ヒト心臓組織からの血管周囲多能前駆細胞集団の単離

要約

人間の心臓組織は、心筋再生のために適切であり得る多能血管周囲の前駆細胞集団を保有します。ここに記載された技術は、ネイティブの血管に関連する2つの多能ストローマ細胞集団の同時単離および精製を可能にする、すなわち CD146 ⁺ CD34 ^-周皮細胞およびCD34 ⁺ CD146 ^-外膜細胞、ヒト心筋から。

要約

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146⁺CD34^- pericytes and vascular CD34⁺CD146^- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

概要

心臓は長い有糸分裂後の臓器と考えられてきました。しかし、最近の研究では、成人の心臓¹で制限された心筋細胞のターンオーバーの存在を実証しました。心筋細胞の分化能を持つネイティブ幹/前駆細胞はまた、cardiosphere形成、SCA-1 ^+、c-キット⁺を含め、大人の齧歯動物と人間の心の中に心筋内で同定され、そして最近でてきた、血管周囲の前駆細胞^2,3。これらの細胞は、細胞移植またはインサイチュ増殖の刺激を介して心臓の修復/再生を増強することを目的とした治療のための魅力的な候補を表します。

間葉系幹/間質細胞（MSC）は、MSCの治療適用の^4,5臨床試験は、心血管修復^6、移植片対宿主病⁷のような複数の病理学的条件のために行われているほとんどすべてのヒト組織から単離されています、および肝硬変^8。有益な効果は、へのMSCの能力に起因している：炎症⁹のサイトへの家。異なる細胞型¹⁰に分化。プロ修復分子^11を分泌^します 。そして、宿主免疫応答^12を調節^します 。 MSCの単離は、伝統的に、プラスチック基板への優先的な遵守に依存してきました。しかし、得られた細胞の集団は、一般的に¹³著しく不均一です。から（ ^- / CD34 ^- / CD45 ^- / ^- CD56 CD146 ⁺ / CD31）キーの血管周囲細胞マーカーの組み合わせで選別（FACS）、蛍光活性化細胞を使用することにより、我々は、多能MSCのような前駆体集団を単離および精製することができました大人の骨格筋や白色脂肪¹⁴を含む複数のヒト組織。

様々な非心臓組織における血管周囲の細胞集団は、幹細胞/前駆細胞の特性を有することが示されていますNDは、心血管の設定で臨床使用のために検討されています。周皮細胞、最もよく知られている血管周囲細胞サブセットの一つは、新しい血管¹⁵の開発を含むいくつかの病態生理学的役割を果たして不均一な集団であり、血圧^16、及び血管の完全^17,18の維持の調節。複数の組織に示すように、周皮細胞の特定のサブセットは、ネイティブMSC抗原を発現し、FACS精製後に¹⁴初代培養でのMSCのような表現型を維持します。また、これらの細胞を安定に培養内での長期的な表現型を維持したMSC ^19,20と同様の多系列分化能を示します。これらの結果は、周皮細胞は、とらえどころのないMSC ¹⁴の起源の一つであることを示唆しています。周皮細胞の治療可能性は、虚血負傷者への移植後の心筋瘢痕化および強化された心機能の低下と実証されています心^21。最近、我々は成功し、ヒト心筋から周皮細胞を精製し、骨格筋形成³の不在で、そのMSCのような表現型および多分化（脂肪生成、軟骨形成および骨形成）を実証しました。また、心筋周皮細胞が他の臓器から精製されたカウンターパートと比較した場合、差動心筋電位と血管新生能力を示しました。

多能血管周囲の幹/前駆細胞、外膜細胞の第二集団は、陽性のCD34発現²²に基づいて、ヒト伏在静脈から単離されています。静脈外膜細胞はクローン原性ポテンシャル、中胚葉分化能およびインビトロでの血管新生促進の可能性を有することが示されています。マウスの虚血損傷した心臓へのこれらの細胞の移植は、間質性線維症の減少、血管新生および心筋の血流の増加、減少、心室DILをもたらしエーション、および増加した心臓の駆出率^23。興味深いことに、脂肪外膜細胞が刺激²⁴と周皮細胞の表現型の採用を示唆し、CD34発現を失い、アンジオポエチンII処理に応答して、培養中のCD146の発現をアップレギュレートすることが示されています。心臓内、しかし、外膜の細胞集団は、まだ前向きにFACSにより精製および/または十分に特徴付けられていません。次のセクションで説明した細胞単離手順を用いて、我々は現在、心筋外膜細胞を特徴付けると再生アプリケーションのための彼らの可能性を調査しています。

