쥐 관상 동맥 혈관 평활근 세포의 분리

요약

이 프로토콜의 목적은 관상 동맥에서 뮤린 주 혈관 평활근 세포의 분리 및 배양 방법 (혈관 평활근 세포)을 보여주는 것이다. 혈관 평활근 세포가 분리되고 나면, 이들은 많은 표준 배양 기술에 사용될 수있다.

초록

격리와 큰 혈관에서 혈관 평활근 세포 (혈관 평활근 세포)의 문화가 잘 확립하는 동안, 우리는 관상 동맥에서 분리하고 배양 혈관 평활근 세포 노력했다. 완전한 대동맥 아치 하트 제거 소화 용액 콜라겐 타입 II, 0.1 ㎎ / ㎖ 대두 트립신 억제제 및 1 M _CaCl2를 300 단위 / ㎖를 함유하는 역행 랑겐 돌프 통해 관류 하였다. 관류 도금 배지에서 재현 탁하고 원심 분리하여 펠렛을 90 분 동안 15 분 간격으로 수집하고, 조직 배양 접시에서 배양 하였다. 혈관 평활근 세포는 SM22α의 존재, α-SMA 및 vimentin에 의해 특징했다. 이 기술을 사용하는 중요한 장점 중 하나는 마우스의 관상 동맥에서 혈관 평활근 세포를 분리 할 수​​있는 능력이다. 세포가 이용 될 수있는 애플리케이션들을 제한 할 수 얻어지는 세포의 소수 절연 관상 혈관 평활근 세포는 잘 확립 세포 배양 기술과 ASSA 다양한 사용할 수 있지만YS. 유전자 변형 생쥐에서 혈관 평활근 세포를 조사 연구는 구조 - 기능 및 혈관 병변과 관련된 신호 전달 과정에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다.

서문

이 방법의 목적은 세포 배양 및 표준 세포 배양 분석에 사용하기 위해 뮤린 관상 동맥에서 혈관 평활근 세포 (혈관 평활근 세포)를 분리한다. 우리는 당뇨병에서 혈관 재 형성의 분자 메커니즘을 평가하기 위해이 기술을 개발했다. 우리는 이전에 당뇨병 ^(1)의 모델 db / db 마우스에서의 관상 동맥에 중격 비대 리모델링 내측보고 하였다. 때문에 쥐의 중격 관상 동맥에있는 조직의 제한된 양, dB / dB 및 제어 마우스에서 단백질의 변화 (예를 들어, 웨스턴 블롯을) 조사 표준 실험 방법은 가장 어렵습니다. 또한, 우리는 이전에 안지오텐신 수용체 차단제 (ARB)의 로사 르탄이 dB / db 마우스 ^2에서 관찰 된 리모델링을 감소하는 것으로 나타났습니다. 따라서, 관상 동맥에서 주요 혈관 평활근 세포의 분리는 우리가 더 contribu 수있다 당뇨병 쥐의 혈관 평활근 세포 표현형의 변화 또는 신호 활성화 경로를 조사 할 수 있습니다이상 관상 동맥 세동맥 리모델링에 팅.

많은 연구가 아니라 각 특정 혈관 침대에서보다 쥐 대동맥에서 고립 된 혈관 평활근 세포를 사용하여 표준 신호 전달 경로를 밝혀왔다. 그러나, 우리는 다를 수 있습니다 각 혈관 침대에서 혈관 평활근 세포를 제안, 혈관 침대에게 관상 동맥, 대동맥의 특정 리모델링 및 dB / db 마우스 ^(1)의 장간막 순환을 증명하고있다. 따라서, 더 혈관 평활근 세포의 각 세트에서 일어나는 병리학 적 변화를 이해하기 위하여 각 혈관계의 혈관 평활근 세포를 분리 할 필요가있다. 분리 및 대동맥 혈관 평활근 세포를 배양하기위한 다른 방법의 과다가 있습니다. 그러나, 현재, 마우스 관상 동맥 ^3에서 혈관 평활근 세포의 분리에 게시 된 하나의 연구가있다. 탱 등은. 마우스 관상 동맥의 혈관 평활근 세포를 분리하는 방법을보고하는 첫번째이었다; 그러나 상당히 프로토콜을 수정 한 또한 내피 CEL 절연로서LS. 다른 연구소는 탱 등의 등의 프로토콜을 사용하고 있습니다. 관상 동맥 근육 세포와기도 평활근 세포 ^4,5를 분리 할 수 있습니다. 우리가 통합 한 변경은 높은 관상 동맥의 혈관 평활근 세포에 대한 풍부한 세포의 인구를 얻을 것입니다.

