מדידה כמותית של רמות חומצה רטינואית יחסית ב E8.5 עוברים neurosphere תרבויות באמצעות assay Reporter F9 נדיר- lacZ מבוססי תאים

Summary

Methods to accurately measure retinoic acid (RA) levels in small amounts of tissue do not exist. This protocol describes the easy, quantitative measurement of relative RA levels in E8.5 embryos and neurospheres using an RA reporter cell line.

Abstract

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, neurogenesis, patterning of the hindbrain and spinal cord, and the development of multiple organ systems. Due to its chemical nature as a small amphipathic lipid, direct detection and visualization of RA histologically remains technically impossible. Currently, methods used to infer the presence and localization of RA make use of reporter systems that detect the biological activity of RA. Most established reporter systems, both transgenic mice and cell lines, make use of the highly potent RA response element (RARE) upstream of the RAR-beta gene to drive RA-inducible expression of reporter genes, such as beta-galactosidase or luciferase. The transgenic RARE-LacZ mouse is useful in visualizing spatiotemporal changes in RA signaling especially during embryonic development. However, it does not directly measure overall RA levels. As a reporter system, the F9 RARE-LacZ cell line can be used in a variety of ways, from simple detection of RA to quantitative measurements of RA levels in tissue explants. Here we describe the quantitative determination of relative RA levels generated in embryos and neurosphere cultures using the F9 RARE-LacZ reporter cell line.

Introduction

חומצה רטינואית (RA) היא נגזרת מטבוליט של A רטינול או ויטמין מופק באמצעות פעילות רציפה של דהידרוגנאז הסלולר מספר ^1. בגלל האופי הכימי amphiphatic שלה, שהוא חוצה ממברנות שומנים בדם בקלות יכול לפעול כגורם מסיסים המוךפו"גנטי שהולך ^1. זוהי מולקולה חיונית המווסת תהליכים תאיים התפתחותיים מבוגרים רבים על ידי מתנהג כמו ליגנד לרצפטורים retinoid הגרעיני והפעלת ביטוי גני ^2-10. ללא RA, קולטנים RA אלה (RARs) לאגד Rareş בדנ"א ולפעול repressors; RA קשירה לקולטנים אלה הופך אותם activators תעתיק וכתוצאה מכך ביטוי גן המטרה ^1,5,6.

למרות מסלול איתות RA מאופיין היטב, בגודל הקטן (~ 300 Da) וטבע amphipathic של RA עושים ויזואליזציה היסטולוגית ישירה ומדידה של RA ¹¹ כיום טכני ישימה. השיטה היחידה עבור dirמדידת ect של רמות RA היא באמצעות בידוד של RA ממדגמים רקמות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC) ^11. שיטה זו דורשת בדרך כלל כמויות גדולות של רקמה, בהנחייתם של איגום מדגמים שונים ^12. לפיכך, טכניקה זו היא אינה מותאמת למדידת רמות RA בעוברי פרט או כמויות קטנות של מדגם / רקמות.

על מנת לחקור את הפונקציה הסלולרית של RA, מספר שיטות פותחו כדי להסיק את הנוכחות בעקיפין של RA. שיטות אלה לעשות שימוש במערכות כתב המכילות את RARE RAR-בטא תגובה מאוד נהיגת הביטוי של-galactosidase ביתא או בלוציפראז ^11,13,14. עכבר כתב נדיר- LacZ המהונדס שנוצר על ידי Rossant et al. ¹³ הוא מערכת אידיאלית המאפשרים הדמית אזורי spatiotemporal של איתות RA באתרו ^11,13,15,16 אבל אינו מתאים מדידות כמותיות. שורת תא נדיר- LacZ F9 ^14, על tהוא לעומת זאת, הוא שימושי עבור זיהוי של RA ו מדידות כמותיות של רמות RA ב explants רקמת ^{11,12,14,17,18.}

F9 תאים teratocarcinoma להביע אלפא אנדוגני, בטא, וחומצה רטינואית-גמא קולטני ^19, וליזום בידול לתוך endoderm הקודקודית לאחר חשיפה ^19-21 RA. תאי F9 הוקמו עוד מודל ההתמיינות-induced RA, ולכן הוא נבחר קו תא אידיאלי עבור assay כתב RA. שורת התא העיתונאי F9 הנגזרת סיל-15 RA שנוצרה על ידי וגנר ואח '. ¹⁴ מכילה E. coli'LacZ גנים במורד הזרם של עותק אחד של אלמנט תגובה החומצה הרטינואית 64 נ"ב (RARE) של הקולטן חומצה בטא-רטינואית האדם גן (RAR-בטא). כדי לבחור ולשמור שיבוטים יציבים, המבנה מכיל גם את phosphotransferase aminoglycoside הגן (NEO ^r) כסמן לבחירה בנוכחות G418. שיתוף מבנה זהnfers ביטוי מושרה של-galactosidase ב בנוכחות RA, אשר ניתן דמיינו באמצעות מכתים LacZ ותגובה זו יכולה להיות ובהמשך לכמת באמצעות שיטות colorimetric ^11,12,14,18.