ここで我々は、ヒト胎児または成人の心筋から血管周囲の幹/前駆細胞の2亜集団を分離し、精製するための方法について説明します。この前向き細胞単離方法は、比較研究やfurtheのためのヒト心臓生検から同質遺伝子血管周囲の幹/前駆細胞サブセットを取得するために研究者を可能にしますrの様々な心臓の病的状態におけるそれらの治療の可能性を探ります。

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プロトコル

人間の心臓のサンプルの1処理

1. すべての流体、コンテナ、機器、および専用の操作領域が無菌であることを確認してください。
2. 20％ウシ胎児血清（FBS）、氷上で1％ペニシリン - ストレプトマイシン（P / S）を含む冷却したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）から成る記憶媒体（組織バンクまたは外科チームによって調達）心臓組織試料を置き輸送^3。
3. 記憶媒体からの心臓サンプルを除去し、2％FBSおよび1％P / Sを補充したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）からなる洗浄媒体で洗浄します。サンプルを取り扱う際は、大型船や心膜を把握し、心筋の破砕最小限にするために、微細な先端鉗子を使用します。
4. ペトリ皿の中で洗浄媒体にサンプルを沈めると^3に記載^{されている}よう^に滅菌アイリスはさみや先の細いピンセットで心膜、心内膜および大血管を削除します。
5. 残りmyocaをカット片面カミソリの刃や鋭いアイリスハサミを用いて約1ミリメートル³の小片にrdium。注：サンプルは即座に処理されている場合は最高の細胞収量が得られることになります。遅延が避けられない場合、新鮮な記憶媒体で処理された心臓組織の保存（> 1 cm ³の組織あたり5ml）で最大72時間、4℃でしかし、おそらく細胞収率の関連する低下と、可能です。

細胞の組織および単離の2消化

1. たて水浴中で消化1.5ミリリットルコラゲナーゼの各Iを含む溶液、コラゲナーゼII、およびコラゲナーゼIV（すべてのDMEM中ミリリットルの0.5mg /時）と37°Cまでのウォームを構成しています。
   注：ボリュームとコラゲナーゼの濃度は、約1cm ³の試料に適しています。
2. 100μmのストレーナを介して吊り下げ組織片を濾過し、PBSで2回洗浄します。滅菌30ミリリットルの容器に組織片を移し密閉蓋。
   注意：ショートワイドポットではなく、背の高い狭い管がより良い結果を与えます。また、無菌の50mlチューブに組織片を入れて、30ミリリットルの容器が利用できない場合、水平方向に配置します。
3. すべての消化液（4.5ミリリットル合計）を追加し、120 rpmのに設定し、37℃の振盪水浴中で密封されたビニール袋内のコンテナを配置します。また、120回転に設定された加熱オービタルシェーカーにパラフィンフィルムと場所で容器を密閉。
4. 15分後、三回、さらに15分間、交換する前に、ポットを取り外して反転。削除し、20％FBSおよび1％P / Sを補充したDMEM 5 mlのコラゲナーゼを急冷。
5. 静かに任意の組織塊を破壊するために10ミリリットルの血清学的ピペットで1020年に回ピペッティングすることによってダイジェストを粉砕します。未消化の物質を除去し、単一細胞懸濁液を得るために、100ミクロン、70ミクロン、最後に40μmのセルストレーナーを介してサスペンションを連続してフィルタリングします。
   注意：酵素消化プロセスによってdebrisgeneratedセルを回避するために、セルストレーナーの間で洗わないでください。
6. 遠心分離機4分間、200×gで細胞懸濁液を、注意深く上清をデカントし、洗浄媒体の4ミリリットルで希釈する前に、室温で2分間のバッファを溶解赤血球の1ミリリットル中にペレットを再懸濁します。
7. 遠心分離工程を繰り返し、洗浄媒体の1ミリリットル中にペレットを再懸濁。よく混ぜ、細胞計数のために細胞懸濁液10μlを取ります。
8. トリパンブルー染色の10μlの細胞懸濁液10μlを混合し、細胞計数のための標準的な血球計数器に液10μlを配置します。コーナー平方あたりの平均値を得るために4で4隅の正方形内に存在する明るい、円形細胞の数（それぞれが16小さな正方形に細分化）し、除算を数えます。染色希釈係数を考慮するために2で平均値を乗算した後、10 ^4は、サンプルを1mlあたりの細胞の総数を取得することによって。

