Количественное измерение относительных уровней ретиноевой кислоты в E8.5 эмбрионы и нейросфера культур Использование F9 RARE-LacZ клеток на основе Reporter Assay

Резюме

Methods to accurately measure retinoic acid (RA) levels in small amounts of tissue do not exist. This protocol describes the easy, quantitative measurement of relative RA levels in E8.5 embryos and neurospheres using an RA reporter cell line.

Аннотация

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, neurogenesis, patterning of the hindbrain and spinal cord, and the development of multiple organ systems. Due to its chemical nature as a small amphipathic lipid, direct detection and visualization of RA histologically remains technically impossible. Currently, methods used to infer the presence and localization of RA make use of reporter systems that detect the biological activity of RA. Most established reporter systems, both transgenic mice and cell lines, make use of the highly potent RA response element (RARE) upstream of the RAR-beta gene to drive RA-inducible expression of reporter genes, such as beta-galactosidase or luciferase. The transgenic RARE-LacZ mouse is useful in visualizing spatiotemporal changes in RA signaling especially during embryonic development. However, it does not directly measure overall RA levels. As a reporter system, the F9 RARE-LacZ cell line can be used in a variety of ways, from simple detection of RA to quantitative measurements of RA levels in tissue explants. Here we describe the quantitative determination of relative RA levels generated in embryos and neurosphere cultures using the F9 RARE-LacZ reporter cell line.

Введение

Ретиноевой кислоты (RA) является метаболитом производное ретинола или витамина А и производится путем последовательной активности некоторых клеточных дегидрогеназ ^1. Из - за своей амфипатической химической природы, он легко проникает через липидные мембраны и может выступать в качестве растворимого фактора морфогенетического ^1. Это существенная молекула , которая регулирует многочисленные развития и взрослых клеточные процессы, действуя в качестве лиганда для ядерных рецепторов ретиноидов и активируя экспрессию генов ^2-10. Без РА, эти рецепторы RA (РАКС) связывают Rares в ДНК и действуют как репрессоры; РА связывание с этими рецепторами , превращает их в транскрипционных активаторов приводит к экспрессии гена - мишени ^1,5,6.

Хотя передача сигналов RA путь хорошо характеризуется, небольшой размер (~ 300 Да) и амфипатической природы РА делает прямой гистологическую визуализацию и измерение RA в настоящее время технически неосуществимой ^11. Способ только для режECT измерение уровней РА путем изоляции РА из образцов ткани , с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) ^11. Этот метод , как правило , требует большого количества ткани, облегченные за счет объединения различных образцов ^12. Таким образом, эта техника плохо подходит для измерения уровней РА у отдельных эмбрионов или небольших количеств проб / ткани.

Для того чтобы исследовать клеточную функцию RA, несколько методов были разработаны, чтобы косвенно сделать вывод о наличии RA. Эти методы используют репортерных систем , содержащих высокочувствительную RAR-бета РЕДКИЙ вождения экспрессию бета-галактозидазы или люциферазы ^11,13,14. Трансгенные RARE-LacZ репортер мыши генерируется Rossant и др. , ¹³ является идеальной системой для визуализации пространственно - временные области передачи сигналов RA на месте ^11,13,15,16 , но не подходит для количественных измерений. F9 клеточная линия RARE-LacZ ^14, по тон с другой стороны, является полезным для выявления РА и количественных измерений уровней RA в ткани эксплантов ^{11,12,14,17,18.}

Тератокарциномы клетки F9 выразить эндогенный альфа-, бета- и гамма-рецепторов ретиноевой кислоты ^19, и инициировать дифференцировку в теменной энтодермы после воздействия RA ^19-21. Клетки F9 уже давно был создан в качестве модели для RA-индуцированной клеточной дифференцировки, поэтому она была выбрана в качестве идеальной линии клеток Для анализа репортера РА. F9 происхождения репортер клеточная линия Sil-15 RA порождена Вагнера и др. ¹⁴ содержит Е. coli'LacZ гена вниз по течению одной копии 64 п.н. ретиноевой элемент ответа кислоты (RARE) из (RAR-бета) гена рецептора человеческого бета-ретиноевой кислоты. Для того чтобы выбрать и сохранить стабильные клоны, конструкция также содержит ген аминогликозидфосфотрансферазы (ОКО ^г) в качестве селективного маркера в присутствии G418. Эта конструкция соnfers индуцируемой экспрессии б-галактозидазы в присутствии RA, которые могут быть визуализированы с помощью LacZ окрашивания и этот ответ может быть впоследствии количественно с использованием колориметрических методов ^11,12,14,18.