שורת תאי כתב מאוד צדדי זה נעשה שימוש נרחב זיהוי של ייצור RA אנדוגני באמצעות שיתוף התרבות של דגימות רקמה עם תאי הכתב, כגון explants צלחת רצפת שבלול ¹⁷ ועוברים ^14. בנוסף, קו הכתב הזה שימש במשך כימות של רמות RA בחוט השדרה פיתוח על ידי culturing סעיפים ונקווה של מיתרי השדרה עובריים בנפרד והוספת התקשורת מותנה מתרבויות אלה לתאים נדיר- LacZ F9 ^18. כימות בוצעה לאחר מכתים LacZ באמצעות קריאה colorimetric באמצעות קורא צלחת ELISA תקן ^11,12,18. לבסוף, שורת תאי הכתב הזה נוצל בעבר זיהוי של הנוכחות של אנזימים מטבוליים RA ידי ניטורng שינויים ברמות RA ^12,18.

כאן אנו מדווחים כי הרגישות של שורת תאי הכתב הזה גם מאפשרת המדידה של רמות RA שנוצרו מעוברים E8.5 שיתוף תרבותי פרט. זה מאפשר השוואה בין עבר הבודדים של גנוטיפים שונים. כדוגמה ספציפית, Gpr161 הוא GPCR יתום המווסת neurulation בין היתר, באמצעות מסלול איתות RA ^22, ואנחנו מדווחים באמצעות שורת תאים הכתב הזה כדי לחקור את ההשפעה של מוטציה רצסיבית ב Gpr161 ^(VL Gpr161) על רמות RA הכולל עוּבָּר. בנוסף לכך, את הרבגוניות וקלה לשימוש של מערכת הכתב הזה מאפשר את החופש למדוד ולהשוות רמות RA בדגימות רקמה שונות, אפילו בתרבויות neurosphere המתקבלות תאי גזע חוט שדרה מבוגרים. כאן אנו מתארים את הנחישות כמותית של רמות RA ביחס בעוברים ותרבויות neurosphere באמצעות שיתוף התרבות ישיר עם נציג F9 נדיר- LacZ RAשורת תאי orter.

Protocol

כל עבודת החיה נעשתה לפי אשרו שיטות ראטגרס-RWJMS IACUC.

פתרון 1. הכנת Media

1. הכינו פתרונות המניות חיץ לפי טבלה 1. הכינו פתרונות עבודה לפי טבלה 2.

תרבות 2. ותחזוקה של תאים נדירים-LacZ F9

1. תאים קפוא פשרה
   1. כן בינוני תרבית תאי F9 נדיר- LacZ כמפורט בטבלה 2.
   2. מעיל 10 ס"מ תרבות מנות (תרבית תאים שטופלו) עם 10 מ"ל של ג'לטין 0.2% (ראה טבלה 2) למשך 30 דקות ב RT. לשטוף ג'לטין עודף עם שתי שטיפות של 10 מ"ל מים מזוקקים. מיד להוסיף 9 מ"ל של מדיום תרבית תאים F9 נדיר- LacZ לתוך הבקבוק כדי למנוע את הג'לטין מפני התייבשות.
   3. להפשיר בקבוקון של תאים נדירים-LacZ F9 ¹⁴ באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 2 - 3 דקות. פלייט תאים (בסביבות 1 x 10 ⁶ תאים / מ"ל) לתוך ג צלחת מצופהontaining 9 מ"ל של מדיום תרבות. תרבות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. שינוי המדיום למחרת.
2. תחזוקה של תאים נדירים-LacZ F9
   1. שמור על מעבר שוטף כל 2 - 3 ימים ביחס של 1:10.
      הערה: אל תתנו תאים גדלים לתוך confluency כמו זו תגרום הבידול שלהם.
   2. פיצול תרבויות בכל confluency של 80-90%. הסר את התקשורת לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של בופר פוספט 1x (PBS). הסר את PBS ולהוסיף 1 מ"ל של טריפסין, דגירה של 5 דקות. הוסף 9 מ"ל של מדיום תרבות, פיפטה למעלה ולמטה ולפצל תאים 01:10 למעבר.
3. הקפאת תאים הנדיר-LacZ F9
   1. Trypsinize צלחת 10 ס"מ המכיל תאים נדיר- LacZ F9 ב 80 - מפגש 90% כמפורט בשלב 2.2.2. העברת התאים ניתק לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ"ל ו ספין על XG 200 במשך 5 דקות.
   2. הסר supernatant ו resuspend תא גלולה ב 10 מ"ל של F9 נדיר- LacZ freezing בינוני (ראה טבלה 2). Aliquot 1 מ"ל לתוך cryovials שכותרתו בקבוקונים העברת למיכלים הקפאה. מקום קפוא מיכל ב O במקפיא -80 ° C / N והעברת בקבוקונים למכלי חנקן נוזלי למחרת.