3。細胞標識およびソート

1. 細胞懸濁液をマウス血清の50μLを添加し、非特異的抗体結合をブロックするために20分間4℃でインキュベートします。
2. 遠心分離機4分間、200×gでマウス血清を用いて細胞懸濁液を、上清を除去し、そして100μlあたり1×10 ⁶細胞の濃度で洗浄媒体に再懸濁します。
3. アリコート2のポリスチレン丸底に50μlのアイソタイプおよび非染色コントロールの細胞懸濁液のそれぞれは、管は、マルチカラー染色のための第三のチューブに残りの容量を配置し、フローサイトメトリー。
4. マルチカラー染色のための単一細胞懸濁液に：CD34-PE、CD45-APC-Cy7を、CD56-PE-Cy7を、CD144-PerCPを-Cy5.5標識、およびCD146-AF647抗体（100すべて1）を追加します。アイソタイプコントロールのために、PE-、APC-Cy7-、PE-Cy7-、PerCPを-Cy5.5-とAF647コンジュゲートアイソタイプ抗体の同等のボリュームを追加します。静かにピペットは、細胞と抗体を混合し、20 4℃で全てのチューブをインキュベートします暗所で分。
5. ボトムフローサイトメトリーチューブラウンド5ポリスチレンで洗浄媒体100μlに正のビーズの1滴を追加することによって、補償制御ビーズを準備します。 5管のそれぞれに個別に：CD34-PE、CD45-APC-Cy7を、CD56-PE-Cy7を、CD144-PerCPを-Cy5.5標識、およびCD146-AF647抗体（100すべて1）を追加します。暗所で20分間、4℃ですべてのチューブをインキュベートします。
6. インキュベーションの間、細胞採取管内皮増殖培地-2 4℃（EGM-2）培地と場所500μlの各準備をします。
7. 抗体インキュベーション後、非結合抗体を除去するために、細胞およびビーズを洗浄するための洗浄培地5mlを加えます。 4分間200×gで遠心分離は全てのチューブ。洗浄および遠心分離ステップを繰り返します。慎重に優しく時に再懸濁し、細胞上清およびピペットをデカント。
8. 250μLあたり約1×10 ⁶細胞の濃度で、洗浄媒体に再懸濁します。洗濯メートル100μlの中のビーズを再懸濁edium。
9. 暗所で氷上でセルソーターに全ての細胞およびビーズ懸濁液を輸送。正ビーズ補償制御管に負のビーズの1滴を加え、蛍光補正を設定するためにこれらを使用しています。
10. バックグラウンド蛍光を確立し、以下に電圧を設定するための製造元の指示に従って染色されていないコントロール細胞を実行します。FSC 150V; SSC 290V; V450 / 50 350V; V710 / 50 620V; B530 / 30 400V; B710 / 50 530V; YG780 / 60 460; R670 / 30 480V; R780 / 60 460V。製造業者の指示に従って実行アイソタイプ対照は、非特異的結合に関連したバックグラウンド蛍光の閾値を確立します。マルチカラー染色されたサンプルを実行し、収集チューブ（ 図1）に周皮細胞および外膜細胞集団を収集します。
    注：最適な生存細胞収量は周皮細胞の総生細胞解離の約3％と外膜の細胞は4％です。

