בידוד של אוכלוסיות תאי perivascular מולטיפוטנטיים המבשרים מרקמות אדם לב

Summary

ברקמת לב אדם מטפחת אוכלוסיות תאי מבשר perivascular מולטיפוטנטיים שעשויה להיות מתאים התחדשות שריר לב. הטכניקה המתוארת כאן מאפשרת בידוד סימולטני וטיהור שתי אוכלוסיות תאי סטרומה מולטיפוטנטיים קשורות כלי דם מקומיים, כלומר CD146 ⁺ CD34 ^- pericytes ו CD34 ⁺ CD146 ^- תאי adventitial, מן שריר הלב האנושי.

Abstract

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146⁺CD34^- pericytes and vascular CD34⁺CD146^- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Introduction

הלב מזה זמן רב נחשב איבר שלאחר mitotic. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו נוכחות של מחזור cardiomyocyte מוגבל בלבות בני האדם המבוגר ^1. תאי גזע / אב Native עם פוטנציאל התמיינות cardiomyocyte גם זוהו בתוך שריר הלב ב מכרסמים מבוגרים בליבותיהם, כולל SCA-1 ^+, c-kit ^+, cardiosphere יוצרים, ולאחרונה, ^2,3 תאי מבשר perivascular. תאים אלה מייצגים מועמדים אטרקטיביים עבור טיפולים שמטרתם הגברת תיקון / התחדשות לב באמצעות השתלה תאית או גירוי של התפשטות in-situ.

גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSC) בודדו כמעט מכל רקמה אנושית ^4,5 ניסויים קליניים של היישומים הרפואיים של MSC בוצעו עבור במצבים פתולוגיים רבים כגון תיקון לב וכלי דם ^6, שתל נגד מאכסן מחלה ⁷ , וכבד שחם ^8. השפעות מועילות יוחסו היכולת של MSCs ל: בית לאתרים של דלקת ^9; להתמיין לסוגי תאים שונים ^10; להפריש מולקולות פרו-מתקן ^11; ולווסת תגובות מארח חיסון ^12. בידודו של MSCs הסתמך באופן מסורתי על הדבקות המועדפת שלהם מצעי פלסטיק. עם זאת, האוכלוסייה של תאים והתוצאה היא בדרך כלל במידה ניכרת הטרוגניים ^13. באמצעות תא פלורסנט מיון מופעל (FACS) עם שילוב של סמני תא מפתח perivascular, הצלחנו לבודד ולטהר אוכלוסייה מבשרת MSC הדמוי מולטיפוטנטיים (CD146 ⁺ / CD31 ^- / CD34 ^- / CD45 ^- / CD56 ^-) מ ברקמות אנושיות מספר כולל שרירי שלד מבוגרים ו ^-14 שומן לבן.

אוכלוסיות תאי perivascular ברקמות שאינן לב שונות הוכחו כבעלי תכונות של תאי גזע / אבnd נחקרים לשימוש קליני הגדרת הלב וכלי הדם. Pericytes, אחד תת תא perivascular הידוע ביותר, הם אוכלוסייה הטרוגנית ממלאות תפקידי pathophysiological מספר כולל בפיתוח הכלי החדש ^15, ויסות לחץ דם ^16, ותחזוקה של שלמות כלי דם ^17,18. כפי שניתן לראות רקמות מרובות, תת-מערכות ספציפיות של pericytes המקורי להביע אנטיגנים MSC ולקיים פנוטיפים MSC הדמוי שלהם בתרבות העיקרית לאחר FACS טיהור ^14. יתר על כן, תאים אלה ביציבות לשמור פנוטיפים שלהם לטווח הארוך בתוך התרבות להפגין פוטנציאל התמיינות רבה שושלת, בדומה MSCs ^19,20. התוצאות מראות כי pericytes הוא אחד המקורות של MSC החמקמק ^14. הפוטנציאל הטיפולי של pericytes הודגם עם ירידת הצטלקות שריר לב ומשופר תפקוד לב לאחר השתלה לתוך ischemically נפצעלבבות ^21. לאחרונה, אנו מטוהרים בהצלחה pericytes מן שריר הלב האנושי והפגינו MSC דמוי פנוטיפים ו multipotency (adipogenesis, chondrogenesis ו osteogenesis) שלהם עם העדר myogenesis השלד ^3. בנוסף, pericytes שריר הלב הציג יכולות פוטנציאליות ו angiogenic cardiomyogenic ההפרש בהשוואה לעמיתיהם מטוהרים מאיברים אחרים.