3. דיסקציה של עוברי E8.5

1. קייג 'הגדרת הזדווגות בדוקה Plug
   1. הגדרה בכלוב הזדווגות המכיל זוג אחד הזדווגות. בבוקר של יום המחרת, לבדוק את קיומו של תוסף הנרתיק ולייעד היום תוסף נמצא כשמש 0.5 ^23. באותו היום E8.5, עובר קציר.
2. דיסקציה של עוברים
   1. להקריב את הסכר באמצעות נקע בצוואר הרחם ולרסס את אזור הבטן עם אתנול 70% (ראו טבלה 2). ערוך רוחבי לגזור על העור מעל הבטן באמצעות מספרי כירורגיות ולמשוך שני הדשים מזה (קדמי וגם אחורי) כדי לחשוף את אזור הבטן. ביצוע חתך דומהעל הצפק לחשוף את הבטן.
   2. אתר את uteri ולשחרר uteri מן oviducts ו mesometrium בעזרת זוג מספריים ^23. מניחים את uteri בתוך (לתרבות הלא-תא מטופלים) 6 ס"מ צלחת עם 10 מ"ל 1x PBS לשטוף את עודפי השומן ודם. מעבירים עוד 6 צלחת ס"מ המכיל טרי 10 מ"ל 1x PBS.
   3. נפרד אחד רחם המכיל עובר אחד על ידי חיתוך אותו באמצעות מספרי כירורגיות. הסר את הרחם ואת decidua ולשחרר את שק החלמון המכיל את העובר באמצעות שני זוגות לא. 5 מלקחיים ^23.
   4. הפרד את שק החלמון מן העובר, ולהעביר את שק החלמון כדי צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge להפקת DNA גנומי לשמש genotyping. השתמש פיפטה P20 עם קצה רחב נשא, להעביר את העובר כולו לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge המכיל 10 μl של טריפסין. מניחים את הצינור על הקרח.
   5. חזור על שלבים 3.2.3 - 3.2.4 עד שכל העוברים כבר גזור.
3. דיסוציאציה העובר
   1. דגירה צינורות 1.5 מ"ל המכיל עוברים טריפסין על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להקל דיסוציאציה האנזימטית.
      1. Triturate בעדינות בעזרת פיפטור P20 עבור ניתוק מכני של העובר, צלחת נפח כולו 10 μl המכיל העובר אחד ניתק מעל אחד טוב של תאים נדירים-LacZ F9 בצלחת 96-היטב (ראה שלב 5.1 עבור תאים ציפוי נדיר- LacZ F9 צלחת 96-היטב). O תרבות / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.

4. Laminectomy, דיסקציה של מבוגר חוט השדרה המותני ו neurosphere תרבות

1. laminectomy
   1. הקורבן עכבר מבוגר (P60) דרך נקע בצוואר הרחם.
   2. תרסיס בצד הגבה עם אתנול 70% ולעשות חתך רוחבי באמצעות מספרי כירורגיות. משוך הם דשים (קדמי וגם אחורי) זו מזו כדי לחשוף את הלוך עמוד שדרה.
   3. בעזרת מספריים כירורגיות, חתוך את השרירים המכסים את עמוד השדרה.אתר את האזור המותני של עמוד השדרה, מתחת לצלעות. בעזרת מספריים, לעשות חתך עמוק לנתק את עמוד השדרה בשלב זה לחשוף את חוט השדרה.
   4. משוך כלפי מעלה את האזור המותני של עמוד השדרה ללא. 5 מלקחיים כך בסעיף הרוחבי החשוף של חוט השדרה עומד בפני הנסיין. באמצעות קצות מספריים בסדר, לגזור החוליה ושרירים בבית במיקומים 3 בבוקר, 9 אחר הצהריים בסוף סוף נחשף. אחוז דש הגבי של גוף החוליה לחתוך עם מלקחיים. המשך הקיצוצים האלה caudally עד האורך של חוט השדרה המותני חשוף.
   5. שחרר את חוט השדרה של החוליות ללא שימוש. 5 כמו גם מלקחיים בעלי חוד מעוגל. מעבירים את חוט השדרה אל צינור 15 מ"ל המכיל 3 מ"ל של מדיום תרבות DMEM / F12. שמור על הקרח עד שכל מיתרי השדרה המותני בודדו.
2. Dissection בחוט השדרה
   1. יוצקים את המדיום תרבות עם חוט השדרה לתוך צלחת 6 ס"מ (תרבות תאים שאינם מטופלים).
   2. תחת סטראו, להסיר את גרעיני שורש הגבה וכלי דם ברחבי מגזר חוט השדרה ידי אחיזת הכלי בגרעין דם באמצעות שני זוגות לא. 5 מלקחיים בעדינות מושך אותם מן חוט השדרה. מעבירים את קטע חוט השדרה לצלחת 6 ס"מ ללא בינוניים לקצץ את הרקמה דק באמצעות סכין אזמל.
   3. העברת רקמות טחון 15 מ"ל שפופרת המכילה 1 מ"ל של התקשורת דיסוציאציה neurosphere (ראה טבלה 2). שים הצינור על הקרח וחזור על שלבים 4.2.1 - 4.2.2 עד שכל מיתרי השדרה עובדו.
   4. דגירת צינורות המכילים רקמות טחונות במדיום דיסוציאציה על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, קפיצי הצינור בצד לערבב ולאחר מכן לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות אחרות. לאחר עיכול אנזימטי, triturate עם טפטפות אש מלוטש של הפחתת קטרים ​​עבור ניתוק מכני.
      הערה: כן טפטפות אש המלוטשת של הפחתת קטרים ​​לפני ביצוע ניסויים. קח כוס פסטרפיפטה ומחבר את הקצה הרחב עם כותנה נקיה. באמצעות מנורת אלכוהול, פולני אש הקצות טפטפות בתוך הלהבה ליצור בקטרים ​​שונים: "רגיל", "בסדר", ו "קנס נוסף". לקבלה "רגיל" טפטפות מלוטש, לסובב סוף פיפטה בתוך הלהבה לסיבוב של הקצוות מבלי להקטין את הקוטר (~ 1 מ"מ). סובב סוף פיפטה בתוך הלהבה למשך תקופות ארוכות יותר מעט כדי ליצור "בסדר" (~> 1 מ"מ> בקוטר 5 מ"מ) ו "קנס נוסף" (~ 0.5 מ"מ) טפטפות מלוטשת. אין להשתמש טפטפות בקטרים ​​פחות מ -0.5 מ"מ.
3. neurosphere תרבות
   1. צינורות ספין למטה המכיל ניתקו רקמת חוט שדרה ב XG 200 במשך 10 דקות. הסר supernatant ו resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל של התקשורת בתרבות neurosphere (ראה טבלה 2). Triturate עם טפטפת P1,000 ואחריו פיפטה P200 כדי להקל דיסוציאציה.
      הערה: הימנע בועות מציגות,אשר תקטין כדאיות התא.
   2. העברת 10 μl של תאים ניתק לתוך hemocytometer ולקבל ספירת תאים. פלייט תאים בצפיפות של 1x10 ^5/10 מ"ל בבקבוק T25 עם 10 מ"ל של התקשורת בתרבות neurosphere. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 7 ימים עד neurospheres מופיע ^24.
4. neurosphere דיסוציאציה
   1. אסוף תרבות neurosphere ולהעביר עד 15 צינורות מ"ל. ספין ב XG 200 במשך 10 דקות. הסר ביותר של supernatant עוזב 1 מ"ל מאחור. Triturate עם טפטפת P1,000 כדי resuspend התא גלולה ו לנתק neurospheres לתוך תאים בודדים. העברת 10 μl של תאים ניתק לתוך hemocytometer ולקבל ספירת תאים.
   2. פלייט 1 x 10 ⁵ תאים ניתק neurosphere על אחד טוב של נדיר- LacZ F9 בצלחת 96-היטב (ראו סעיף 5.1 עבור ציפוי F9 נדיר- LacZ בצלחת 96-היטב). פלייט 3 בארות כמו משכפל. O תרבות / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.