Это чрезвычайно универсальный линия репортер клеток широко используется в обнаружении эндогенной продукции РА посредством совместного культивирования образцов тканей с репортером клетками, такими как кохлеарная ¹⁷ и эмбриональных эксплантов ¹⁴ плиты пола. Кроме того, этот репортер линия была использована для количественной оценки уровней RA в развивающемся спинном мозге при культивировании объединенных участков эмбриональных спинного мозга отдельно и добавление кондиционированной среды от этих культур до F9 RARE-LacZ клеток ^18. Их количественную оценку проводили после LacZ окрашивания с помощью колориметрического чтения с помощью стандартной ELISA планшет - ридер ^11,12,18. И, наконец, эта клеточная линия репортер был использован в обнаружении присутствия ферментов метаболизма РА по Мониторинговойнг изменения в уровнях RA ^12,18.

Мы сообщаем, что чувствительность этой клеточной линии репортер также позволяет для измерения уровней RA, полученных от отдельных сокультивируют E8.5 эмбрионов. Это дает возможность сравнения между отдельными эмбрионами различных генотипов. В качестве конкретного примера, Gpr161 сирота GPCR , который регулирует нейруляция частично через путь ²² передачи сигналов RA, и мы сообщаем , используя этот репортер клеточную линию , чтобы исследовать влияние рецессивных мутаций в Gpr161 (Gpr161 ^Вл) на общие уровни RA в эмбрион. В дополнение к этому, универсальность и простоту использования этого репортера системы позволяет свободу измерять и сравнивать уровни RA в различных образцах тканей, даже в нейросфера культурах, полученных от взрослых спинного мозга стволовых клеток. Здесь мы опишем количественное определение относительных уровней RA у эмбрионов и нейросфера культур посредством прямого совместного культивирования с F9 редко- LacZ повторении РАклеточная линия orter.

протокол

Все для животных работа была выполнена в соответствии с утвержденными методами Rutgers-RWJMS IACUC.

1. Решение и средств массовой информации Подготовка

1. Подготовка запасов и буферных растворов в соответствии с таблицей 1. Подготовка рабочих растворов в соответствии с таблицей 2.

2. Культура и обслуживание F9 RARE-LacZ клеток

1. Размораживание Замороженные клетки
   1. Подготовка F9 RARE-LacZ среда для культивирования клеток , как указано в таблице 2.
   2. Coat 10 см чашках культуры (культур клеток лечение) с 10 мл 0,2% желатина (см таблицу 2) в течение 30 мин при комнатной температуре. Смыть избыток желатина с двумя полосканий по 10 мл дистиллированной воды. Немедленно добавьте 9 мл РЕДКОГО-F9 LacZ среду для культивирования клеток в колбу для предотвращения желатина из сушки.
   3. Оттепель флакон F9 RARE-LacZ клеток ¹⁴ в 37 ° С на водяной бане в течение 2 - 3 мин. Пластина клеток (около 1 × 10 ⁶ клеток / мл) в блюдо с покрытием Containing 9 мл культуральной среды. Культура при 37 ° С в атмосфере 5% СО _2. Изменение среды на следующий день.
2. Обслуживание F9 RARE-LacZ клеток
   1. Поддерживать регулярный проход через каждые 2 - 3 дней в соотношении 1:10.
      Примечание: Не позволяйте клетки растут в сплошности, так как это приведет к их дифференциации.
   2. Разделение культур на сплошности 80-90%. Извлеките носитель и промыть клетки с 10 мл 1х фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Удалите PBS и добавьте 1 мл трипсина, инкубировать в течение 5 мин. Добавить 9 мл культуральной среды, пипеткой вверх и вниз и разделить ячейки 1:10 для прохода.
3. Замораживание F9 RARE-LacZ клетки
   1. Trypsinize 10 см блюдо, содержащее RARE-F9 LacZ клетки на 80 - 90% слияния, как описано в пункте 2.2.2. Передача диссоциированных клеток в 15 мл центрифужную пробирку и спина при 200g в течение 5 мин.
   2. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл F9-LacZ РЕДКОМ Freezing среды (таблица 2). Алиготе 1 мл в маркированные криопробирок и передачи флаконов в контейнеры замораживания. Поместите контейнер в замораживании -80 ° C морозильника O / N и передачи флаконов в жидких резервуарах азота на следующий день.