אוכלוסייה שנייה של ובתאים / גזע perivascular מולטיפוטנטיים, תא adventitial, מבודדת מייתר ורידי אדם saphenous על בסיס ביטוי CD34 החיובי ^22. תאי adventitial ורידים הוכחו כבעלי פוטנציאל clonogenic, קיבולת בידול mesodermal ופוטנציאל proangiogenic במבחנה. השתלה של תאים אלה לתוך ליבם נפגע ischemically של עכברים הביא לירידה ב סיסטיק ביניים, גידול אנגיוגנזה זרימת הדם בשריר הלב, מופחת חדרית dilation, פליטת לב מוגברת חלק ^23. מעניין לציין, כי תאי adventitial שומן הוכחו לאבד ביטוי CD34 ו upregulate ביטוי CD146 בתרבות בתגובה לטיפול angiopoietin השני, דבר המצביע על אימוץ פנוטיפ pericyte עם גירוי ^24. בתוך הלב, לעומת זאת, אוכלוסיית תא adventitial טרם מטוהרת באופן פרוספקטיבי על ידי FACS ו / או גם מאופיין. ניצול הליכי בידוד תא המתוארות בסעיפים הבאים, אנו נמצאים כעת מאפיינת תאי adventitial שריר לב לחקור את הפוטנציאל שלהם ליישומים רגנרטיבית.

בזאת אנו מתארים שיטה לבודדת ולטהר שתי תת-אוכלוסיות של תאי גזע / אב perivascular מ שריר לב עוברי או אדם בוגר. שיטה פוטנציאלית לצינוק זה תאפשר לחוקרים לקבל גזע perivascular isogenic / אב תת תא ביופסיות לב אנושיות ללימודים השוואתיים further לחקור הפוטנציאל הטיפולי שלהם שונים במצבים פתולוגיים הלב.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

עיבוד 1. לדוגמא אדם לב

1. ודא כי כל הנוזלים, מכולות, המכשירים, והשטח המבצעי הייעודי הם עקרים.
2. מניחים את המדגם ברקמת הלב (רכש על ידי בנק רקמות או צוות המנתחים) במדיום אחסון מורכב בינוני הנשר שונה של צונן Dulbecco (DMEM) המכילה סרום שור העובר 20% (FBS) ו -1% סטרפטומיצין פניצילין (P / S) על הקרח לתחבורה ^3.
3. הסר את מדגם הלב ממדיום האחסון ולשטוף עם מדיום כביסה מורכב פוספט שנאגר מלוח (PBS) בתוספת 2% FBS ו -1% P / S. בעת טיפול המדגם, השתמש קנס מלקחיים הטו לתפוס כלי גדול או קרום לב ולמזער מוחצת של שריר הלב.
4. לצלול המדגם במדיום כביסה בצלחת פטרי ולהסיר את קרום הלב, endocardium וכלי דם גדולים עם איריס מספריים מעוקרים מלקחיים קנס שקצהו כמתואר ^3.
5. חותכים את myoca הנותריםrdium לחתיכות קטנות של כ 1 מ"מ ³ באמצעות סכין גילוח צד אחד או זוג מספרי איריס חדה. הערה: תשואות תא הגבוהות ביותר תושגנה אם דגימות מעובדים באופן מיידי. אם חל עיכוב בלתי נמנע, אחסון של ברקמת הלב מעובד במדיום אחסון טריים (> 5 מ"ל לכל 1 ס"מ ³ רקמות) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך עד 72 שעות אפשרי, אולם ככל הנראה עם ירידה הקשורים בתשואה התא.