5. Assay RA של עוברים E8.5 ואת חוט השדרה Neurospheres

1. F9 נדיר- LacZ ציפוי בצלחת 96-היטב
   1. יום אחד לפני עוברי E8.5 קציר או דיסוציאציה של neurospheres, מעיל צלחת 96-היטב עם 100 μl של ג'לטין 0.2% לכל טוב למשך 30 דקות ב RT. לשאוב את הג'לטין ולשטוף פעמיים עם 200 μl של מים מזוקקים.
   2. Trypsinize F9 תאים נדיר- LacZ מתוחזק במנות 10 ס"מ כמפורט בשלב 2.2.2. פלייט 1 x 10 ⁵ תאים / היטב F9-RARE תאי LacZ, אך הפעם באמצעות מדיום התרבות ללא G418.
   3. הכינו מספיק בארות לתרבות משותפת של עוברים (~ 12 - 20, בהתאם לגודל המלטה), neurospheres (3 בארות / גנוטיפ) וכן עבור עקומת סטנדרט בשלושה עותקים (27 בארות).
2. עמית תרבות F9 נדיר- LacZ ו E8.5 עוברים או בחוט השדרה Neurospheres
   1. עובר קציר כמפורט בסעיף 3.2 צלחת על גבי F9נדיר- LacZ בצלחת 96-גם מסעיף 5.1. באופן דומה, לנתק neurospheres צלחת על גבי F9 נדיר- LacZ בצלחת 96-גם מפורט בשלב 4.4. O תרבות / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
3. יצירת עקומת סטנדרט
   1. כדי ליצור עקומת סטנדרט, להכין את כל-trans RA (ב-RA) פתרונות עם הריכוזים הבאים: 100 ננומטר, 10 ננומטר, 1 ננומטר, 100 PM, 10 בלילה, 1 PM, 100 FM, על ידי דילול סדרתי של עקרות מניית RA (ראה טבלה 1) עם מדיום תרבות נדיר- LacZ F9.
   2. הוספת 100 μl של שונות אלה-RA ריכוזים לתאים נדיר- LacZ F9 ממדור 5.1. הקצאת בארות המכילות תאי נדיר- LacZ F9 המטופל כמו שליטה שלילית. כן triplicates של כל ריכוז RA ובארות בקרה שליליות. O תרבות / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
      הערה: תאים נדירים-LacZ F9 להגיב באופן ליניארי תלוי במינון לריכוזים שונים של RA כל-טראנס.
4. Assay RA
   1. לאחר O / N התרבות של צלחת 96-היטב המכיל את עקומות סטנדרטיות שיתוף תרבויות, להסיר את המדיה ולתקן התרבויות על ידי הוספת 100 μl של glutaraldehyde 2.5% (ראה לוח 2) במשך 15 דקות, RT. הסר מקבע ולשטוף פעמיים עם 200 μl 1x PBS, 10 דקות לכל לשטוף.
   2. הסר PBS ולשטוף שלוש פעמים עם 200 μl של פתרון לשטוף LacZ (ראה טבלה 2), 10 דקות לכל לשטוף. במהלך לשטוף השלישי, להכין את הפתרון מכתים X-gal בתוך שפופרת 15 מ"ל עטוף בנייר כסף (ראו טבלה 2). לחשב כמה פתרון מכתים נדרש ולהכין את הכמות המתאימה (200 μl / טוב).
      הערה: פתרון X-gal מכתים הוא רגיש לאור. השתמש הפתרון המכתים בתוך 15 דקות לאחר הכנה.
   3. הכינו תא humidified על ידי הנחת מגבת נייר ספוגה במים מזוקקים לתוך מיכל פלסטיק גדול מספיק כדי להחזיק צלחת 96-היטב. הוסף 200 μl של Xפתרון מכתים -gal לכל טוב של צלחת 96-היטב ומניחים בצלחת בתא humidified.
   4. דגירה בתא humidified המכיל את הצלחת 96-היטב על 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר פיתוח של משקע בצבע כחול. עבור עוברי E8.5, דגירה צלחת O / N (12 - 16 שעות). עבור תרבויות neurosphere, דגירה צלחת 4 - HR 8.
5. קריאה ספיגה ב OD ₆₁₀ והדמיה
   1. לאחר תגובת צבע, להסיר את הפתרון מכתים LacZ ולהחליף עם 200 μl 1x PBS. מדוד את הספיגה ב 610 ננומטר באמצעות קורא צלחת ELISA תקן לכמת את תגובת כתב RA. בארות בודדות תמונה באמצעות סטראו סטנדרטי מצויד במצלמת.