3. Вскрытие E8.5 Эмбрионы

1. Спаривание Кейдж Установка и штепсельной вилки Проверить
   1. Настройка матовую клетку, содержащую одну сопрягаемую пару. Утром следующего дня, проверить на наличие вагинальной пробки и назначить день плагин находится как день 0,5 ^23. В день E8.5, урожай эмбрионов.
2. Вскрытие Эмбрионы
   1. Жертвоприношение дамбу через цервикальной дислокацией и распылить брюшной области с 70% этанола (таблица 2). Сделайте поперечный разрез на коже выше живота с помощью хирургических ножниц и вытащить две створки друг от друга (передний и задний), чтобы выставить брюшной области. Сделать подобный разрезна брюшине, чтобы обнажить живот.
   2. Найдите матках и освободить маток из яйцеводов и mesometrium с помощью пары ножниц ^23. Поместите матках в 6 см блюдо (без клеточной культуре, обработанной) с 10 мл 1x PBS, чтобы смыть лишний жир и кровь. Переезд в другой 6 см чашку, содержащую свежие 10 мл 1x PBS.
   3. Отдельная одна матка, содержащая один эмбрион путем разрезания его с помощью хирургических ножниц. Удалить матку и децидуальной и освободить желтка, содержащие эмбрион, используя две пары нет. 5 щипцов ^23.
   4. Отделить желтка из эмбриона, и передать желтка в пробирку микроцентрифужных 1,5 мл для экстракции геномной ДНК, которые будут использоваться для генотипирования. Используйте P20 пипетки с наконечником с широким отверстием, передать весь эмбрион в 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую 10 мкл трипсина. Поместите пробирку на льду.
   5. Повторите шаги 3.2.3 - 3.2.4, пока все эмбрионы были расчленены.
3. Эмбрион диссоциация
   1. Инкубируйте 1,5 мл пробирки, содержащие зародыши в трипсин при 37 ° С в течение 5 мин, чтобы облегчить ферментативной диссоциации.
      1. Triturate осторожно с помощью P20 дозаторов для механической диссоциации зародыша, и пластины весь объем 10 мкл, содержащем один диссоциированного эмбрион через одну лунку F9 RARE-LacZ клеток в 96-луночный планшет (см шаг 5.1 для металлизации клеток F9, RARE-LacZ в 96-луночный планшет). Культура O / N при температуре 37 ° С и 5% СО _2.

4. Ламинэктомия, Препарирование взрослых поясничного отдела спинного мозга и нейросфера Культура

1. ламинэктомия
   1. Жертвоприношение взрослого (P60) мыши через цервикальной дислокации.
   2. Спрей спинной стороне с 70% этанола и сделать поперечный разрез, используя хирургические ножницы. Вытяните обе створки (передний и задний) друг от друга, чтобы обнажить спину и позвоночный столб.
   3. Используя хирургические ножницы, отрежьте мышцы, покрывающих позвоночник.Найдите поясничную область спинного мозга, ниже ребер. Используя ножницы, сделайте глубокий надрез, чтобы разорвать позвоночник в этой точке, чтобы выставить спинной мозг.
   4. Потяните вверх поясничной области позвоночника без какой. 5 щипцов так, что обнаженный поперечное сечение спинного мозга сталкивается экспериментатору. Используя кончики тонких ножниц, отрежьте позвонки и мышцы на 3-часовой и 9 часов позиций открытого конца. Возьмитесь за спинной лоскут разрезанной позвонка с пинцетом. Продолжить эти разрезы в каудальном направлении до тех пор, длина поясничного отдела спинного мозга не подвергается.
   5. Отпустите спинной мозг из позвонков, используя нет. 5, а также с тупыми концами пинцета. Перенести спинной мозг в 15 мл пробирку, содержащую 3 мл DMEM / F12 культуральной среды. Держать на льду, пока все поясничный спинной мозг не был выделен.
2. Рассечение спинного мозга
   1. Налейте культуральную среду со спинным мозгом в 6 см чашку (не культура клеток лечение).
   2. Под стереомикроскопа, удалить ганглии задних корешков и кровеносных сосудов вокруг сегмента спинного мозга, захватив ганглиях и кровеносные сосуды, используя две пары нет. 5 щипцами и осторожно потянув их подальше от спинного мозга. Перенести сегмент спинного мозга на 6 см блюдо, без среды и фарша мелко ткани, используя лезвие скальпеля.
   3. Передача измельченной ткани в 15 мл пробирку , содержащую 1 мл нейросфера диссоциации сред (смотри таблицу 2). Поместите пробирку на льду и повторите шаги 4.2.1 - 4.2.2, пока все спинной мозг не будут обработаны.
   4. Выдержите в пробирки, содержащие измельченной ткани в среде диссоциации при 37 ° С в течение 10 мин, вылить трубку на стороне, чтобы перемешать, а затем инкубируют при 37 ° С в течение еще 10 мин. После ферментативного расщепления, тритурата с пожарными полировкой пипеток уменьшающегося диаметра для механической диссоциации.
      Примечание: Подготовка огневой полировкой пипетки уменьшения диаметра до выполнения экспериментов. Возьмите стакан Пастерапипетка и подключите широкий конец с чистого хлопка. Используя лампу алкоголя, огонь польский кончики пипеток в пламени, чтобы создать различные диаметры: "обычный", "отлично" и "очень тонкий". Для "обычных" полированных пипеток, закрутить конец пипетки в пламени к раунду краев без уменьшения диаметра (~ 1 мм). Поверните конец пипетки в пламени для несколько более длительных периодов для создания "тонкой" (~> 1 мм и> 5 мм в диаметре) и "дополнительный штраф" (~ 0,5 мм) полированный пипеток. Не используйте пипетки с диаметром менее 0,5 мм.
3. нейросфера Культура
   1. Спином вниз трубки, содержащие диссоциированных ткани спинного мозга при 200g в течение 10 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл культуральной среды нейросфера (смотри таблицу 2). Растирают с P1,000 пипетку с последующим P200 пипеткой для облегчения диссоциации.
      Примечание: Избегайте введения пузырьков,что уменьшит жизнеспособность клеток.
   2. Перенесите 10 мкл диссоциированных клеток в гемоцитометра и получить количество клеток. Пластина клеток при плотности 1x10 ^5/10 мл в колбы Т25 с 10 мл культуральной среды нейросфера. Инкубировать при 37 ° С и 5% СО ₂ в течение 7 дней , пока не появятся нейросферы ^24.
4. нейросфера диссоциация
   1. Соберите нейросфера культуру и передать в 15 мл пробирки. Спин при 200g в течение 10 мин. Удалите большую часть надосадочной жидкости оставляя 1 мл позади. Растирают с P1,000 пипеткой ресуспендируют осадок клеток и диссоциируются нейросферы на отдельные клетки. Передача 10 мкл диссоциированных клеток в гемоцитометра и получить количество клеток.
   2. Пластина 1 х 10 ⁵ клеток диссоциированных нейросфера над одной из лунок F9 RARE-LacZ в 96-луночного планшета (смотри раздел 5.1 для обшивки F9 редко- LacZ в 96-луночного планшета). Пластина 3 лунки в повторах. Культура O / N при температуре 37 ° С и 5% СО _2.