4.細胞培養

1. FACS選別の結果に応じて適切なサイズの培養プレートを選択します。成長面積1cm ²あたりの滅菌0.2％ゼラチン溶液100μlを添加して、被覆するために、手動で全体の井戸を攪拌します。 4℃で10分間、プレートをインキュベートし、完全にゼラチン溶液を除去。培養プレートを準備しながら、氷上で回収した細胞を保管してください。
   注：ゼラチンコーティングした培養表面上3万40,000細胞/ cm ²の密度で播種したときにたてソート周皮細胞および外膜細胞がよく育ちます。
2. 4分間、200×gで新鮮に採取した細胞を遠心分離し、静かにEGM-2.Seed適切な量のゼラチンコートプレート上の細胞に細胞ペレットを再懸濁。
   注：セルの実際の数はウェルあたり播種すると追加されるEGM-2の量は、プレート選択によって異なります。例えば0.5 mlおよび1mlのEGM-2は、それぞれ、48および24ウェルプレートのウェル当たりに必要とされます。
3. 交換EGM-2血管周囲細胞増殖培地用（細胞は（）は、少なくとも72時間後に定住し、プレートに付着した後、DMEMは、周皮細胞および外膜細胞の両方のために20％FBSおよび1％P / S）を補充しました。その後、上からメディアごとに72時間を変更します。 C、5％CO ₂中、37℃で初期および後続のすべてのインキュベーションを行います。
4. 周皮細胞および外膜細胞が80〜90％コンフルエンスに達したときに、0.05％トリプシンEDTAを用いて細胞を解離します。コーティングされていないポリスチレン培養プレート上に3：1の比で、次に継代の細胞を血管周囲細胞増殖培地中に再懸濁し、PBS中20％FBS、4分間、200×gで遠心分離してクエンチしました。継代2から以降、1で継代細胞：5の比率（または約7,000細胞/ cm ^2）コーティングされていないポリスチレン培養プレートまたはフラスコに。

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結果

単一細胞は、前方および側方散乱分布に基づいて破片や二重から区別されました。生細胞は、DAPI染料を取るために彼らの失敗によって同定しました。ゲーティング戦略はこのライブ、全心筋細胞解離（ 図1）のアイソタイプ対照用標識に基づいて選択されました。生きた細胞から、CD45 ⁺細胞が最初にCD56 ⁺細胞に続いて、ゲートアウトしま?...

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ディスカッション

増加する証拠は、損傷後の成人の心臓の限られた再生能力をサポートしています。傷ついた心の中で、このような回生応答を担当するネイティブ前駆細胞の同定および特徴付けは、関連機構とシグナル伝達経路の理解と治療的にこれらの細胞を利用するアプローチの開発の両方のために重要です。

以前のプロトコルでは、ヒト骨格筋²⁵から血管周囲の前駆細胞サ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AbC Anti-mouse Bead Kit	Molecular Probes	A-10344
Collagenase I	Gibco	17100-017	Reconstitute powder as required and filter sterilise
Collagenase II	Gibco	17101-015
Collagenase IV	Gibco	17104-019
anti-human CD34-PE	BD Pharmingen	555822	Keep sterile
anti-human CD45-APC-Cy7	BD Pharmingen	557833	Keep sterile
anti-human CD56-PE-Cy7	BD Pharmingen	557747	Keep sterile
anti-human CD144-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Keep sterile
anti-human CD146-AF647	AbD Serotec	MCA2141A647	Keep sterile
EGM2-BulletKit	Lonza	CC-3162	For collection of cells and culture until adhered
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate	ThermoFischer Scientific	10566-016
Fetal Bovine Serum	ThermoFischer Scientific	10500-064	Freeze in aliquots and keep sterile
Gelatin	Sigma Aldrich	G1393	Dilute with sterile water
IgG1k-PE	BD Pharmingen	559320	Keep sterile
IgG1k-APC-Cy7	BD Pharmingen	557873	Keep sterile
IgG1k-PE-Cy7	BD Pharmingen	557872	Keep sterile
IgG1k-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Keep sterile
IgG1k-647	AbD Serotec	MCA1209A647	Keep sterile
Mouse serum	Sigma Aldrich	M5905	Keep sterile
Paraffin Film - Parafilm M	Sigma Aldrich	P7793
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15979-063	Freeze in aliquots and keep sterile
Phosphate buffered saline pH 7.4	ThermoFischer Scientific	10010-023	Keep sterile
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max	Sigma Aldrich	R7757	Keep sterile
Trypan Blue Solution	Sigma Aldrich	T8154
Trypsin-EDTA 0.5%(10x)	Invitrogen	15400-054
FACSARIA FUSION	BD Pharmingen		Fluorescence Activated Cell Sorter