분리 된 포유 동물의 심장, 또는 랑겐 돌프 기술의 역 행성 관류는 오스카 랑겐 돌프에 의해 1897 ⁶ 년에 설립되었으며, 여전히 널리 심장 혈관 세포의 분리를 위해 오늘 사용된다. 현대 쥐의 유전자 변형의 발전과 함께 여기에 제시된 기술은, 관상 순환에서 혈관 평활근 세포의 분자 행동 가까이 조사를위한 유용한 도구를 제공합니다.

프로토콜

윤리 진술 : 본 연구는 건강 지침의 국립 연구소에 따라 실시하고,이를 전국 어린이 병원에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다.

1. 준비 / 설정

주 :이 분리 기술은 링 스탠드에 나란히 위치하는 두 랑겐 돌프 가열 코일을 필요로하고, 순환 수조에 병렬로 연결된다.

1. 물 목욕을 순환 켜고 랑겐 돌프 정맥의 끝에서 33 ~ 34 ° C의 최종 온도를 달성하기 위해 온도를 조절 (이에 사용 된 수조 인해 6-7 ° C를 손실 40 ° C로 설정 설정 튜브를 가로 지르는 온도). 관류 펌프의 전원을 켜고 0.5 ml / 분으로 관류 속도를 설정합니다.
   1. 멸균 초순수 100 ml의 다음 70 % 에탄올 50 ㎖, 각 플러싱에 의해 물 자켓 가열 코일의 모두 연결된 배관 및 25 게이지 뉼러를 청소한다.
   2. 가열 코일을 취소합니다주사기로 공기를 밀어 페놀 레드없이 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 10 mL로 씻는다. 가열 코일 튜브에 HBSS를 남겨주세요.
   3. 튜브에 페놀 레드없이 실온 HBSS 가득 멸균 10 ㎖의 루어 락 주사기를 연결합니다. 이 부정적인 혈관 평활근 세포의 분리에 영향을 소화하는 동안 공기 색전을 일으킬 수로 HBSS 채워진 주사기를 부착 할 때 공기 방울이 튜브 가열 코일 안에 갇혀 있지 않은지 확인합니다.
2. 페놀 레드없이 얼음처럼 차가운 HBSS로 채워진 다른 멸균 10 ML의 주사기에 가열 코일과 장소에서 25 게이지 정맥을 제거합니다. 사용할 준비가 될 때까지 얼음이 보관하십시오. 다른 캐 뉼러에 대해 반복합니다.
3. 효소 소화 솔루션을 준비합니다.
   1. 소화 용액 75 ml를 300 단위 / ㎖의 최종 농도를 달성하기 위해 특정 로트 번호에 따른 콜라게나 제 2 형을 단다.
   2. 페놀 레드 HBSS의 75 ml의 콜라게나 제를 녹여. 다음으로, 0, 1.5를 가하여0.1 ㎎ / ㎖ 대두 트립신 억제제를 첨가하고, 혼합물을 1 M _CaCl2를 75 μL.
4. 즉시 소화 용액을 사용하는 경우, 37 ℃로 따뜻하게. 그렇지 않은 경우, 최대 6 시간 동안 4 ° C에 배치합니다. 이 솔루션은 신선한 매일해야합니다.
5. 스톱 솔루션 / 도금 미디어를 준비합니다.
   1. 100 ㎖ 고 글루코스 (4.5 g / L) DMEM 500 ml의 FBS, primocin의 L 글루타민 5 ㎖, 비 필수 아미노산 5 ㎖, HEPES 5 ㎖, 1 ml의 열 불 활성화 추가한다. 필터 살균하는 것이 좋습니다.
   2. 나누어지는 4 °의 C에서 A1-A6 번호 열두 15 ML 원뿔 튜브의 각에 스톱 솔루션 및 B1-B6, 장소의 6 ml의. 분취 액을 37 ° C의 배양기에서 50 ㎖ 원뿔 제자리 정지 용액 50 ㎖.
      주 : 필요한 경우,이 단계는 또한 이전에 단리 날을 제조 할 수있다. 이 정지 용액을 세포 격리 다음 도금 매체로 사용한다.
6. 30 G 바늘 장착이 1 ml의 주사기를 준비합니다헤파린 100 ㎕와 (1,000 개 / ㎖).
7. 5-0 수술 실크의 5cm 조각을 잘라. 다른 배만큼 일단 수술 실크 느슨한 오버 핸드 매듭을 묶어. 25 게이지 캐 뉼러에 배치하지만 조하지 않습니다. 다른 25 G 정맥을 반복합니다.
8. 살균, 얼음처럼 차가운, HBSS없이 페놀 레드 2 ㎖ 4 개의 35mm 멸균 페트리 접시 (# 1-4)를 입력합니다. 얼음에 보관하십시오.

