Isolierung von Perivaskuläre multipotenten Vorläuferzellpopulationen aus menschlichem Herzgewebe

Zusammenfassung

Menschliche Herzgewebe birgt multi perivaskuläre Vorläuferzellpopulationen, die für myokardiale Regeneration geeignet sein können. Die hier beschriebene Technik ermöglicht die gleichzeitige Isolierung und Reinigung von zwei multi stromalen Zellpopulationen , die mit nativem Blutgefäße, dh CD146 ⁺ CD34 ^- Perizyten und CD34 ⁺ CD146 ^- Adventitia - Zellen aus dem menschlichen Herzmuskel.

Zusammenfassung

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146⁺CD34^- pericytes and vascular CD34⁺CD146^- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Einleitung

Das Herz ist seit langem ein post-mitotischen Organ betrachtet worden. Allerdings haben die jüngsten Studien , die die Anwesenheit von begrenzter Kardiomyozyten Umsatz in erwachsenen menschlichen Herzen zeigten ^1. Einheimische Stamm- / Vorläuferzellen mit Kardiomyozyten Differenzierungspotential haben auch im Myokard bei erwachsenen Nagetieren und die Herzen der Menschen, einschließlich Sca-1 ^+, c-kit ^+, cardiosphere bildende und zuletzt, perivaskuläre Vorläuferzellen ^2,3 identifiziert worden. Diese Zellen stellen attraktive Kandidaten für Therapien zur Verbesserung der Herz Reparatur / Regeneration durch Zelltransplantation oder Stimulation der Proliferation in-situ gerichtet.

Mesenchymalen Stamm- / Stromazellen (MSC) wurden aus fast jedem menschlichen Gewebe ^4,5 Klinische Studien der therapeutischen Anwendungen von MSC durchgeführt wurden für mehrere pathologische Zustände wie Herz - Kreislauf - Reparatur ^6, Graft-versus-host-Krankheit ⁷ isoliert Und Leberzirrhose ^8. Positive Effekte wurden auf die Fähigkeit von MSCs zu zugeschrieben: die Heimat von Entzündungsherden ^9; Differenzierung in verschiedene Zelltypen ^10; sezernieren pro-reparative Moleküle ^11; und modulieren Wirtsimmunantworten ^12. Die Isolierung von MSCs ist traditionell auf ihre bevorzugte Einhaltung von Kunststoffsubstraten verlassen. Jedoch ist die sich ergebende Population von Zellen typischerweise deutlich heterogenes ^13. Durch die Verwendung von Fluoreszenz - aktivierte Zellsortierung (FACS) mit einer Kombination von Schlüssel perivaskuläre Zellmarker, konnten wir eine multi MSC artigen Vorläuferpopulation (CD146 ⁺ / CD31 ^- / CD34 ^- / CD45 ^- / CD56 ^-) zur Isolierung und Reinigung von mehrere menschliche Gewebe einschließlich der Erwachsenenskelettmuskulatur und weiße Fett ^14.

Perivaskuläre Zellpopulationen in verschiedenen Nicht-Herzgewebe haben ein gezeigt, Stamm- / Vorläuferzelleigenschaften habennd werden für den klinischen Einsatz in der Herz-Kreislauf-Einstellung untersucht. Perizyten, einer der bekanntesten perivaskulärem Zell - Subpopulationen, sind eine heterogene Population , die ¹⁵ in der Entwicklung neuer Schiffe , darunter mehrere pathophysiologische Rolle spielen, die Regulation des Blutdrucks ¹⁶ und Aufrechterhaltung der vaskulären Integrität ^17,18. Wie in vielen Geweben gezeigt, spezifische Teilmengen von Perizyten nativ MSC Antigene exprimieren und ihre MSC-ähnliche Phänotypen in Primärkultur nach FACS Reinigung ¹⁴ aufrecht zu erhalten. Außerdem halten diese Zellen stabil ihre langfristigen Phänotypen in der Kultur und zeigen Multi-Linie Differenzierungspotential, ähnlich wie MSCs ^19,20. Diese Ergebnisse legen nahe , dass Perizyten sind einer der Ursprünge der schwer fassbaren MSC ^14. Das therapeutische Potential von Perizyten wurde mit einer Verringerung der myokardialen Vernarbung und verbesserte Herzfunktion nach der Transplantation nachgewiesen in ischämisch verletztHerzen ^21. Vor kurzem haben wir Perizyten aus dem humanen Myokard erfolgreich gereinigt und zeigten ihre MSC-ähnliche Phänotypen und Multipotenz (Adipogenese, Chondrogenese und Osteogenese) mit dem Fehlen von Skelett myogenesis ^3. Darüber hinaus zeigte myokardialen pericytes Differential kardiomyogenen Potential und angiogene Kapazitäten im Vergleich zu Kollegen aus anderen Organen gereinigt.