עיכול 2. של רקמות בידוד של תאים

1. טרי שמרכיבים את פתרון העיכול המהווים 1.5 מ"ל כל אחד collagenase אני, collagenase II, ו- IV collagenase (בבת 0.5 מ"ג / מ"ל ​​ב DMEM) וחמים עד 37 מעלות צלזיוס waterbath.
   הערה: נפח וריכוז collagenases מתאימים דגימות של כ 1 ס"מ ^3.
2. סנן את חתיכות רקמה מושעה דרך מסננת 100 מיקרומטר ולשטוף פעמיים עם PBS. מעבירים את חתיכות רקמה למיכל 30 מ"ל סטרילי עםמכסה אטום בחוזקה.
   הערה: סירים רחבים קצרים ולא צינורות צרים גבוהים לתת תוצאות טובות יותר. לחלופין, לשים פיסות רקמה בתוך שפופרת סטרילית 50 מ"ל ומניחים אופקיים אם מיכל 30 מיליליטר אינו זמין.
3. הוסף את כל הפתרונות העיכול (4.5 מ"ל סה"כ) ולמקם את המיכל בתוך שקית פלסטיק אטום באמבט מים רועד 37 ° C מוגדר 120 סל"ד. לחלופין, לאטום את המיכל עם הסרט פרפין ומניחים שייקר מסלולית מחוממת מוגדר 120 סל"ד.
4. לאחר 15 דקות, להסיר ו להפוך את הסיר שלוש פעמים לפני ההחלפה במשך 15 דקות נוספות. הסר להרוות את collagenases עם 5 מ"ל של DMEM בתוספת FBS 20% ו -1% P / S.
5. Triturate לעכל ידי pipetting בעדינות עשרה עד עשרים פעמים עם טפטפת סרולוגיות 10 מ"ל להיפרד כל גושים ברקמה. סנן את ברצף ההשעיה דרך 100 מיקרומטר, 70 מיקרומטר ולבסוף מסננות תא 40 מיקרומטר להסיר חומרים מעוכלים ו לקבל השעיה תא בודד.
   הערה: אין לשטוף בין מסננות התא כדי למנוע תא debrisgenerated ידי תהליך העיכול אנזים.
6. צנטריפוגה ההשעיה התא XG 200 במשך 4 דקות, בזהירות למזוג supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 מ"ל של תא אדום lysing חיץ עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר לפני דילול עם 4 מ"ל של מדיום שטיפה.
7. חזור על השלב צנטריפוגה מחדש להשעות גלולה ב 1 מ"ל של מדיום שטיפה. מערבבים היטב ולקחת 10 μl של ההשעיה תא עבור ספירת תאים.
8. מערבבים 10 μl של ההשעיה תא עם 10 μl של כתם כחול Trypan ומקום 10 μl של התערובת על hemocytometer תקן ספירת תאים. ספירת תאים בהירים, בסיבוב הנוכחי בכיכרות הפינתיות (כל מחולק שש עשרה ריבועים קטנים) ולחלק 4 כדי לקבל את הממוצע לכל מ"ר בפינה. הכפל את הממוצע על-ידי 2 לחשבון עבור גורם לדילול הכתם ולאחר מכן ב -10 ⁴ כדי לקבל את המספר הכולל של תאים לכל 1 מ"ל של המדגם.