2. 안락사, 심장 절연 및 캐 뉼러

1. 심장 분리하기 전에 스톱 솔루션의 소화 용액 50 ㎖ 원뿔 따뜻한되어 있는지 확인하십시오. 링 스탠드에 뷰렛 클램프 (또는 링 스탠드 클램프)에서 얼음과 장소에서 부착 된 25 G 정맥으로 HBSS 채워진 주사기를 제거합니다.
2. 3 % 이소 플루오 란을 사용하여 마우스를 마취. 마우스를 각 뒷다리의 발가락 터치에 의해 마취 확인합니다. 다리 경련 경우, 마우스는 아직 그렇게 1 분을 기다린 발가락 터치를 반복 마취되지 않습니다.
3. 모피 a를 제거하여 경정맥을 노출가위로 목의 앞쪽에 차 피부. 다음, 조심스럽게 경정맥을 둘러싸고있는 지방을 제거하기 위해 집게를 사용합니다. 지방을 제거한 후, 천천히 헤파린 100 ㎕ (1,000 개 / ㎖)을 주입. 과도한 출혈을 방지하기 위해 정맥을 통해 수술 스폰지를 놓습니다.
4. 1 분 후, 열린 가슴은 첫 번째 팔 머리 지점을 통해 그대로 상행 대동맥을 유지해야하고, 곡선 집게 심장, 리프트 마음을 노출 가위를 사용하여 절제합니다. 즉시 페놀없이 35mm 접시에 빨간색 얼음처럼 차가운 HBSS와 (# 1) 마음을 놓고 씻어.
   참고 : 해부 범위를 사용하여 다음 4 단계를 수행합니다.
5. 끝이 접시 # 2 단지 얼음처럼 차가운 HBSS의 표면 아래에 명확하게 해부 현미경을 통해 볼되도록 링에 장착 된 25 G 정맥는 45 ° 각도로 서 놓습니다. 접시 # 2에 마음을 전송합니다.
6. 듀 집게를 사용하여 부드럽게 P에 무딘 절개를 통해 과량의 지방을 제거하여 대동맥을 노출하지 못하 천공 또는 대동맥 파열. 다음으로, 25 G 정맥을 통해 대동맥을 밀어 집게를 사용합니다.
7. 따라서 역행 관류 밸브의 무결성을 손상 할 것이다 가까이에 있지만 대동맥 판막 이상으로 대동맥을 통해 아래로 정맥을 안내합니다. 정맥 자리에되면, 대동맥을 통해 사전 묶여 실크를 밀어 조입니다. 심장을 확보하기 위해 대동맥 주위에 사각형 매듭을 형성​​하기 위해 두 번째 매듭을 묶어.
8. 대동맥이 제대로 연결되면, 부드럽게 25 G 정맥에 부착 된 주사기에 얼음처럼 차가운 HBSS와 관상 동맥에 남아있는 혈액을 세척하십시오. 과도한 관상 동맥 압력을 피하기 위해 너무 많이 넣지주의하십시오. 만 매우 느리고 부드러운 플러시가 플러시를 완료하는 데 필요합니다. 누출이없는 대동맥 삽관도이 부드러운 플러시 동안 관찰 할 수있다.
9. HBSS의 흐름을 시작합니다 관류 펌프를 켭니다. 에주의하면서 HBSS 채워진 주사기에서 (첨부 된 마음으로) 25 G 정맥을 제거HBSS 가득 캐 뉼러 허브를 유지하고, 따뜻한 HBSS 채워진 가열 코일에 연결합니다. 8 분 동안 0.5 ㎖ / 분의 속도로 관류 펌프 심장 관류 시작.
10. 제 마음 유관되고 시스템에 관류 된 후, 반복 두 번째 심장 2.1-2.8이 단계를 반복합니다. 이 절연 부 따라서 신중한 계획과 타이밍이 요구되는 각각의 마음에 대해 엇갈리게됩니다.