6. subcloning של תאים נדירים-LacZ F9

1. בדיקת F9 נדיר- LacZ rResponse כדי RA
   1. לפני תחילת כל ניסויים, לבחון את התגובה של תאי נדיר- LacZ F9 כדי RA. ג נדיר- LacZ F9 פלייטאמות בצלחת 96-היטב (ראו סעיף 5.1), ולהוסיף 1 ננומטר כל-טרנס החומצה הרטינואית (ראה שלב 5.3). דגירה בתא humidified על 37 מעלות CO / N.
   2. דמיינו פיתוח של משקע בצבע הכחול באמצעות מיקרוסקופ. אם התפתחות הצבע אינו אחיד לאורך כל התאים היטב (ראה איור 1B, משמאל), לבצע subcloning כמפורט להלן.
2. Subcloning של תאים נדירים-LacZ F9
   1. פיצול התאים נדיר- LacZ F9 בתרבית 10 מנות ס"מ כמפורט בשלב 2.2.2. במקום יחס 1:10, צלחת צפיפות זריעה נמוכה של 1 x 10 ⁵ תאים / 10 מ"ל בצלחת 10 ס"מ, כדי לאפשר צמיחה של מושבות מבודדות כגון שכל מושבה עולה מתא בודד F9 נדיר- LacZ.
   2. לאחר יומיים, מעיל צלחת 24 גם עם 500 μl של ג'לטין 0.2% לכל טוב למשך 30 דקות. הסר פתרון ג'לטין ולשטוף בארות פעמיים עם 500 μl מים מזוקקים. חלף מים עם 500 μl של מדיום תרבית תאי F9 נדיר- LacZ.
   3. פיק מושבה באמצעות קצה פיפטה P10 סטרילי ולהעביר לתוך אחד טוב; לעשות פעמים 24 זה כדי לקבל 24 מושבות בודדות. תרבות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 3 - 4 ימים.
   4. פיצול המושבות הבודדות לשתי 24 גם צלחות. אחרי 2 ימים בתרבות, להוסיף 1nM של RA היטב כל אחד צלחת ותרבות 24 גם O / N. בצע מכתים LacZ כמפורט בסעיף 5.4 לבדוק מגיבים גבוהים. דמיין תגובת צבע של כל טוב תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע מגיבים חזקים ואחידים.
   5. פעם מגיב subclone חזק נקבעה, להרחיב את התרבות המקבילה מצלחת 24 גם האחרת. בהמשך להרחבת המושבה בצלחת 10 ס"מ, להקפיא למטה כמה בקבוקונים כמפורט בסעיף 2.3, וזורקים את כל מושבות אחרות.
      הערה: רק כרבע מן המושבות המקוריות לגרום מגיבים גבוהים. בדרך כלל, בסיבוב הראשון של subcloning לא לגרום מכתים LacZ אחיד הסבב הבא של subcloning שצריך לעשות כדילהשיג מגיבים חזקים אחידים.

תוצאות

כתב נדיר- LacZ F9 הוא שורת תאי קרצינומה עוברית חסיד גדלה על פני שטח ג'לטין מצופים. בונת הכתב מאפשרת לתאים להגיב כמותית כדי RA עם אינדוקציה יחסית של-galactosidase בטא. ^11,12,14,18. תאים אלה להציג מורפולוגיה אפיתל (איור 1 א). בגלל קצב ההכפלה הגבוה שלהם, מומלץ כי תאים אלה להתפצל כל 2 - 3 ימים ביחס של 1:10. במהלך עבודתנו עם שורת תאי הכתב הזה, יש לנו ציין כי אפילו עם התוספת של G418 לתוך מדיום התרבות, התגובה של תאים אלה כדי RA מחלישה אחרי קטעים אחדים (איור 1B, משמאל), וזה יכול להשפיע על יכולת כתב שורות התאים. הפסד זה של היענות יכול להיות בגלל אובדן חלקי של transgene ב קטעים מאוחר יותר. כפי subcloning כזה, תקופתי יש צורך להבטיח מגיבים חזקים ואחידים כדי RA (איור1B, מימין).

