Выделение Периваскулярный мультипотентных предшественников клеточных популяций из человеческой ткани сердца

Резюме

Человеческой сердечной ткани укрывает мультипотентных популяции клеток-предшественников периваскулярные, которые могут быть пригодны для регенерации миокарда. Техника , описанная здесь , позволяет одновременно выделения и очистки двух мультипотентных клеточных популяций стромы , связанных с носителями кровеносных сосудов, т.е. CD146 ⁺ CD34 ^- перицитов и CD34 ⁺ CD146 ^- адвентициальных клетки, из миокарда человека.

Аннотация

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146⁺CD34^- pericytes and vascular CD34⁺CD146^- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Введение

Сердце уже давно считается постмитотическими орган. Однако недавние исследования показали наличие ограниченного оборота кардиомиоцитов у взрослых человеческих сердец ^1. Родные стволовые клетки / клетки - предшественники с кардиомиоцитов дифференцировке также были определены в миокарде у взрослых грызунов и человеческие сердца, в том числе Sca-1 ^+, C-Kit ^+, cardiosphere-формирующей, и совсем недавно, периваскулярные клетки - предшественники ^2,3. Эти клетки представляют привлекательными кандидатами для терапии , направленных на повышение сердечного восстановления / регенерации через трансплантации клеток или стимуляции пролиферации на месте.

Мезенхимальных стволовых / стромальных клеток (МСК) были выделены из почти каждой ткани человека ^4,5 Клинические испытания терапевтических применений MSC были проведены для нескольких патологических состояний , таких как сердечно - сосудистые ремонта ^6, трансплантат против хозяина заболевания ⁷ , И цирроз печени ^8. Благоприятные эффекты были приписаны способности к MSCs: дома к местам воспаления ^9; дифференцироваться в различные типы клеток ^10; секретируют про-репаративных молекул ^11; и модулировать иммунные реакции хозяев ^12. Изоляция MSCs традиционно полагались на их преимущественной соблюдения пластиковых подложках. Тем не менее, в результате популяция клеток , как правило , заметно гетерогенным ^13. При использовании флуоресцентного активированной сортировки клеток (FACS) с комбинацией ключевых маркеров периваскулярных клеток, мы смогли выделить и очистить мультипотентных MSC-как население предшественника (CD146 ⁺ / CD31 ^- / CD34 ^- / CD45 ^- / CD56 ^-) от несколько человеческих тканей , включая взрослых скелетных мышц и белого жира ^14.

Периваскулярные клеточные популяции в различных несердечных тканей было показано, что имеют свойства стволовых / прогениторных кювета системые исследуются для клинического применения в сердечно-сосудистой обстановке. Перициты, один из самых известных околососудистых подмножеств клеток, являются гетерогенной популяции , которые играют несколько ролей патофизиологические в том числе в разработке новых судов ^15, регулирование кровяного давления ^16, и поддержание целостности сосудов ^17,18. Как было показано во многих тканях, специфические подмножества перицитами изначально выразить MSC антигены и поддерживать их MSC-подобные фенотипы в первичной культуре после FACS очистки ^14. Кроме того, эти клетки стабильно сохраняют свои долгосрочные фенотипов внутри культуры и демонстрируют несколько клонов дифференциации потенциал, похожий на MSCs ^19,20. Эти результаты свидетельствуют о том, что перицитов являются одним из истоков неуловимого MSC ^14. Терапевтический потенциал перицитов было продемонстрировано с сокращением миокарда рубцевания и расширение функции сердца после трансплантации в ишемией ранениясердца ^21. В последнее время мы успешно очищают перицитов из миокарда человека и продемонстрировали свои МСЦ-как фенотипы и мультипотентность (липогенез, хондрогенезе и остеогенез) при отсутствии скелетной миогенезе ^3. Кроме того, инфаркты перицитов выставлены дифференциальные cardiomyogenic потенциал и развитие кровеносных сосудов потенциала по сравнению с аналогами, очищенных из других органов.