3. 소화

1. HBSS로 세척 한 후, 미리 예열 소화 용액 10 ml를 가득 하나에 펌프에 현재 10 ml의 HBSS 주사기를 변경합니다. / 분 0.5 ML의 속도로 12 분 동안 소화 용액으로 각각의 마음을 관류. 이 모든 잔여 혈액과 혈관 내피 세포를 포함하므로이 첫 번째 소화에 따른 분수를 수집하지 않습니다.
2. 12 분 후, 0.4 ㎖ / 분으로 관류 속도를 변경 냉간 정류장 오디오 솔루션 가득 (각 소화 첫번째 또는 두번째 심장에 대응 튜브 A1 또는 B1) 15 mL를 삼각 배치혈관 평활근 세포가 풍부한 관류 수집을 시작하기 위해 심장 아래에 얼음 양동이에 이온.
3. 15 분 후, 즉시 두 분수의 수집 후 10 분 동안 89 XG에 튜브 A2 또는 B2 스핀 원뿔 튜브 A1과 B1에 수집 원뿔을 변경합니다. 펌프에 소화 용액으로 가득 주사기 솔루션의 1 ml의가있는 경우, 소화 용액의 갓 가득한 10 ML의 주사기로 교체합니다.
4. 원심 분리 후, 각 수집 튜브에서 흡 상등액 약 0.5 ㎖에두고. 따뜻한 스톱 솔루션 (또는 도금 미디어)의 2 mL를 A1에서 재현 탁 펠렛. 느슨한 모자와 37 ° C 배양기에서 B1 튜브와 장소 튜브에 A1 관에서 재 부유를 추가합니다.
5. 반복 90 분 총 수집 시간에 사용된다 (A6 및 B6를 통해) 모든 튜브까지 3.3 및 3.4 단계를 반복합니다. 소화 80 분에서 튜브 A6 및 B6, respe에서 이러한 세포를 뇌실 안에 갇혀 될 수있는 세포를 세척하고 수집하는 심장 정점을 열 절단ctively.
   참고 : 때때로 심장은 90 분 시점 이전에 정맥 떨어질 것입니다. 이 경우, 소화 용액 2 ㎖로 가득 멸균 35mm 페트리 접시에 마음과 장소를 검색 할 수 있습니다. 마음의 정점을 잘라 부드럽게 소화 용액과 마음을 씻어. 이어서, 50ml의 원뿔형으로 멸균 100 μm의 셀 스트레이너를 통하여 소화 용액 2ml를 필터링 및 튜브 A6 또는 B6에 추가.
6. 이후 튜브 (A2와 B2)의 각 스핀 후 (A1과 B1 결합) 이전 포집 관에 재 부유 혈관 평활근 세포를 추가합니다. 또한, 펌프의 소화 용액이 밖으로 실행하고 소화을 통해 필요에 따라 10 ml의 주사기를 전환 할 수 않도록주의하십시오.
7. 모든 튜브를 조합 한 후, 10 분 동안 89 XG에 VSMC 풍부한 현탁액을 원심 분리기.
8. 가능한 한 수집 관에서 대기음 많이 뜨는. 하나 35mm 배양 접시에서 미디어 접시 도금 2 ㎖에 남아있는 펠렛을 재현 탁. 장소 배양 접시의 난24 시간 동안 37 ° C를 인큐베이터 N.

