первую ветвь брахиоцефального. Сразу же место сердце в 35 мм блюдо (# 1) с ледяной HBSS без фенола красного и промыть.
   Примечание: Выполните следующие 4 шага, используя рассекает сферу.
5. Разместите 25 G канюлю, который установлен на кольце стоять под углом 45 ° так, чтобы наконечник находится прямо под поверхностью ледяной HBSS в посудомоечную # 2 и отчетливо видна через рассекает микроскопом. Перенести сердце блюдо # 2.
6. Использование Дюмон щипцов, подвергают аорту, осторожно удаляя избыток жировой ткани с помощью отслаивания рРевент прокалывание или разрывание аорты. Затем, с помощью щипцов, чтобы скользить над аортой 25 G канюлю.
7. Руководство канюлю вниз через аорту, близко к, но не выходит за рамки аортального клапана, который приведет к нарушению целостности клапана и, следовательно, ретроградную перфузию. После того, как канюля находится в месте, вставьте предварительно привязал шелк над аортой, и затяните. Tie второй узел, чтобы сформировать квадратный узел вокруг аорты, чтобы закрепить сердце.
8. После того, как аорта надежно привязан, осторожно промойте оставшуюся кровь из коронарного кровообращения с ледяной HBSS в шприце, прикрепленной к 25 G канюлю. Будьте осторожны, чтобы не толкать слишком много, чтобы избежать чрезмерного коронарного давления. Только очень медленно и нежно вровень требуется для завершения флеш. Герметичны аортального канюляция также можно наблюдать во время этой нежной флеш.
9. Включите перфузионного насоса, чтобы начать подачу HBSS. Удалите 25 G канюлю (с сердцем прилагается) от HBSS заполненный шприц, следя за тем, чтобыдержать канюлю концентратор заполненный HBSS, и подключить его к теплым HBSS заполненные нагревательными катушками. Начинают перфузию сердца с перфузионного насоса со скоростью 0,5 мл / мин в течение 8 мин.
10. После того, как первый сердце канюлю и в настоящее время перфузию в системе, повторите шаги 2.1-2.8 для второго сердца. Эти обособления будут в шахматном порядке для каждого сердца, поэтому тщательное планирование и сроки, обязательны для заполнения.

3. Пищеварение

1. После промывки с помощью HBSS, замените 10 мл HBSS шприца в настоящее время на насосе на один заполненный 10 мл подогретого раствора пищеварения. Заливать каждое сердце с пищеварением раствором в течение 12 мин со скоростью 0,5 мл / мин. Не собирают фракции, вытекающие из этого первого пищеварением, поскольку это будет содержать каких-либо остатка крови и эндотелиальные клетки.
2. Через 12 мин, изменение скорости перфузии до 0,4 мл / мин, поместить 15 мл коническую трубку (А1 или В1, соответствующий первому или второму сердце для каждого пищеварения), наполненного холодной остановки Solutиона в ведерке со льдом под сердцем, чтобы начать VSMC обогащенный перфузату коллекцию.
3. Через 15 мин, изменение сбора коническая форма для трубки А2 или В2 и спин коническую трубку А1 и В1 при 89 мкг в течение 10 мин сразу после сбора обеих фракций. Когда шприц заполнен варочным раствором на насосе имеет менее 1 мл раствора, заменить свежеприготовленной заполненный шприц объемом 10 мл раствора пищеварения.
4. После центрифугирования аспирата супернатант из каждой коллекторной трубки, в результате чего около 0,5 мл. Ресуспендируют осадок от А1 с 2 мл теплого раствора (стоп или нанесение покрытий печатных носителей). Добавить взмучивания от A1 трубки B1 трубки и место трубы в 37 ° C инкубаторе с крышкой рыхлой.
5. Повторите шаги 3.3 и 3.4, пока все пробирки (через А6 и В6) используются в течение всего времени сбора 90 мин. При 80 мин пищеварения, разрезали верхушечного, чтобы избавиться от любых клеток, которые могут быть в ловушке внутри желудочка и собирать эти клетки в трубе A6 и B6, respectively.
   Примечание: Иногда сердце отвалится канюлю до пункта времени 90 мин. Если это происходит, извлекать сердца и место в стерильный 35 мм чашке Петри заполнены 2 мл раствора сбраживания. Отрежьте верхушку сердца и осторожно промыть сердце с пищеварением раствором. Затем отфильтровать 2 мл раствора переваривания через стерильный мкм клеточный фильтр 100 в 50 мл коническую и добавить к трубке A6 или B6.
6. После каждого спина последующих трубок (А2 и В2), добавьте ресуспендировали VSMCs к предыдущей коллекции трубки (в сочетании А1 и В1). Кроме того, будьте осторожны, чтобы не позволить раствор переваривания в насосе выбежать и переключить 10 мл шприцы по мере необходимости в течение всего пищеварения.
7. После того, как все трубки объединены, центрифугировать VSMC обогащенной суспензии при 89 мкг в течение 10 мин.
8. Отберите как много супернатант из коллекции трубок, как это возможно. Ресуспендируют оставшийся осадок в 2 мл металлизированный среды и пластины на одной чашке для культивирования 35 мм. Место культуры блюдо яN 37 ° C инкубатор в течение 24 часов.