5. Р. Количественный анализ E8.5 эмбрионы и спинного мозга нейросферах

1. Покрытие F9 RARE-LacZ , в 96-луночный планшет
   1. За один день до сбора урожая E8.5 эмбрионов или диссоциации нейросферах, пальто 96-луночного планшета со 100 мкл 0,2% желатина на лунку в течение 30 мин при комнатной температуре. Отберите из желатина и прополоскать дважды 200 мкл дистиллированной воды.
   2. Trypsinize F9 RARE-LacZ клетки поддерживают в 10 см чашки, как описано в пункте 2.2.2. Пластина 1 х 10 ⁵ клеток / лунку F9-RARE LacZ клетки, но на этот раз с использованием культуральной среды без G418.
   3. Подготовьте достаточное количество скважин для совместного культивирования эмбрионов (~ 12 - 20, в зависимости от размера помета), нейросферах (3 скважины / генотип), а также для стандартной кривой в трех экземплярах (27 лунок).
2. Совместное культивирование F9 RARE-LacZ и E8.5 эмбрионах или спинномозговой нейросферах
   1. Урожай эмбрионов, как подробно описано в разделе 3.2 и пластины на верхней части F9RARE-LacZ, в 96-луночный планшет из раздела 5.1. Аналогичным образом, диссоциируют нейросферы и пластины на вершине F9 RARE-LacZ в 96-луночный планшет, как подробно описано в шаге 4.4. Культура O / N при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
3. Генерация стандартной кривой ,
   1. Для получения стандартной кривой, подготовить все-транс-ретиноевой (ат-РА) решения со следующими концентрациями: 100 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 100 мкМ, 10 мкМ, 1 мкМ, 100 Fm, последовательным разбавлением атмо- акций РА (таблица 1) с RARE-F9 LacZ культуральной среды.
   2. Добавьте 100 мкл этих различных в РА концентрациях F9 RARE-LacZ клеток из раздела 5.1. Назначают лунки, содержащие необработанный f9 RARE-LacZ клеток в качестве отрицательного контроля. Готовят трехкратном повторе каждой концентрации RA и отрицательных контрольных лунках. Культура O / N при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
      Примечание: F9 RARE-LacZ клетки реагируют в зависимости от дозы линейно до различных концентраций полностью транс-RA.
4. Анализ Р.А.
   1. После того, как O / N культуры 96-луночного планшета , содержащую стандартные кривые и сопутствующих культур, удалить СМИ и исправить культуры путем добавления 100 мкл 2,5% глутаральдегида (смотри таблицу 2) в течение 15 мин, RT. Удалите закрепитель и дважды промывают 200 мкл 1x PBS, 10 мин на каждую промывку.
   2. Удалить PBS и мыть три раза 200 мкл промывочного раствора , LacZ (смотри Таблицу 2), 10 мин на промывку. В ходе третьей промывки, готовят раствор окрашивания X-Gal в 15 мл пробирку , завернутого в фольгу (смотри таблицу 2). Подсчитайте, сколько окрашивание раствора необходимо, и подготовить соответствующее количество (200 мкл / лунку).
      Примечание: X-гал окрашивания раствор чувствителен к свету. Используйте окрашивание раствора в течение 15 мин после приготовления.
   3. Подготовьте увлажненной камере путем размещения бумажное полотенце, смоченную дистиллированной водой в пластиковый контейнер, достаточно большой, чтобы провести 96-луночного планшета. Добавить 200 мкл X-Gal красящий раствор на лунку 96-луночного планшета и поместите пластину в увлажненной камере.
   4. Выдержите в увлажненной камере, содержащей 96-луночный планшет при 37 ° С, чтобы обеспечить развитие синего цвета осадка. Для E8.5 эмбрионов, инкубировать пластина O / N (12 - 16 ч). Для нейросфера культур, инкубируйте в течение 4 - 8 часов.
5. Чтение Absorbance при OD ₆₁₀ и обработки изображений
   1. После того, как цветной реакции, удаления раствора LacZ окрашивания и заменить 200 мкл 1x PBS. Измерьте оптическую плотность при 610 нм с использованием стандартного считывали для количественной оценки ответа репортер RA. Изображение отдельные скважины с использованием стандартного стереомикроскопа, снабженного камерой.