Вторая популяция мультипотентных периваскулярных стволовых клеток / клеток - предшественников, в адвентиции клетки, был выделен из подкожных вен человека на основе выражения ²² положительным CD34. Венозные адвентициальные клетки , как было показано , чтобы иметь потенциал, клоногенных мезодермального способность дифференциации и проангиогенные потенциал в пробирке. Трансплантация этих клеток в ишемией сердца травмированных мышей привело к уменьшению интерстициального фиброза, увеличение ангиогенеза и кровотока миокарда, снижение желудочковой разбавленнойвания, а также увеличение сердечного выброса фракция ^23. Интересно отметить , что жировая адвентициальные клетки было показано , что теряют экспрессию CD34 и CD146 выражение апрегулируются в культуре в ответ на лечение Ангиопоэтинподобный II, что предполагает принятие перицитов фенотипа при стимуляции ^24. В сердце, тем не менее, адвентиции популяция клеток еще не перспективно очищают FACS и / или хорошо охарактеризованы. Используя процедуры выделения клеток, описанных в следующих разделах, мы в настоящее время характеризующие инфаркты адвентициальных клетки и исследовать их потенциал для регенеративной приложений.

Здесь мы опишем способ выделения и очистки двух субпопуляций периваскулярными стволовых клеток / клеток-предшественников из эмбриона человека или взрослого миокарда. Этот метод выделения проспективное клеток позволит исследователям получить изогенных периваскулярные подмножества стволовых / прогениторных клеток из биопсий сердца человека для проведения сравнительных исследований и furtheR исследовать их терапевтический потенциал в различных сердечных патологических состояниях.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Обработка человеческого кардиохирургии образца

1. Убедитесь, что все жидкости, контейнеры, инструменты, а также специализированный оперативной области являются стерильными.
2. Поместите образец ткани сердца (закупленные банка тканей или хирургической бригады) в запоминающей среде, состоящей из модифицированной среды охлажденной Дульбекко Eagle (DMEM), содержащей 20% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина (P / S) на льду для перевозки ^3.
3. Удалить сердечный образец из запоминающей среды и промывают промывной среды, состоящей из фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) с добавлением 2% FBS и 1% P / S. При обработке образца, используйте точная наклоненная пинцетом захватить крупные сосуды или перикард и свести к минимуму дробление миокарда.
4. Погрузите образец в моющей среде в чашке Петри и удалить перикарда, эндокарда и крупные кровеносные сосуды с стерилизованных ириса ножницами и остроконечного пинцета , как описано ^3.
5. Отрежьте оставшиеся myocardium на мелкие кусочки примерно 1 мм ³ с помощью одной стороне лезвия бритвы или пару острых ножниц радужной оболочки глаза. Примечание: Наиболее высокие выходы ячеек будут получены, если образцы обрабатываются немедленно. Если задержка неизбежна, хранение обработанной ткани сердца в свежей среде для хранения (> 5 мл на 1 см ³ ткани) при 4 ° С в течение 72 ч , возможно, однако , предположительно с соответствующим снижением выхода клеток.

2. Расщепление ткани и выделение клеток

1. Свежеиспеченный составляют переваривания раствор, содержащий 1,5 мл каждого из коллагеназы I, коллагеназы II и коллагеназы IV (все по 0,5 мг / мл в DMEM) и нагревают до 37 ° С в водяной бане.
   Примечание: Объем и концентрация коллагеназы пригодны для образцов приблизительно 1 см ^3.
2. Фильтр приостановленные кусочки ткани через сито 100 мкм и дважды промывают PBS. Передача части ткани в стерильный 30 мл контейнера сплотно закрытой крышкой.
   Примечание: Короткие широкие горшки, а не высокие узкие трубки дают лучшие результаты. В качестве альтернативы, положить кусочки ткани в стерильный 50 мл пробирку и помещают горизонтально, если 30 мл баллона под недоступен.
3. Добавьте все пищеварением растворы (4,5 мл всего) и поместите контейнер в герметичном полиэтиленовом пакете в ванне 37 ° C встряхивании воды, установленного до 120 оборотов в минуту. В качестве альтернативы, запечатать контейнер с парафиновой пленкой и поместить в нагретую орбитальном шейкере до 120 оборотов в минуту.
4. Через 15 минут снимите и переверните горшок три раза, прежде чем заменить в течение еще 15 мин. Удалить и гасят коллагеназы с 5 мл DMEM, дополненной 20% FBS и 1% P / S.
5. Растирают дайджеста осторожно пипеткой от десяти до двадцати раз с 10 мл серологической пипеткой, чтобы разбить комки любые ткани. Суспензию фильтруют последовательно через 100 мкм, 70 мкм и, наконец, 40 мкм клеточных сетчатые для удаления непереваренных материалов и получения суспензии отдельных клеток.
   Заметка:Не смывать между клеточными стяжек, чтобы избежать клетки debrisgenerated в процессе пищеварения фермента.
6. Центрифуга клеточной суспензии при 200g в течение 4 мин, осторожно декантируют супернатант и повторно приостанавливать осадок в 1 мл эритроцитов лизирующего буфера в течение 2 мин при комнатной температуре перед разбавлением 4 мл промывочной среды.
7. Повторите центрифугирования и повторно приостанавливать осадок в 1 мл промывочного раствора. Хорошо перемешать и принимать по 10 мкл клеточной суспензии для подсчета клеток.
8. Смешать 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл трипанового синего красителя и помещают по 10 мкл смеси на стандартном гемоцитометра для подсчета клеток. Подсчитайте количество ярких, круглых клеток, присутствующих в четырех угловых квадратов (каждый разделен на шестнадцать маленьких квадратов) и разделить на 4, чтобы получить среднее значение за угла квадрата. Умножьте среднее значение на 2 для учета коэффициента разбавления пятно , а затем 10 ⁴ , чтобы получить общее количество клеток на 1 мл образца.