Eine zweite Population von multipotenten perivaskulären Stammzellen / Vorläuferzellen, die adventitiellen Zelle, hat sich von menschlichen Saphenavenen auf der Grundlage der positiven CD34 - Expression ²² isoliert. Venöse adventitiellen Zellen wurden clonogene Potenzial, mesodermalen Differenzierungsfähigkeit und proangiogenic Potential in vitro haben gezeigt. Transplantation dieser Zellen in die ischämisch verletzten Herzen von Mäusen führte zu einer Verringerung der interstitiellen Fibrose, einer Zunahme der Angiogenese und myokardiale Blutfluß reduziert ventrikulären dilation und erhöhte Herzauswurffraktion ^23. Interessanterweise haben adipöse adventitiellen Zellen wurden mit Stimulation ²⁴ gezeigt CD34 - Expression verlieren und upregulate CD146 - Expression in Kultur als Reaktion auf Angiopoietin II Behandlung, was auf die Annahme eines pericyte Phänotyp. Innerhalb des Herzens, jedoch hat die Adventitia-Zellpopulation noch nicht durch FACS und / oder gut charakterisiert prospektiv gereinigt. Unter Verwendung der Zellisolierungsverfahren in den folgenden Abschnitten beschrieben, charakterisieren wir derzeit myokardialen adventitiellen Zellen und untersuchen ihr Potential für die regenerative Anwendungen.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zwei Subpopulationen von perivaskulären Stamm- / Vorläuferzellen aus menschlichen fötalen oder erwachsenen Myokard zu isolieren und zu reinigen. Diese prospektive Zellisolierungsverfahren ermöglichen es den Forschern zu isogenen perivaskulären Stammzellen / Vorläuferzelluntergruppen aus menschlichem Herz-Biopsien für vergleichende Studien und furthe erhaltenr erkunden ihr therapeutisches Potential in verschiedenen Herz pathologischen Zuständen.

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Protokoll

1. Verarbeitung von menschlichem Herz Probe

1. Stellen Sie sicher, dass alle Flüssigkeiten, Behälter, Instrumente, und der speziellen Einsatzgebiet sind steril.
2. Platzieren Sie die Herzgewebeprobe (beschafft von der Gewebebank oder chirurgische Team) in dem Speichermedium, bestehend aus gekühltem Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 20% fötales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin (P / S) auf Eis für den Transport ^3.
3. Entfernen Sie die Herzprobe aus dem Speichermedium und Waschen mit einem Waschmedium, bestehend aus phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), supplementiert mit 2% FBS und 1% P / S. Wenn das Probenhandling, benutzen feine gespitzte Pinzette große Gefäße oder Herzbeutel zu erfassen und zu minimieren des Myokard zerdrücken.
4. Tauchen Sie die Probe in Waschmedium in einer Petrischale und entfernen Sie den Herzbeutel, Endokard und großen Blutgefäße mit sterilisiertem Iris Schere und fein kippte Zange als ³ beschrieben.
5. Schneiden Sie die restlichen myocardium in kleine Stücke von etwa 1 mm ³ eine einzelne Seite Rasierklinge oder ein Paar scharfe Iris Schere. Hinweis: Das höchste Zellausbeuten erzielt werden, wenn die Proben sofort verarbeitet werden. Wenn eine Verzögerung unvermeidbar ist, Speicherung des verarbeiteten Herzgewebe in der frischen Speichermedium (> 5 ml pro 1 cm ³ Gewebe) bei 4 ° C für bis zu 72 Stunden ist möglich, jedoch vermutlich mit einem zugehörigen Abnahme der Zellausbeute.