6. Субклонирование F9 RARE-LacZ клеток

1. Проверка F9 редко- LacZ rResponse в РА
   1. Перед началом каких-либо экспериментов, проверить реакцию F9 RARE-LacZ клеток в РА. Пластина F9 RARE-LacZ гргезов в 96-луночный планшет (смотри раздел 5.1), и добавить 1 нМ полностью-транс-ретиноевой кислоты (этап 5.3). Инкубируйте в увлажненной камере при 37 ° CO / N.
   2. Визуализируйте развитие синего цвета осадка с помощью микроскопа. Если развитие цвет не является равномерным по всей клетки в скважине (см Рисунок 1В, слева), выполняют субклонирования подробно описаны ниже.
2. Субклонирование F9 RARE-LacZ клеток
   1. Сплит-F9 RARE LacZ клетки культивировали в 10 см чашки, как описано в пункте 2.2.2. Вместо того , чтобы в соотношении 1:10, плиты низкой плотности засева 1 × 10 ⁵ клеток / 10 мл в 10 см чашку , чтобы обеспечить рост изолированных колоний таким образом, что каждая колония возникает из одного RARE-F9 LacZ клетки.
   2. Через два дня, пальто 24-луночный планшет с 500 мкл 0,2% желатина на лунку в течение 30 мин. Удалить желатиновый раствор и промойте лунки дважды 500 мкл дистиллированной воды. Заменить воду с 500 мкл-F9 РЕДКОГО LacZ клеточной культуральной среды.
   3. Выберите колонию, используя стерильный наконечник пипетки P10 и передачи в одну лунку; сделать это 24 раз, чтобы получить 24 отдельных колоний. Культура при 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ в течение 3 - 4 дней.
   4. Разделение отдельных колоний на два 24-луночных планшетах. После 2-х дней в культуре, добавить 1Nm РА в каждую лунку одной пластины и культуры 24-луночного O / N. Выполните LacZ окрашивания, как описано в разделе 5.4, чтобы проверить на высоких ответчиков. Визуализируйте цвет реакции в каждую лунку под микроскопом, чтобы определить сильные и единые ответные меры.
   5. После того, как сильный подклон Ответчик определяется, расширить соответствующую культуру от другой 24-луночный планшет. Далее расширить эту колонию в 10 см блюдо, заморозить вниз несколько чаш, как описано в разделе 2.3, и отбросить все другие колонии.
      Примечание: Только около одной четверти из первоначальных колоний приводят к высоким ответчиков. Как правило, первый раунд субклонирования не приводит к равномерной LacZ окрашивания и последующего раунда субклонирования должно быть сделано, чтобыдостижения единых сильных ответчиков.

Результаты

RARE-F9 LacZ репортер является приверженцем линия эмбриональных клеток карциномы, выращенных на желатин покрытием поверхности. Конструкт репортер позволяет клеткам количественно реагировать на RA с пропорциональным индукцию бета-галактозидазы. ^11,12,14,18. Эти клетки проявляют эпителиальной морфологии (рис 1А). Из-за их высокой скорости удвоения, рекомендуется, чтобы эти клетки можно разделить каждые 2 - 3 суток при соотношении 1:10. В процессе работы с этой клеточной линии репортер, мы наблюдали , что даже с добавлением G418 в культуральную среду, реакция этих клеток RA ослабевает после того, как несколько проходов (рисунок 1В, слева), и это может повлиять на способность репортер эта клеточная линия. Эта потеря отклика может быть связано с частичной потерей трансгена на более поздних пассажах. Таким образом , периодическая субклонирования необходимо обеспечить сильные и единые ответные меры РА (рис1В, справа).