4. Культура клеток

Примечание: Выполните оставшиеся шаги в шкафу биологической безопасности.

1. Через 24 часа, мягко аспирата осажденный СМИ. Культура, как правило, имеют большое количество мусора. Для того, чтобы промыть клетки, добавьте 2 мл теплой, стерильной PBS и осторожно нажмите на блюдо с двумя пальцами при вращении в движении по часовой стрелке.
2. После поворота на 360 °, аспирация PBS и повторить второй раз. Аспирируйте PBS и добавьте еще 2 мл стерильной, теплой PBS. Проверьте культуры блюдо под микроскопом, чтобы убедиться, что там практически нет мусора на тарелку. Cell Стечение также может быть определена в настоящее время.
3. Если мусор остается в культуре блюдо, повторите шаг 4.2. Если культура блюдо очистить от мусора, аспирация PBS и добавьте 2 мл теплой металлизации СМИ.
4. Через 24 часа, мыть клетки снова с теплой стерильной PBS для удаления любого окончательного мусора или мертвые клетки из культуры. Аспирируйте PBS и ркружева еще 2 мл теплой металлизации сред на клетки.
5. Проверьте на клетки каждый день и кормить каждые 48 ч со свежими утепленных гальванических СМИ. В этот момент клетки могут быть использованы для стандартных анализов клеточных культур. VSMCs должна составлять приблизительно 80% сливающихся через 4-5 дней после посева, хотя и может занять до 7 дней, пока процедура не совершенствуется. Если разбиение на последующих проходах, использовать максимум 1: 4 мм чашках 35 (или сопоставимой области культуры блюд).

Результаты

Благодаря новому аспекту нашей коронарной техники изоляции VSMC, мы стремились определить чистоту выделения клеток. Мышиные коронарные VSMCs были идентифицированы на основе их морфологии и иммунофлуоресцентного окрашивания до прохода 2. На основании морфологии клеток в...

Обсуждение

Цель данного исследования состояла в том, чтобы адаптировать существующие протоколы выделения клеток, чтобы увеличить выход коронарных сосудов гладкой из мышиных сердец. Большую часть новаторскую работу в области сосудистой биологии мышц гладкой проводили с культивируют крысы аорт?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal bovine serum	Life Technologies	16140-071
HEPES 1M solution	Fisher	MT-25-060
Primocin - 20mL	Invivogen	ant-pm-2
DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine)	Life Technologies	11995-065
MEM NEAA 10 mM 100X	Life Technologies	11140-050
L-Glut 200 mM - Gibco	Life Technologies	25030-081
Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh	Fisher	22363549
Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm	Fisher	12-565-91
Harvard Apparatus black silk suture 5-0	Fisher	14-516-124
Collagenase Type-2	Worthington Biochemical	LS004176
Soybean Trypsin Inhibitor 25mg	Sigma	T6522
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear)	Life Technologies	14175-103
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red)	Life Technologies	14170-161
5.0 ml heating coil with degassing bubble trap	Radnoti	158830
11 plus pump	Harvard Apparatus	70-2208
Circulating heated water pump			any brand will work