3. Cell Этикетировочное и сортировка

1. Добавляют 50 мкл мышиной сыворотки к суспензии клеток и инкубировали при 4 ° С в течение 20 мин, чтобы блокировать связывание неспецифическое антитело.
2. Центрифуга клеточной суспензии с мышиной сывороткой при 200g в течение 4 мин, удаления надосадочной жидкости, и повторно приостанавливать в моющей среде при концентрации 1 × 10 ⁶ клеток на 100 мкл.
3. Аликвоты по 50 мкл каждой клеточной суспензии для изотипа и неокрашенных контролей в два полистирола с круглым дном проточной цитометрии трубки затем поместить оставшийся объем в третью пробирку для многоцветной окраски.
4. Добавить CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5 и CD146-AF647 антитела (всего 1: 100) в одной клеточной суспензии для многоцветного окрашивания. Для контроля изотипа, добавьте эквивалентные объемы, APC PE-Cy7--, PE-Cy7-, PerCP-Cy5.5- и AF647-сопряженными изотипных антител. Аккуратно пипетку, чтобы смешать антитела с клетками и инкубировать все пробирки при температуре 4 ° С в течение 20мин в темноте.
5. Готовят управления корректировкой бусинки, добавив одну каплю положительных бусинок к 100 мкл промывочного раствора в пяти полистирола с круглым дном и проточной цитометрии трубок. Добавить CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5 и CD146-AF647 антитела (всего 1: 100) по отдельности к каждому из 5 трубок. Инкубируйте все пробирки при температуре 4 ° С в течение 20 мин в темноте.
6. Во время инкубации, готовят сбора клеток пробирки, каждая с 500 мкл роста эндотелия сосудов среднего-2 (EGM-2) культуральной среды и место при 4 ° С.
7. После инкубации антитела, добавляют 5 мл промывочной среды, чтобы промыть клетки и бусы с целью удаления несвязанного антитела. Центрифуга все пробирки при 200 мкг в течение 4 мин. Повторите для стирки и центрифугирования шаг. Осторожно сливают супернатант и пипетку осторожно при ресуспендирования клеток.
8. Ресуспендируйте в моющей среде в концентрации приблизительно 1 × 10 ⁶ клеток на 250 мкл. Повторное приостановить бисером в 100 мкл промывочного мedium.
9. Транспорт все клеточные и Шарик суспензии клеток к сортировщика на льду в темноте. Добавьте 1 каплю отрицательных бус положительных трубок контроля компенсации шарик и использовать их, чтобы установить компенсацию флуоресценции.
10. Запуск неокрашенные клетки управления в соответствии с инструкциями изготовителя по созданию фоновой флуоресценции и установить напряжение к следующему: FSC 150V; SSC 290V; V450 / 50 350V; V710 / 50 620V; B530 / 30 400В; B710 / 50 530V; YG780 / 60 460; R670 / 30 480В; R780 / 60 460В. Запуск изотипы управления в соответствии с инструкциями изготовителя, чтобы установить фон флуоресценции пороги, связанные с неспецифическое связывание. Запуск многоцветной окрашенного образца и собирать перицитов и популяции адвентициальных клеток в приборке (рисунок 1).
    Примечание: Оптимальные выходы жизнеспособных клеток являются приблизительно 3% от общей диссоциации живых клеток для перицитов и 4% для адвентициальных клеток.