В то время как различные виды использования этой клеточной линии была ранее опубликована ^12,14-18, сообщается здесь , является использование этой клеточной линии для измерения уровней эндогенного РА из отдельных E8.5 эмбрионов с различными генотипами. Результаты Gpr161 ^{VL / VL} мутация уменьшилось эмбриональных RA сигнализации ^22. Как показывает совместное культивирование диссоциированных эмбрионов клавишей F9 RARE-LacZ клетки, эти Gpr161 ^{VL / VL} эмбрионов уменьшили эндогенную RA по сравнению с однопометниками дикого типа (Рисунок 2А). Из - за универсальности этой клеточной линии репортер, также сообщалось здесь , является новое применение этих клеток для определения уровней RA , производимые нейросфера культур , полученных из взрослых Gpr161 ^{вес / вес} мышей (Фигура 2В). Этот репортер клеточная линия была в состоянии продемонстрировать, что нейросфера культуры от взрослых спинного мозга стволовые клетки производят эндогенной RA. Большая разницаразностная в интенсивности окрашивания указывает на большую ответную реакцию репортера клеток спинного мозга нейросферах по сравнению с E8.5 эмбрионов. Это может быть из-за значительно более высоких уровней RA, порожденные нейросферах с течением времени по сравнению с E8.5 эмбрионов, что может быть связано с тем, что нейросфера культуры более однородны, чем E8.5 эмбрионов и, таким образом, содержат больше RA-продуцирующие клетки.

Добавление различных концентраций при РА приводит к зависимому от дозы линейного отклика репортерных клеток. Эта характеристика может быть измерена колориметрически путем считывания оптической плотности при длине волны 610 нм. Сгенерированный стандартная кривая затем может быть использована для количественного определения уровней RA в образцах, таких как в нейросфера культурах дикого типа (рис 3А) или E8.5 эмбрионов (рис 3б).

Рисунок 1. Maintenance и Субклонирование F9 RARE-LacZ клеток. (A) фазового контраста изображения F9 RARE-LacZ клеток показано. Эти клетки имеют время удвоения ~ 10 часов и должны быть переданы через каждые 3 дня. (Примерно 70 - 80% сплошности) в соотношении 1:10 (В) периодическое тестирование культур с добавлением 1 нМ ат-RA и последующим LacZ окрашивание должно быть сделано для обеспечения культуры остаются сильными и равномерные ответчиков к RA (справа). В случае бедных и неравномерных ответчиков (слева), субклонирования должны быть выполнены. Шкала баров 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. LacZ Окрашивание сокультивируют Образцы (Диссошиэйтед E8.5 эмбрионы / нейросферах) и F9 RARE-LacZ клетки. (А) эмбриона мыши E8.5 с различных генотипов были диссоциированы и высевали на вершине F9 RARE-LacZ клеток. LacZ окрашивания через 24 часа позже позволяет визуализировать ответ клавиш F9 RARE-LacZ клеток к действию эндогенных RA, полученных сокультивируют образцов. В Gpr161 ^Вл мутация приводит к сниженной эндогенной RA , как визуализированные уменьшенного ответ репортера клеток. (B) слева. Фазово-контрастным изображение нейросферах культивируемых от взрослых спинного мозга нервных стволовых клеток показано. Правильно. Нейросферах , полученные от взрослых Gpr161 ^{вес / вес} спинного мозга диссоциируют и высевали на вершине F9 RARE-LacZ клеток. Присутствие синего осадка следующих LacZ окрашивания указывают на наличие эндогенной RA в этих нейросферах. Разница в интенсивности окрашивания между нейросфера и E8.5 эмбрионов со-культур указывают на более высокие уровни в настоящее время РА нейросферах чем E8.5 эмбрионов. Шкала баров 100 мкм.целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Стандартная кривая и колориметрические Количественное уровней RA. Реакция F9 RARE-LacZ репортер клеточной линии может быть измерена колориметрически при 610 нм с использованием стандартной ELISA - ридере. (А) , репрезентативной стандартной кривой , используемой для количественного определения относительных уровней Р.А. дикого типа нейросфера культуры с. (B) Количественная относительных уровней RA из сокультивируют E8.5 эмбрионов. N = 3; * Р <0,05, т-тест Стьюдента. Усы SEM. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Stoск Буферы / Решения	Компоненты	Условия хранения
10% моногидрата дезоксихолат натрия (C 24 H 39 NaO 4 · H 2 O)	10 мл в 100 мл дН 2 O	4 ºC
1 М хлорида магния (MgCl 2)		RT
100x ферроцианида калия (K 4 [Fe (CN) 6] · 3H 6 O)	2,12 г в 10 мл дН 2 O	RT в темноте
100x феррицианида калия (K 3 [Fe (CN) 6])	1,64 г в 10 мл дН 2 O	RT в темноте
20 мг / мл X-Gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозида)	добавляют 5 мл диметилформамид, чтобы получить 20 мг / мл маточного раствора	-20 ºC
10 мМ (3 мг / мл), все-TRанс ретиноевой кислоты	Растворите 50 мг в 16,67 мл абсолютного этанола. Готовят аликвот объемом 1 мл.	-80 ° С в темноте, в 1,5 мл янтарного микропробирок
Папаин	растворить один флакон в 7 мл HBSS	4 ºC

Таблица 1. Буферы и решений композиции.