4. 세포 배양

참고 : 바이오 안전성 캐비닛의 나머지 단계를 완료합니다.

1. 24 시간 후, 부드럽게 도금 미디어를 대기음. 배양은 일반적으로 잔해를 다량 가질 것이다. 세포를 씻어, 따뜻한, 멸균 PBS 2 ㎖를 추가하고 시계 방향으로 운동에서 회전하면서 부드럽게 두 손가락에 접시를 누릅니다.
2. 360 ° 회전 한 후, PBS를 흡인하고, 두 번 반복한다. PBS를 대기음 및 살균, 따뜻한 PBS의 다른 2ml를 추가합니다. 접시에 어떤 이물질이 거의이 있는지 확인하기 위해 현미경으로 배양 접시를 확인합니다. 셀 합류 또한 이때 결정될 수있다.
3. 파편이 배양 접시에 남아있는 경우, 단계 4.2를 반복합니다. 배양 접시 파편의 명확한 경우, PBS를 대기음 따뜻한 도금 미디어 2 ㎖를 추가합니다.
4. 24 시간 후, 문화에서 어떤 최종 파편이나 죽은 세포를 제거하는 따뜻한, 멸균 PBS로 다시 세포를 씻는다. PBS를하고 페이지를 대기음세포에 따뜻한 도금 미디어의 또 다른 2 ml의 레이스.
5. 매일 세포에 확인하고 신선한 따뜻하게 도금 미디어의 모든 48 시간 공급. 이 시점에서, 세포는 표준 세포 배양 분석에 사용될 수있다. 프로 시저가 완성 될 때까지 최대 7 일이 걸릴 수 있지만, 혈관 평활근 세포는 도금 후 약 80 %의 합류 4-5일해야합니다. 다음 구절에 분할은, (1) 최대 사용하는 경우 : 4 35mm 요리를 (또는 문화 요리의 비교 지역).

결과

우리 인해 관상 혈관 평활근 세포 분리 방법의 신규 한 양상으로, 우리는 세포 분리의 순도를 결정하기 위해 노력했다. 마우스 관상 혈관 평활근 세포는 먼저 세척 후 배양 세포의 형태에 기초하여 통로 (2)에 그 형태 및 면역 형광 염색해서 기초하여 식별하고, 상기 분리 과정은 효과적으로 심장 근육 세포 및 내피 세포를 제거한다. 혈관 평활근 세포는 통로 (2) (그림...

토론

이 연구의 목적은 쥐 하트 매끄러운 관상 혈관의 수율을 높이기 위해 기존의 셀 분리 프로토콜을 적용 하였다. 혈관 평활근 생물학에서 선구적인 작업의 대부분은 배양 된 쥐의 대동맥 평활근 세포로 하였다. 이 연구는 혈관 평활근 세포의 성장, 마이그레이션 및 비대 ^{(7)을 제어하는} 분자 메커니즘의 기초 지식을 제공했다. 필드가 진행하지만, 그것은 VSMC 표현형 및 기능 혈관계 특정 요인...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal bovine serum	Life Technologies	16140-071
HEPES 1M solution	Fisher	MT-25-060
Primocin - 20mL	Invivogen	ant-pm-2
DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine)	Life Technologies	11995-065
MEM NEAA 10 mM 100X	Life Technologies	11140-050
L-Glut 200 mM - Gibco	Life Technologies	25030-081
Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh	Fisher	22363549
Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm	Fisher	12-565-91
Harvard Apparatus black silk suture 5-0	Fisher	14-516-124
Collagenase Type-2	Worthington Biochemical	LS004176
Soybean Trypsin Inhibitor 25mg	Sigma	T6522
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear)	Life Technologies	14175-103
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red)	Life Technologies	14170-161
5.0 ml heating coil with degassing bubble trap	Radnoti	158830
11 plus pump	Harvard Apparatus	70-2208
Circulating heated water pump			any brand will work