= "Jove_title"> 3. תוויות תא ומיון

1. הוסף 50 μl של עכבר בסרום על השעיית תא דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי לחסום נוגדן הלא ספציפי מחייבות.
2. צנטריפוגה ההשעיה תא עם סרום עכבר ב XG 200 במשך 4 דקות, להסיר supernatant, מחדש להשעות במדיום כביסה בריכוז של 1 x 10 ⁶ תאים לכל 100 μl.
3. Aliquot 50 μl כל אחד השעית התא עבור אלוטיפ ובקרות בלא כתם לשתי התחתון קלקר עגול cytometry זרימת צינורות מכן למקם את הנפח הנותר לתוך צינור שלישי מכתים צבע רב.
4. הוספת CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5, ונוגדנים CD146-AF647 (כל 1: 100) על השעיית תא בודד עבור מכתים צבע רב. על בקרת אלוטיפ, להוסיף כמויות מקבילות של PE-, APC-Cy7-, PE-Cy7-, PerCP-Cy5.5- ונוגדני אלוטיפ AF647 מצומדות. בעדינות פיפטה לערבב נוגדנים עם תאי דגירה כל הצינורות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20דקות בחושך.
5. כן חרוזים מלאי פיצוי על ידי הוספת טיפה אחת של חרוזים חיוביים 100 μl של מדיום כביסה בחמישה קלקר עגול צינורות זרימת cytometry תחתונים. הוספת CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5, ונוגדנים CD146-AF647 (כל 1: 100) בנפרד לכל אחד 5 הצינורות. דגירה כל הצינורות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בחושך.
6. במהלך הדגירה, להכין צינורות איסוף כל תא עם 500 μl של האנדותל צמיחה בינוני-2 (EGM-2) בינוני תרבות ומקום על 4 מעלות צלזיוס.
7. לאחר דגירה נוגדן, להוסיף 5 מ"ל של מדיום כביסה לשטוף תאים וחרוזים על מנת להסיר נוגדן מאוגד. צנטריפוגה כל הצינורות ב XG 200 במשך 4 דקות. חזור על שלב כביסת צנטריפוגה. בזהירות למזוג supernatant פיפטה בעדינות כאשר מחדש השעיית תאים.
8. מחדש להשעות במדיום כביסה בריכוז של כ 1 x 10 ⁶ תאים לכל 250 μl. Re- להשעות את החרוזים 100 μl של כביסה מedium.
9. להעביר את כל מתלי התא חרוז אל סדרן התא על קרח בחושך. להוסיף 1 טיפה של חרוזים שלילי הצינורות מלאי פיצוי חרוז החיוביים ולהשתמש אלה הגדרה פיצוי הקרינה.
10. הפעל לתאי קבוצה בלא כתם על פי הוראות היצרן כדי להקים את קרינת הרקע ולהגדיר את המתחים להודעה הבא: FSC 150V; SSC 290V; V450 / 50 350V; V710 / 50 620V; B530 / 30 400V; B710 / 50 530V; YG780 / 60 460; R670 / 30 480V; R780 / 60 460V. שולט isotypes המתנהל על פי הוראות היצרן כדי לקבוע את סף קרינת רקע הקשורים הלא ספציפי מחייב. הפעל את המדגם רב צבע מוכתם לאסוף את pericyte ו אוכלוסיות תאים adventitial לתוך צינורות אוסף (איור 1).
    הערה: תשואות תא קיימא אופטימליות כ 3% של דיסוציאציה התא כולל החייה עבור pericytes ו -4% עבור תאי adventitial.