Работа Буферы / Решения	Компоненты	Условия хранения
F9 RARE-LacZ среда для культивирования клеток	50 мл фетальной бычьей сыворотки (ФБС) (конечная концентрация 10%)	Фильтр-стерилизовать.
	5 мл 100x пенициллин стрептомицина (конечная конц 1X)	Хранить при температуре 4 ° С.
	4мл 50 мг / мл G418 (конечная конц 0,4 мг / мл)
	до 500 мл DMEM / F-12 (с L-глютамином и HEPES)
0,2% желатина	25 мл 2,0% желатина	Хранить при температуре 4 ° С.
	80 мл дистиллированной воды
	Хорошо перемешать
70% этанол	30 мл 95% -ного этилового спирта	Место в пульверизатор.
	70 мл дистиллированной воды	Хранить при комнатной температуре
Нейросфера диссоциации среда	1 мл 20U папаин	готовить свежий каждый раз, когда
	100 мкл 13 мг / мл трипсина
	100 мкл 7 мг / мл гиалуроновой кислоты
	28 мкл 10 мг / мл DNAseI
	50 мкл 4 мг / мл кинуреновой кислоты
питательная среда нейросфера	DMEM / F-12 (с L-глютамином и HEPES)	готовить свежий каждый раз, когда
	2% B-27 дополнения
	20 нг фактора роста фибробластов / мл (FGF)
	20 нг эпидермального фактора роста (ЭФР)
2,5% глутаральдегида	250 мкл 50% глутаровый альдегид	готовить свежий каждый раз, когда
	4750 мкл 1x PBS
промывочный раствор LacZ	0,5 мл 10% деоксихолат (конечная конц 0,1%)	Хранить при температуре 4 ° С.
	1,0 мл 100% NP-40 (конечная конц 0,2%)
	50 мл 10х PBS
	дистиллированную воду до 500 мл
красящий раствор X-гал	1x ферроцианида калия	готовить свежий каждый раз, когда
	1x феррицианида калия
	1 мг / мл X-Gal
	до нужного объема с помощью LacZ промывочный раствор
F9 RARE-LacZ замораживания среднего	F9 RARE-LacZ культуральной среды + 5% ДМСО	готовить свежий каждый раз, когда

Таблица 2. Рабочие Буферы и решений композиции.

Обсуждение

F9 , линию клеток RARE-LacZ - ¹⁴ представляет собой мощную систему , которая может быть использована для обнаружения RA производимого тканевых эксплантов ^12,14,17,18. Он чувствителен к концентрации RA , как низко как 100 Fm, без неспецифического ответа обнаруженного в клетках необработанных с РА ^12,14,18. Кроме того, репортер клетки реагируют на все-транс - ретиноевой линейным образом в пределах определенного диапазона концентраций, таким образом , дава реакции , LacZ быть количественно и используется для определения величины уровней RA ^12,14,18. Быстрый и простой анализ репортер RA , представленный здесь использует линию F9 репортер клеток RARE-LacZ для визуализации (рис 2) и относительного количественного измерения (рисунок 3) эмбрионов и культивируют взрослых нервных стволовых клеток. Эта система репортер позволяет проводить сравнение эндогенных уровней RA между отдельными образцами, как показано на рисунке 2. Он достаточно чувствителен , чтобы иметь возможность обнаружить RAгенерироваться отдельными эмбрионами E8.5 (фиг.2А), а также RA , производимых культивируемых нейросферах (рис 2В). Дозозависимый ответ этой клеточной линии в различных концентрациях RA позволяет квантификации уровней RA (рис 3А) в образцах, а также сопоставление относительных уровней RA между образцами (фигура 3В). Важно отметить, что линия F9 РЕДКОГО репортер ячейка измеряет общее количество RA, генерируемый образцов ткани в течение времени инкубации. Это эквивалентно чистый баланс синтеза и катаболизма РА.

В то время как F9, RARE-LacZ, система клеток репортер обладает высокой чувствительностью и универсальным, существует несколько важных шагов по устранению неисправностей, которые мы включили для того, чтобы обеспечить надежность этой системы. Во- первых, как показано на рисунке 1, важно , чтобы поддержать здоровье этих клеток регулярными проходами , не давая им ггрести к сплошности. Во-вторых, мы наблюдали позже проходы, как правило, приводят к несогласованности ответов RA, даже если культуры постоянно поддерживаются при селекции с помощью G418. Для устранения этого, рекомендуется отказаться от культуры после 20 пассажей и оттаивать новый флакон. Кроме того, регулярные проверки должны быть выполнены, чтобы гарантировать, что репортер клетки все еще сильными реагирующих на присутствие RA в средствах массовой информации. В- третьих, если ранние проходы обладают плохой или неравномерную ответ на RA (Фиг.1В, слева), один или несколько этапов субклонирования может быть необходимо , пока сильные ответные меры не будут получены (Фиг.1В, RIGH т). И, наконец, до совместной культуре, рекомендуется, чтобы образцы ткани, такие как эмбрионы и нейросферах диссоциируют на отдельные клетки. Мы наблюдали, что диссоциация результатов выборок в более последовательных колориметрических измерений. Это может быть из-за более равномерного распределения RA в культуре скважин, поскольку диссоциированные клетки находятся в универеформа контакта с репортером клеток.