2. Die Verdauung des Gewebes und Isolierung von Zellen

1. Make-up Frisch die Verdauung Lösung, die 1,5 ml jeweils von Kollagenase I, Kollagenase II und Kollagenase IV (alle bei 0,5 mg / ml in DMEM) und warm bis 37 ° C in einem Wasserbad.
   Hinweis: Volumen und die Konzentration von Kollagenase für Proben von etwa 1 cm ³ geeignet sind.
2. Filtern Sie die suspendierten Gewebestücke durch ein 100 & mgr; m Sieb und waschen zweimal mit PBS. Übertragen Sie die Gewebestücke in einen sterilen 30 ml-Behälter mitein dicht verschlossenen Deckel.
   Hinweis: Kurze breite Töpfe anstatt hohen, schmalen Röhren zu besseren Ergebnissen führen. Alternativ dazu können Sie Gewebestücke in einer sterilen 50-ml-Röhrchen und horizontal platzieren, wenn ein 30-ml-Behälter nicht zur Verfügung steht.
3. Fügen Sie die alle Aufschlüssen (4,5 ml gesamt) und stellen Sie den Behälter in einem verschlossenen Plastikbeutel in einem 37 ° C geschüttelten Wasserbad auf 120 Umdrehungen pro Minute. Alternativ dichten den Behälter mit Paraffinfilm und in einem beheizten Orbitalrüttler bis 120 Umdrehungen pro Minute eingestellt.
4. Nach 15 Minuten, zu entfernen und den Topf dreimal umdrehen, bevor sie für weitere 15 min zu ersetzen. Entfernen und löschen Sie die Kollagenasen mit 5 ml DMEM mit 20% FBS und 1% P / S.
5. Man reibt den Digest durch vorsichtiges Pipettieren zehn bis zwanzig Mal mit einer 10 ml serologische Pipette alle Gewebe Klumpen aufzubrechen. Filtern der Suspension nacheinander durch 100 & mgr; m, 70 & mgr; m und schließlich 40 & mgr; m Zellfilter auf unverdaute Materialien zu entfernen und erhalten, die eine Einzelzellsuspension.
   Hinweis:Nicht ausspülen zwischen Zelle strainers Zelle durch das Enzym Verdauung debrisgenerated zu vermeiden.
6. Zentrifugiere die Zellsuspension bei 200 × g für 4 min, den Überstand vorsichtig dekantiert und erneut zu suspendieren, das Pellet in 1 ml des roten Zellenpuffer für 2 min bei Raumtemperatur zu lysieren, bevor mit 4 ml Waschmedium verdünnt.
7. Wiederholen der Zentrifugationsschritt und resuspendieren das Pellet in 1 ml Waschmedium. Gut mischen und nehmen 10 & mgr; l der Zellsuspension zur Zellzählung.
8. Mischungs 10 & mgr; l der Zellsuspension mit 10 ul Trypanblau-Färbung und stellen 10 & mgr; l der Mischung auf einem Standard-Zählkammer zur Zellzählung. Zählen Sie die Anzahl der hellen, runden Zellen, die in den vier Eckquadrate (jeweils in sechzehn kleine Quadrate unterteilt) und dividieren durch 4, um den Mittelwert pro Eckquadrat erhalten. Multiplizieren den Mittelwert von 2 bis Konto für den Faktor stain Verdünnung und dann von 10 ⁴ bis die Gesamtzahl der Zellen pro 1 ml Probe erhalten.