בעוד שימושים שונים של שורת תאים זו פורסמו בעבר ^12,14-18, דיווחו כאן הוא השימוש שורות התאים כדי למדוד את רמות RA אנדוגני מעוברים E8.5 הפרט עם גנוטיפים שונים. Gpr161 ^{VL / VL} תוצאות מוטצית ירד RA העוברי איתות ^22. כפי שמוצג על ידי שיתוף התרבות של עוברים ניתקים עם תאי F9 נדיר- LacZ, אלה Gpr161 ^{VL / VL} עובר צמצם אנדוגני RA לעומת להמלטת wild-type (איור 2 א). בגלל הרבגוניות של שורת תאי הכתב הזה, דיווח גם כאן הוא שימוש רומן של תאים אלה כדי לזהות רמות RA המיוצרות על ידי תרבויות neurosphere המתקבלות Gpr161 מבוגר עכברי ^{WT / WT} (תרשים 2B). שורת תאי הכתב הזה הצליחה להוכיח כי תרבויות neurosphere מתאי גזע חוט שדרה מבוגרים לייצר RA אנדוגני. ל diff הגדולerence בעוצמה מכתים זו מלמדת על תגובה תא עיתונאי יותר neurospheres חוט השדרה לעומת עוברי E8.5. זה יכול להיות בגלל רמות הרבה יותר RA שנוצרו על ידי neurospheres לאורך זמן לעומת עוברי E8.5, אשר יכול להיות בשל העובדה כי neurosphere תרבויות יותר הומוגנית שאינו עובר בשלב E8.5 ובכך להכיל יותר תאי RA-ייצור.

הוספת ריכוזים שונים של תוצאות ב-RA בתגובה ליניארית-תלוי-מינון של תאי הכתב. תגובה זו יכולה להימדד colorimetrically ידי קריאה הספיגה ב 610 ננומטר. עקומת תקן שנוצר לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לכמת רמות RA בדגימות, כגון בתרבויות neurosphere wild-type (איור 3 א) או עוברים E8.5 (איור 3 ב).

בשימור באיור 1.enance ו subcloning של תאים נדירים-LacZ F9. (א) תמונת שלב ניגודיות של תאים הנדיר-LacZ F9 מוצגת. תאים אלה זמן הכפלה של hr ~ 10 ו יש להעביר כל 3 ימים. (בערך 70 - 80% מפגש) ביחס 01:10 (בוקר) בדיקות תקופתיות של תרבויות עם תוספת של 1 ננומטר ב-RA ו LacZ עוקבות מכתים חייב להיעשות כדי להבטיח תרבויות להישאר מגיבים חזקים ואחידים כדי RA (מימין). במקרה של מגיבים עניים לא אחידים (משמאל), חייבת להתבצע subcloning. סולם bars 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. LacZ הכתמה של שיתוף תרבותי דוגמאות (עוברים E8.5 ניתק / Neurospheres) ו F9 תאים נדיר- LacZ. (א) העובר עכבר E8.5 ים של גנוטיפים שונים היו ניתק מצופה על גבי תאים נדיר- LacZ F9. LacZ מכתים 24 שעות לאחר מכן מאפשר הדמיה של תגובת תאי נדיר- LacZ F9 כדי אנדוגני RA המיוצרים על ידי דגימות שיתוף תרבותי. תוצאות מוטצית ^VL Gpr161 ב- RA אנדוגני ירד כמו דמיינו מההיענות המופחתת של תאי הכתב. (ב) שמאל. תמונת שלב ניגודיות של neurospheres התרבותי מתאי גזע עצביים בחוט השדרה מבוגרים מוצגת. ימין. Neurospheres נגזר מבוגר Gpr161 ^WT חוט שדרה ^{/ WT} היה ניתק מצופה על גבי תאי נדיר- LacZ F9. הנוכחות של המשקע הכחול שבא בעקבות מכתים LacZ להעיד על נוכחות של אנדוגני RA ב neurospheres אלה. ההבדל מכתים בעוצמה בין neurosphere ואת העובר E8.5 שיתוף תרבויות מצביעים רמות גבוהות יותר של ההווה RA ב neurospheres שאינם עוברים בשלב E8.5. סולם bars 100 מיקרומטר.Target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

עקומת סטנדרט דיאגרמה 3. מדד-צבע כימות רמות RA. התגובה של הקו הסלולרי כתב נדיר- LacZ F9 ניתן למדוד colorimetrically ב 610 ננומטר באמצעות קורא צלחת ELISA סטנדרטי. (א) עקומת תקן נציג לכמת רמות RA היחסיות של neurosphere התרבות של wild-type. (ב) כימות של רמות RA ביחס מעוברים E8.5-תרבותי משותף. N = 3; * P <0.05, מבחן t. ברי שגיאה SEM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

סטיתיחוצצי ck / פתרונות	רכיבי	תנאי אחסון
10% מונוהידראט deoxycholate נתרן (C 24 H 39 נאו 4 · H 2 O)	10 מ"ל ב 100 מ"ל DH 2 O	4 ºC
1 מגנזיום כלוריד M (MgCl 2)		RT
100x פרוציאני אשלגן (K 4 [Fe (CN) 6] · 3H 6 O)	2.12 גרם ב 10 מ"ל DH 2 O	RT בחושך
100x אשלגן ferricyanide (K 3 [Fe (CN) 6])	1.64 גרם ב 10 מ"ל DH 2 O	RT בחושך
20 מ"ג / מ"ל ​​X-gal (5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-β-ד-galactopyranoside)	להוסיף לפוראמיד דימתיל 5 מ"ל לעשות 20 מ"ג / מ"ל ​​פתרון המניות	-20 ºC
10 מ"מ (3 מ"ג / מ"ל) כל-TRans החומצה הרטינואית	ממיסים 50 מ"ג ב 16.67 מ"ל אתנול אבסולוטי. הכן 1 aliquots מ"ל.	-80 ºC בחושך, צינורות microcentrifuge 1.5 מ"ל ענבר
פפאין	לפזר בקבוקון אחד ב -7 מ"ל HBSS	4 ºC

טבלה 1. חוצצי פתרון יצירות.