Некоторые модификации были сделаны к оригинальному протоколу ^14. Во- первых, ответ RA из RARE-F9 LacZ клетки были количественно определены путем непосредственного закрепления клеток и измерения оптической плотности при длине волны 610 нм вместо сбора и анализа клеток лизат для б-галактозидазы ^14. Другая модификация является прямое совместное культивирование диссоциированных образцов с F9 RARE-LacZ до количественного ответа РА. Предыдущие методы сообщили культивированием образцы отдельно и добавлять только носитель из этих культур до F9 RARE-LacZ ^16,18.

Несмотря на будучи мощной системе, репортер анализа F9 RARE-LacZ имеет ряд ограничений. Одно ограничение этой линии клеток-репортер, что, хотя она сильно реагирует на присутствие полностью транс-RA, он также реагирует на другие изомеры ретиноевой кислоты, включая 9-цис-RA и 13-цис-RA; Тем не менее, они в 100 раз более чувствительными к полностью транс-RA комкрасный с другими изомерами ^18. Другим ограничением этой системы является то, что линейная доза-зависимый ответ падает только между 10 ^-13 М до 10 ^-7 М ат-РА ^14,18; Таким образом, если сравнивать уровни RA вне этих пределов, то может быть необходимо выполнить серийное разведение образца до измерений не попадают в пределах линейного диапазона. И наконец, так как это в первую очередь колориметрический анализ, конечная точка проявления цвета будет варьироваться между образцами и экспериментов. Таким образом, важно, что стандартная кривая всегда высевать параллельно для каждого отдельного эксперимента для того, чтобы использовать его для количественной оценки ответа репортер клетки.

В заключение, мы уже сообщали, использование F9 репортер клеточной линии RARE-LacZ РА для измерения уровней RA количественно E8.5 эмбрионов и, ранее незарегистрированного в нейросферах. Универсальность этого репортера системы может позволить количественно оценить уровни RA в практически любой клеток или тканей типа, и мау привести к развитию различных областей применения в будущем.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
C3H/HeSn-Gpr161vl/J mouse strain	Jackson Laboratory	000316
F9 RARE-LacZ reporter cell line			from Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia)
DMEM/F-12 (with L-glutamine and HEPES)	ThermoFisher Scientific	11330-057
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified	ThermoFisher Scientific	26140-079	Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm in 37 °C for media preparation
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122	Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; light-sensitive
G418	ThermoFisher Scientific	10131-027	Store at 4 °C; light-sensitive
2% Gelatin	Sigma Aldrich	G1393	Store at 4 °C
B-27 supplement (2 % stock solution)	ThermoFisher Scientific	17504-044	Store at -20 °C in 1-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm at room temperature for media preparation
Murine Epidermal Growth Factor (EGF)	PeproTech	315-09	Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1xPBS; prepare working concentrations by diluting with 1x PBS; store at -20 °C
Murine Fibroblast Growth Factor (FGF)-basic	PeproTech	450-33	Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1x PBS; prepare working concentrations by diluting with 1x PBS; store at -20 °C
50% glutaraldehyde	Amresco	M155	Store at 4 °C
Sodium deoxycholate monohydrate (C24H39NaO4 · H2O)	Sigma Aldrich	D5670	Store at RT
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside)	Promega	V3941	Store stock at -20 °C
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	41639	Store at RT
all-trans Retinoic Acid (at-RA)	Sigma Aldrich	R-2625	Store 1 ml aliquots of stock in -80 °C; extremely sensitive to light
TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12605-010	Store at RT
0.25% trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific	25200-056	alternative to TrypLE Express; aliquot and store at -20 °C
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	ThermoFisher Scientific	14170-112	Store at 4 °C
10x phosphate buffered solution (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010-023	Store at 4 °C
Papain	Worthington	LK003176	Store at 4 °C.
Trypsin	Worthington	LS003703	Store in 1 ml aliquots at -20 °C.
Hyaluronic acid	Calbiochem	385908	Store 200 μl aliquots at -20 °C.
DNaseI	Worthington	LS002139	Store in 200 μl aliquots at -20 °C
Kynurenic acid	Sigma Aldrich	K3375	Store in 200 μl aliquots at -20 °C
95% ethanol
Mr. Frosty Freezing container	ThermoFisher Scientific	5100-0001
10 cm culture dish (non-cell culture treated)
10 cm culture dish (cell culture treated)
6 cm culture dish (non-cell culture treated)
96-well cell culture plates
1.5 ml microcentrifuge tubes
1.5 ml amber microcentrifuge tubes
1.5 ml cryovials
37 °C water bath
surgical scissors
fine surgical scissors
no. 5 forceps
blunt-ended forceps
scalpel blade
glass pasteur pipettes
cotton
alcohol lamp
ELISA plate reader
stereomicroscope