3. Zell Kennzeichnung und Sortierung

1. Je 50 ul Mausserum zu der Zellsuspension und Inkubieren bei 4 ° C für 20 min nicht spezifische Antikörperbindung zu blockieren.
2. Zentrifugiere die Zellsuspension mit Mausserum bei 200 × g für 4 min, entfernen Überstand und resuspendiere in Waschmedium in einer Konzentration von 1 x 10 ⁶ Zellen pro 100 & mgr; l.
3. 50 ul Aliquot jeder der Zellsuspension für den Isotyp und ungefärbten Kontrollen in zwei Polystyrol-Rundbodenröhrchen cytometry fließen dann die verbleibende Volumen in ein drittes Rohr für den Mehrfarbenfärbung schalten.
4. In CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5 und CD146-AF647-Antikörper (alle 1: 100) in die Einzelzellsuspension für den Mehrfarbenfärbung. Für die Isotyp-Kontrolle, fügen äquivalente Volumina von PE-, APC-Cy7-, PE-Cy7-, PerCP-Cy5.5- und AF647-konjugierte Isotyp-Antikörper. Sanft Pipette 20, die Antikörper mit den Zellen und inkubiere alle Röhrchen bei 4 ° C zu mischen,min im Dunkeln.
5. Bereiten Sie Kompensationssteuer Perlen durch Zugabe von einem Tropfen positive Perlen auf 100 & mgr; l Waschmedium in fünf Polystyrol-Rundboden Durchflusszytometrie Rohre. Hinzufügen CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, PerCP CD144--Cy5.5 und CD146-AF647-Antikörper (alle 1: 100) einzeln mit jedem der fünf Rohre. Inkubieren Alle Röhrchen bei 4 ° C für 20 min im Dunkeln.
6. Während der Inkubation vorbereiten Röhren Zellsammlung mit jeweils 500 ul Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) Kulturmedium und bei 4 ° C.
7. Nach Antikörper Inkubation mit 5 ml Waschmedium Zellen und Perlen zu waschen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Zentrifugieren Sie alle Röhrchen bei 200 g für 4 min. Wiederholen Sie die Wasch- und Zentrifugationsschritt. Vorsichtig dekantieren vorsichtig den Überstand und Pipette, wenn die Zellen erneut suspendieren.
8. Resuspendieren in Waschmedium in einer Konzentration von etwa 1 x 10 ⁶ Zellen pro 250 & mgr; l. Re-suspend die Perlen in 100 ul Wasch mittel.
9. Transportieren alle Zell- und bead Suspensionen Zellsortierers auf Eis im Dunkeln. 1 Tropfen negativen Perlen auf die positiven Wulst Kompensationssteuerrohre und verwenden diese die Fluoreszenzkompensation einzustellen.
10. Führen Sie ungefärbten Kontrollzellen gemäß den Anweisungen des Herstellers die Hintergrundfluoreszenz und legen Sie die Spannungen an den folgenden herzustellen: FSC 150V; SSC 290V; V450 / 50 350V; V710 / 50 620V; B530 / 30 400V; B710 / 50 530V; YG780 / 60 460; R670 / 30 480V; R780 / 60 460V. Führen Isotypen steuert den Anweisungen des Herstellers entsprechend die Hintergrundfluoreszenz Schwellenwerte unspezifische Bindung Zusammenhang herzustellen. Führen Sie die mehrfarbigen gefärbten Probe und sammeln die pericyte und adventitiellen Zellpopulationen in die Sammelröhrchen (Abbildung 1).
    HINWEIS: Optimale Lebendzellausbeuten sind etwa 3% der gesamten lebenden Zellen Dissoziation für pericytes und 4% für adventitiellen Zellen.

4. Zellkultur

1. Wählen Sie geeignete Größe Kulturplatten nach dem Ergebnis der FACS-Sortierung. In 100 ul sterilem 0,2% Gelatinelösung pro cm ² Wachstumsbereich und agitieren manuell die gesamte Brunnen zu beschichten. Inkubiere Platten bei 4 ° C für 10 min und Gelatinelösung vollständig zu entfernen. Halten gesammelten Zellen auf Eis während der Vorbereitung Kulturplatten.
   Hinweis: Frisch sortiert Perizyten und Adventitia - Zellen wachsen gut , wenn sie in einer Dichte von 30.000 bis 40.000 Zellen / cm ² auf Gelatine-beschichteten Kulturoberfläche beimpft.
2. Zentrifugieren frisch gesammelten Zellen bei 200 g für 4 min und vorsichtig resuspendieren das Zellpellet in einer geeigneten Menge EGM-2.Seed die Zellen auf Gelatine-beschichteten Platten.
   Hinweis: Die tatsächliche Anzahl der Zellen pro Vertiefung und der Menge des EGM-2 beimpft hinzugefügt werden auf der Platte Auswahl abhängen wird. Beispielsweise 0,5 ml und 1 ml EGM-2 werden pro Well benötigt für 48- und 24-Well-Platten sind.
3. Wechsel EGM-2 für perivaskuläre Zellwachstumsmedium (DMEM, ergänzt mit 20% FBS und 1% P / S) für beide Perizyten und Adventitia-Zellen einmal Zellen an der Platte (nach mindestens 72 Stunden angesiedelt und geklebt). Ändern Sie die Medien alle 72 Stunden von da an. Führen Sie Anfangs- und alle nachfolgenden Inkubationen in 5% CO ₂ und bei 37 ° C.
4. Dissoziieren Zellen 0,05% Trypsin EDTA verwendet, wenn Perizyten und Adventitia-Zellen erreichen 80 bis 90% Konfluenz. Gequenscht mit 20% FBS in PBS, Zentrifugation bei 200 × g für 4 min, resuspendieren in perivaskulären Zellwachstumsmedium und dann Durchgang der Zellen bei einem Verhältnis 1: 3 auf unbeschichteten Polystyrol-Kulturplatten. Von Passage 2 ab, passage Zellen bei einer 1: 5 - Verhältnis (oder bei etwa 7.000 Zellen / cm ²⁾ zu unbeschichteten Polystyrol - Kulturplatten oder Flaschen.