עבודת חוצצים / פתרונות	רכיבי	תנאי אחסון
מדיום רייר-LacZ תרבית תאים F9	50 מ"ל סרום שור עובר (FBS) (ריכוז סופי 10%)	מסנן לעקר.
	5 מ"ל סטרפטומיצין פניצילין 100x (סופי קונצרט כלשהו 1X)	חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
	4מ"ל 50 מ"ג / מ"ל ​​G418 (סופי קונצרט כלשהו 0.4 מ"ג / מ"ל)
	500 מ"ל DMEM / F-12 (עם L- גלוטמין ו HEPES)
0.2% ג'לטין	25 מ"ל 2.0% ג'לטין	חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
	מים 80 מ"ל מזוקקים
	לערבב היטב
אתנול 70%	אתנול 30 מ"ל 95%	מניחים בתוך בקבוק תרסיס.
	מים 70 מ"ל מזוקקים	חנות ב RT
בינוני דיסוציאציה neurosphere	1 מ"ל 20U פפאין	להכין טרי בכל פעם
	100 μl 13 מ"ג / מ"ל ​​טריפסין
	100 μl 7 מ"ג / מ"ל ​​חומצה היאלורונית
	28 μl 10 מ"ג / מ"ל ​​DNaseI
	50 μl 4mg / חומצה kynurenic מ"ל
מדיום תרבות neurosphere	DMEM / F-12 (עם L- גלוטמין ו HEPES)	להכין טרי בכל פעם
	2% B-27 תוספת
	20 גורם גדילה פיברובלסטים ng / ml (FGF)
	20ng גורם הגדילה באפידרמיס (EGF)
2.5% glutaraldehyde	250 μl 50% glutaraldehyde	להכין טרי בכל פעם
	4750 μl 1x PBS
פתרון לשטוף LacZ	0.5 מ"ל 10% deoxycholate (קונצרט כלשהו 0.1% הסופי)	חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
	1.0 מ"ל 100% NP-40 (סופי קונצרט כלשהו 0.2%)
	50 מ"ל 10X PBS
	מים מזוקקים 500 מ"ל
X-gal פתרון מכתים	פרוציאני אשלגן 1x	להכין טרי בכל פעם
	אשלגן 1x ferricyanide
	1 מ"ג / מ"ל ​​X-gal
	נפח המתאים באמצעות פתרון לשטוף LacZ
בינוני הקפאת נדיר- LacZ F9	F9 בינוני תרבות נדיר- LacZ + DMSO 5%	להכין טרי בכל פעם

טבלה 2. חוצצים מדי עבודה יצירות פתרון.

Discussion

השורה תא F9 נדיר- LacZ ¹⁴ היא מערכת רבת עוצמה, שניתן להשתמש בהם לצורך זיהוי של RA המיוצר על ידי explants רקמות ^12,14,17,18. הוא רגיש לריכוזי RA נמוכים כמו 100 FM, ללא תגובה שאינה ספציפית זוהתה בתאים שלא טופלו עם ^12,14,18 RA. יתר על כן, תאי הכתב להגיב לכל-trans RA באופן ליניארי בטווח מסוים של ריכוז, ובכך מאפשרים את תגובת LacZ להיות לכמת המשמשת לקביעת עוצמת רמות RA ^12,14,18. את assay כתב RA הקל והמהיר המוצג כאן מנצל את שורת תאי כתב נדיר- LacZ F9 להדמיה (איור 2) ומדידת כמותית יחסית (איור 3) של עוברים ותאי גזע עצבי מבוגרים תרבותי. מערכת הכתב הזה מאפשר השוואה של רמות RA אנדוגני בין דגימות בודדות, כפי שמוצג באיור 2. הוא רגיש מספיק כדי להיות מסוגל לזהות RAשנוצר על ידי עוברי E8.5 בודדים (איור 2 א) וכן RA המיוצרים על ידי neurospheres התרבותי (איור 2 ב). התגובה תלויה במינון של שורות התאים כדי ריכוזים שונים של RA מאפשרת כימות של רמות RA (איור 3 א) בדגימות וכן השוואה של רמות היחסיות RA בין הדגימות (איור 3 ב). חשוב לציין כי הקו הסלולרי כתב F9 RARE מודד את הסכום הכולל של RA שנוצר על ידי דגימות הרקמה לאורך זמן דגירה. זה שווה המאזן הנטו של סינתזת RA ו פירוק.

בעוד מערכת כתב נדיר- LacZ תא F9 רגישה מאוד תכליתי, ישנם מספר צעדים לפתרון בעיות קריטיים שאנחנו נשלב כדי להבטיח את האמינות של מערכת זו. ראשית, כפי שמוצג באיור 1, חשוב לשמור על הבריאות של תאים אלה על ידי קטעים רגילים בלי לתת להם גרמולחתור אל confluency. שנית, ראינו מאוחר יותר קטעים נוטים לגרום לתגובות RA עולות בקנה אחד, גם אם התרבויות נשמרות כל זמן תחת בחירה עם G418. כדי לפתור בעיה זו, מומלץ להשליך תרבויות אחרי 20 קטעים להפשיר בקבוקון חדש. בנוסף, חייבות להתבצע בדיקות תקופתיות על מנת להבטיח כי תאי הכתב עדיין המגיבים חזק לנוכחות של RA בתקשורת. שלישית, אם הקטעים הראשונים להציג תגובה ירודה או לא אחידה כדי RA (איור 1B, משמאל), אחד או מספר סבבי subcloning עשוי להיות נחוץ עד מגיבים חזקים מתקבלים (האיור 1B, righ t). לבסוף, לפני התרבות משותפת, מומלץ כי דגימות רקמה כגון עובר neurospheres הם ניתקים תאים בודדים. ראינו דיסוציאציה כי תוצאות הדגימות במדידות colorimetric עקביות יותר. זה יכול להיות בגלל חלוקה אף יותר של RA בבארות התרבות, כמו התאים הניתקים נמצאים חדטופס יצירת קשר עם תאי הכתב.