4. Культура клеток

1. Выберите подходящий размер культуры пластины в соответствии с итогами сортировкой FACS. Добавляют 100 мкл стерильного 0,2% раствора желатина на см ² площади роста и перемешивать вручную , чтобы покрыть всю скважины. Инкубируйте пластины при температуре 4 ° С в течение 10 мин и полностью удалить раствор желатина. Держите собранные клетки на льду во время приготовления культуры пластин.
   Примечание: отсортированный перицитов и адвентициальные клетки растут хорошо , когда высевали при плотности от 30000 до 40000 клеток / см ² на желатин покрытием поверхности культуры.
2. Центрифуга свежесобранных клеток при 200g в течение 4 мин и осторожно повторно приостанавливать осадок клеток в соответствующем количестве EGM-2.Seed клеток на покрытых желатином пластин.
   Примечание: Фактическое количество ячеек, которые будут посеяны на лунку, и количество EGM-2, которые будут добавлены в зависимости от выбора пластины. Например, 0,5 мл и 1 мл EGM-2 необходимы на лунку в течение 48- и 24-луночные планшеты, соответственно.
3. Обмен EGM-2 для средних периваскулярная роста клеток (DMEM, дополненной 20% FBS и 1% P / S) для обоих перицитов и адвентициальных клеток, как только клетки осели и приклеена к пластине (после того, как по меньшей мере 72 ч). Изменение средств массовой информации каждые 72 ч с тех пор. Проведение первоначального и всех последующих инкубацию в 5% СО ₂ и при 37 ° С.
4. Диссоциируют клеток с использованием 0,05% трипсина ЭДТА при перицитов и адвентициальные клетки достигают от 80 до 90% слияния. Гасили 20% FBS в PBS, центрифугируют при 200g в течение 4 мин, повторно приостанавливать в околососудистой среде для роста клеток, а затем прохождение клеток при соотношении 1: 3 на непокрытых полистирол культуральных планшетах. От Пассаж 2 года и далее, прохождение клетки в соотношении 1: 5 (или приблизительно 7000 клеток / см ²⁾ без покрытия пластин полистирола культуры или колб.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Отдельные клетки отличались от мусора и дублетов на основе распределений вперед и бокового рассеяния. Живые клетки были идентифицированы по их непринятие до красителя DAPI. Стратегия стробирования была выбрана на основе управления изотипическим маркировки этого живо...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Растущие доказательства поддерживает ограниченную регенеративную способность взрослого сердца человека после травмы. Идентификация и характеристика нативных клеток-предшественников, ответственных за такие регенеративных реакций в травмированных сердцах имеют решающее значение ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AbC Anti-mouse Bead Kit	Molecular Probes	A-10344
Collagenase I	Gibco	17100-017	Reconstitute powder as required and filter sterilise
Collagenase II	Gibco	17101-015
Collagenase IV	Gibco	17104-019
anti-human CD34-PE	BD Pharmingen	555822	Keep sterile
anti-human CD45-APC-Cy7	BD Pharmingen	557833	Keep sterile
anti-human CD56-PE-Cy7	BD Pharmingen	557747	Keep sterile
anti-human CD144-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Keep sterile
anti-human CD146-AF647	AbD Serotec	MCA2141A647	Keep sterile
EGM2-BulletKit	Lonza	CC-3162	For collection of cells and culture until adhered
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate	ThermoFischer Scientific	10566-016
Fetal Bovine Serum	ThermoFischer Scientific	10500-064	Freeze in aliquots and keep sterile
Gelatin	Sigma Aldrich	G1393	Dilute with sterile water
IgG1k-PE	BD Pharmingen	559320	Keep sterile
IgG1k-APC-Cy7	BD Pharmingen	557873	Keep sterile
IgG1k-PE-Cy7	BD Pharmingen	557872	Keep sterile
IgG1k-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Keep sterile
IgG1k-647	AbD Serotec	MCA1209A647	Keep sterile
Mouse serum	Sigma Aldrich	M5905	Keep sterile
Paraffin Film - Parafilm M	Sigma Aldrich	P7793
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15979-063	Freeze in aliquots and keep sterile
Phosphate buffered saline pH 7.4	ThermoFischer Scientific	10010-023	Keep sterile
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max	Sigma Aldrich	R7757	Keep sterile
Trypan Blue Solution	Sigma Aldrich	T8154
Trypsin-EDTA 0.5%(10x)	Invitrogen	15400-054
FACSARIA FUSION	BD Pharmingen		Fluorescence Activated Cell Sorter