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Ergebnisse

Einzelzellen wurden von Schutt und Dubletts auf der Basis von Vorwärts- und Seitenstreuverteilungen unterscheiden. Lebende Zellen wurden durch ihr Versagen identifiziert den DAPI Farbstoff aufzunehmen. Die Gating - Strategie wurde auf der Grundlage der Isotyp - Kontrolle Kennzeichnung dieser Live, Vollherz Zelldissoziationsmedium (Abbildung 1) gewählt. Von den lebenden Zellen wurden CD45 ⁺ Zellen zuerst gated out, durch CD56 ⁺ -Zellen , gefolgt. C...

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Diskussion

Zunehmende Beweise unterstützt eine begrenzte Regenerationsfähigkeit des erwachsenen menschlichen Herzens nach einer Verletzung. Identifizierung und Charakterisierung von nativen Vorläuferzellen verantwortlich für solche regenerative Reaktionen in verletzten Herzen sind beide entscheidend für das Verständnis der damit verbundenen Mechanismen und Signalwege und die Entwicklung von Ansätzen, diese Zellen therapeutisch zu nutzen.

Vorherige Protokolle haben die Isolierung von perivaskulä...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AbC Anti-mouse Bead Kit	Molecular Probes	A-10344
Collagenase I	Gibco	17100-017	Reconstitute powder as required and filter sterilise
Collagenase II	Gibco	17101-015
Collagenase IV	Gibco	17104-019
anti-human CD34-PE	BD Pharmingen	555822	Keep sterile
anti-human CD45-APC-Cy7	BD Pharmingen	557833	Keep sterile
anti-human CD56-PE-Cy7	BD Pharmingen	557747	Keep sterile
anti-human CD144-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Keep sterile
anti-human CD146-AF647	AbD Serotec	MCA2141A647	Keep sterile
EGM2-BulletKit	Lonza	CC-3162	For collection of cells and culture until adhered
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate	ThermoFischer Scientific	10566-016
Fetal Bovine Serum	ThermoFischer Scientific	10500-064	Freeze in aliquots and keep sterile
Gelatin	Sigma Aldrich	G1393	Dilute with sterile water
IgG1k-PE	BD Pharmingen	559320	Keep sterile
IgG1k-APC-Cy7	BD Pharmingen	557873	Keep sterile
IgG1k-PE-Cy7	BD Pharmingen	557872	Keep sterile
IgG1k-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Keep sterile
IgG1k-647	AbD Serotec	MCA1209A647	Keep sterile
Mouse serum	Sigma Aldrich	M5905	Keep sterile
Paraffin Film - Parafilm M	Sigma Aldrich	P7793
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15979-063	Freeze in aliquots and keep sterile
Phosphate buffered saline pH 7.4	ThermoFischer Scientific	10010-023	Keep sterile
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max	Sigma Aldrich	R7757	Keep sterile
Trypan Blue Solution	Sigma Aldrich	T8154
Trypsin-EDTA 0.5%(10x)	Invitrogen	15400-054
FACSARIA FUSION	BD Pharmingen		Fluorescence Activated Cell Sorter