4. תרבית תאים

1. בחר תרבות צלחות בגודל מתאימה על פי התוצאה של מיון FACS. הוספת 100 μl של פתרון ג'לטין סטרילי 0.2% לס"מ ² של אזור הגידול להתסיס ידני כדי לצפות את בארות כולו. דגירה צלחות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולהסיר פתרון ג'לטין לחלוטין. שמור את התאים שנאספו על הקרח בזמן הכנת צלחות תרבות.
   הערה: pericytes מסודרים טרי ותאי adventitial לגדול גם כאשר זורעים בצפיפות של 30,000 עד 40,000 תאים / ² ס"מ על משטח תרבות ג'לטין מצופה.
2. צנטריפוגה שנאספו תאים טרי ב XG 200 במשך 4 דקות בעדינות מחדש להשעות את התא גלולה ב הכמות המתאימה של EGM-2.Seed התאים על צלחות מצופה ג'לטין.
   הערה: המספר האמיתי של תאים להיות זורע לכל טוב וכמות EGM-2 להתווסף תלוי בבחירת הצלחת. לדוגמה, 0.5 מ"ל ו 1 מ"ל EGM-2 נדרשים לכל טוב עבור -48 ו 24 גם צלחות בהתאמה.
3. המרת EGM-2 בינוני צמיחת תאים perivascular (DMEM בתוספת FBS 20% ו -1% P / S) עבור שני pericytes ותאי adventitial פעם תאים התיישבו ודבקו לצלחת (לאחר לפחות 72 שעות). שנה את התקשורת בכל 72 שעות מאותו רגע והלאה. לבצע ראשוני וכל incubations הבא ב 5% CO ₂ ו ב 37 מעלות צלזיוס.
4. לנתק תאים באמצעות EDTA 0.05% טריפסין כאשר pericytes ותאי adventitial להגיע 80 עד מפגש 90%. להרוות עם FBS 20% ב- PBS, צנטריפוגות ב XG 200 במשך 4 דקות, מחדש להשעות במדיום צמיחת תאים perivascular, ולאחר מכן מעבר התאים ב יחס של 1: 3 על תרבות צלחות קלקר ללא ציפוי. מפסוק 2 ואילך, תאי המעבר ביחס של 1: יחס 5 (או כ -7,000 תאים / ² ס"מ) צלחות או צלוחיות תרבות קלקר ללא ציפוי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תאים בודדים נבדלו פסולת כפילויות על בסיס חלוקות פיזור קדימה והצד. תאים חיים זוהו על ידי הכישלון שלהם לקחת את צבען DAPI. האסטרטגיה gating נבחר על בסיס תיוג אלוטיפ של חיה זו, דיסוציאציה התא כולו-לב (איור 1). מתוך תאי חיים, CD45 ⁺ תאים היו מגודרים ה?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ראיות הגדלת תומך יכולת התחדשות מוגבלת של הלב האנושי המבוגר לאחר פציעה. זיהוי ואפיון של תאי מבשר יליד אחראים תגובות התחדשות כאלה לבבות פגועים הם קריטיים עבור שני להבנת מנגנונים הקשורים מסלולי איתות ופיתוח הגישות לנצל תאים אלה טיפוליים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AbC Anti-mouse Bead Kit	Molecular Probes	A-10344
Collagenase I	Gibco	17100-017	Reconstitute powder as required and filter sterilise
Collagenase II	Gibco	17101-015
Collagenase IV	Gibco	17104-019
anti-human CD34-PE	BD Pharmingen	555822	Keep sterile
anti-human CD45-APC-Cy7	BD Pharmingen	557833	Keep sterile
anti-human CD56-PE-Cy7	BD Pharmingen	557747	Keep sterile
anti-human CD144-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Keep sterile
anti-human CD146-AF647	AbD Serotec	MCA2141A647	Keep sterile
EGM2-BulletKit	Lonza	CC-3162	For collection of cells and culture until adhered
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate	ThermoFischer Scientific	10566-016
Fetal Bovine Serum	ThermoFischer Scientific	10500-064	Freeze in aliquots and keep sterile
Gelatin	Sigma Aldrich	G1393	Dilute with sterile water
IgG1k-PE	BD Pharmingen	559320	Keep sterile
IgG1k-APC-Cy7	BD Pharmingen	557873	Keep sterile
IgG1k-PE-Cy7	BD Pharmingen	557872	Keep sterile
IgG1k-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Keep sterile
IgG1k-647	AbD Serotec	MCA1209A647	Keep sterile
Mouse serum	Sigma Aldrich	M5905	Keep sterile
Paraffin Film - Parafilm M	Sigma Aldrich	P7793
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15979-063	Freeze in aliquots and keep sterile
Phosphate buffered saline pH 7.4	ThermoFischer Scientific	10010-023	Keep sterile
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max	Sigma Aldrich	R7757	Keep sterile
Trypan Blue Solution	Sigma Aldrich	T8154
Trypsin-EDTA 0.5%(10x)	Invitrogen	15400-054
FACSARIA FUSION	BD Pharmingen		Fluorescence Activated Cell Sorter