מספר שינויים נעשו גם הפרוטוקול המקורי ^14. ראשית, תגובת RA של התאים הנדיר-LacZ F9 כומתו על ידי תיקון התאים ומדידת ספיגה ישירות ב 610 ננומטר במקום איסוף תאים וניתוח lysate לפעילות ב-galactosidase ^14. שינוי נוסף הוא שיתוף התרבות הישירה של דגימות ניתקו עם F9 נדיר- LacZ לפני כימות בתגובת RA. שיטות קודמות דיווחו culturing דגימות בנפרד והוספה רק תקשורת מתרבויות אלה F9 נדיר- LacZ ^16,18.

למרות היותה מערכת עוצמה, assay הכתב נדיר- LacZ F9 יש מספר מגבלות. מגבלה אחת של שורת תאים הכתב הזה הוא כי על אף שהוא מגיב חזק בנוכחות כל-trans RA, זה גם מגיב איזומרים החומצה הרטינואית אחרים כולל 9-cis-RA ו -13-cis-RA; עם זאת, הם פי 100 יותר רגישים לכל-trans RA compaאדום איזומרים האחר ^18. מגבלה נוספת למערכת זו היא שהתגובה ליניארי תלוי במינון נופלת רק בין 10 ^-13 M 10 ^-7 M ב-RA ^14,18; וכך, אם משווים רמות RA מחוץ לגבולות אלה, ייתכן שיהיה צורך לבצע דילול סדרתי של המדגם עד המדידות ליפול בטווח ליניארי. לבסוף, שכן מדובר assay colorimetric בעיקר, נקודת הסיום של התפתחות צבע ינוע בין דגימות וניסויים. לפיכך, חשוב כי עקומת סטנדרט תמיד להיות מצופית במקביל עבור כל ניסוי יחיד כדי להשתמש בו עבור כימות של תגובת תא כתב.

לסיכום, יש לנו דיווח השימוש של הקו הסלולרי הכתב F9 נדיר- LacZ RA כדי למדוד את רמות RA כמותית בעוברים E8.5 ו, בעבר שלא דווחו מבוסס, neurospheres. הרבגוניות של מערכת הכתב הזה עשויה לאפשר כימות של רמות RA כמעט לכל סוג תא או רקמה, ו- mאיים לגרום להתפתחות של יישומים מגוונים בעתיד.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C3H/HeSn-Gpr161vl/J mouse strain	Jackson Laboratory	000316
F9 RARE-LacZ reporter cell line			from Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia)
DMEM/F-12 (with L-glutamine and HEPES)	ThermoFisher Scientific	11330-057
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified	ThermoFisher Scientific	26140-079	Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm in 37 °C for media preparation
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122	Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; light-sensitive
G418	ThermoFisher Scientific	10131-027	Store at 4 °C; light-sensitive
2% Gelatin	Sigma Aldrich	G1393	Store at 4 °C
B-27 supplement (2 % stock solution)	ThermoFisher Scientific	17504-044	Store at -20 °C in 1-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm at room temperature for media preparation
Murine Epidermal Growth Factor (EGF)	PeproTech	315-09	Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1xPBS; prepare working concentrations by diluting with 1x PBS; store at -20 °C
Murine Fibroblast Growth Factor (FGF)-basic	PeproTech	450-33	Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1x PBS; prepare working concentrations by diluting with 1x PBS; store at -20 °C
50% glutaraldehyde	Amresco	M155	Store at 4 °C
Sodium deoxycholate monohydrate (C24H39NaO4 · H2O)	Sigma Aldrich	D5670	Store at RT
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside)	Promega	V3941	Store stock at -20 °C
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	41639	Store at RT
all-trans Retinoic Acid (at-RA)	Sigma Aldrich	R-2625	Store 1 ml aliquots of stock in -80 °C; extremely sensitive to light
TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12605-010	Store at RT
0.25% trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific	25200-056	alternative to TrypLE Express; aliquot and store at -20 °C
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	ThermoFisher Scientific	14170-112	Store at 4 °C
10x phosphate buffered solution (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010-023	Store at 4 °C
Papain	Worthington	LK003176	Store at 4 °C.
Trypsin	Worthington	LS003703	Store in 1 ml aliquots at -20 °C.
Hyaluronic acid	Calbiochem	385908	Store 200 μl aliquots at -20 °C.
DNaseI	Worthington	LS002139	Store in 200 μl aliquots at -20 °C
Kynurenic acid	Sigma Aldrich	K3375	Store in 200 μl aliquots at -20 °C
95% ethanol
Mr. Frosty Freezing container	ThermoFisher Scientific	5100-0001
10 cm culture dish (non-cell culture treated)
10 cm culture dish (cell culture treated)
6 cm culture dish (non-cell culture treated)
96-well cell culture plates
1.5 ml microcentrifuge tubes
1.5 ml amber microcentrifuge tubes
1.5 ml cryovials
37 °C water bath
surgical scissors
fine surgical scissors
no. 5 forceps
blunt-ended forceps
scalpel blade
glass pasteur pipettes
cotton
alcohol lamp
ELISA plate reader
stereomicroscope