Quantitative Messung der relativen Retinsäure Niveaus in E8.5 Embryonen und Neurosphäre Kulturen Mit der F9 RARE-Lacz Zell-basierte Reporter Assay

Zusammenfassung

Methods to accurately measure retinoic acid (RA) levels in small amounts of tissue do not exist. This protocol describes the easy, quantitative measurement of relative RA levels in E8.5 embryos and neurospheres using an RA reporter cell line.

Zusammenfassung

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, neurogenesis, patterning of the hindbrain and spinal cord, and the development of multiple organ systems. Due to its chemical nature as a small amphipathic lipid, direct detection and visualization of RA histologically remains technically impossible. Currently, methods used to infer the presence and localization of RA make use of reporter systems that detect the biological activity of RA. Most established reporter systems, both transgenic mice and cell lines, make use of the highly potent RA response element (RARE) upstream of the RAR-beta gene to drive RA-inducible expression of reporter genes, such as beta-galactosidase or luciferase. The transgenic RARE-LacZ mouse is useful in visualizing spatiotemporal changes in RA signaling especially during embryonic development. However, it does not directly measure overall RA levels. As a reporter system, the F9 RARE-LacZ cell line can be used in a variety of ways, from simple detection of RA to quantitative measurements of RA levels in tissue explants. Here we describe the quantitative determination of relative RA levels generated in embryos and neurosphere cultures using the F9 RARE-LacZ reporter cell line.

Einleitung

Retinsäure (RA) ist ein Metabolit Derivat von Retinol oder Vitamin A und wird durch die sequentielle Aktivität mehrerer zellulärer Dehydrogenasen ¹ hergestellt. Aufgrund seiner chemischen Natur amphiphatischen, kreuzt leicht Lipidmembranen und kann als lösliches morphogenetischen Faktor ¹ wirken. Es ist ein wesentliches Molekül , das , indem es als Ligand für Kern Retinoid - Rezeptoren und Aktivierung der Genexpression ^2-10 zahlreiche Entwicklungs und adulte zelluläre Prozesse reguliert. Ohne RA, diese RA-Rezeptoren (RARs) binden RAREs in DNA und wirken als Repressoren; RA Bindung an diese Rezeptoren verwandelt sie in Transkriptionsaktivatoren in die Zielgenexpression resultierende ^1,5,6.

Obwohl die RA - Signalweg gut charakterisiert ist, macht die geringe Größe (~ 300 Da) und amphipathischen Natur der RA direkte histologische Visualisierung und Messung von RA derzeit technisch nicht machbar ^11. Die einzige Methode für direct Messung von RA Ebenen ist durch die Isolierung von RA von Gewebeproben Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung von ^11. Dieses Verfahren erfordert typischerweise große Mengen von Gewebe, erleichtert durch verschiedene Proben ¹² Pooling. Somit ist diese Technik schlecht geeignet für die Messung von RA Ebenen in einzelnen Embryonen oder kleine Mengen an Proben / Gewebe.

Haben, um die zelluläre Funktion von RA, mehrere Verfahren zu untersuchen, entwickelt, um die Anwesenheit von RA indirekt geschlossen werden. Diese Verfahren machen Gebrauch von Reportersystemen , die sehr reaktions RAR-beta RARE Antreiben der Expression von beta-Galactosidase oder Luciferase ^11,13,14 enthält. Die transgene RARE-LacZ - Reporter Maus von Rossant erzeugt et al. ¹³ ist ein ideales System für in - situ - ^11,13,15,16 Raum - Zeit - Regionen von RA - Signalisierung zu visualisieren , ist aber nicht geeignet für quantitative Messungen. Die F9 RARE-LacZ - Zelllinie ^14, auf Ter dagegen ist für den Nachweis von RA und quantitative Messungen der RA Ebenen in Gewebeexplantaten ^{11,12,14,17,18} nützlich.

F9 Teratokarzinom Zellen exprimieren endogen Alpha-, Beta- und Gamma-Retinolsäurerezeptoren ¹⁹ und initiieren eine Differenzierung in parietalen endoderm nach Exposition mit RA ^19-21. F9-Zellen wurden für RA-induzierte Zelldifferenzierung als Modell etabliert, schon lange, weshalb es als eine ideale Zelllinie für einen RA-Reportertest ausgewählt wurde. Die F9-derived Sil-15 RA - Reporterzelllinie , die durch Wagner et al. ¹⁴ enthält eine E. coli'LacZ Gen stromabwärts von einer Kopie des 64-bp - Retinsäure - Reaktionselement (RARE) des menschlichen beta-Retinsäure-Rezeptor (RAR-beta) -Gen. Um stabile Klone zu selektieren und zu erhalten, enthält das Konstrukt auch die Aminoglykosid - Phosphotransferase (NEO ^r) -Gen als selektierbaren Marker in der Anwesenheit von G418. Dieses Konstrukt confers induzierbare Expression von b-Galactosidase in Gegenwart von RA, die durch LacZ - Färbung und diese Antwort anschließend sichtbar gemacht werden kann , kann quantifiziert werden unter Verwendung ^11,12,14,18 kolorimetrische Methoden.

Diese extrem vielseitig Reporterzelllinie wurde bei der Detektion von endogenen RA Produktion durch Co-Kultur von Gewebeproben mit den Reporterzellen, wie Cochlea ¹⁷ und embryonale Bodenplatte Explantate ¹⁴ weit verbreitet. Darüber hinaus hat dieser Reporter Linie zur Quantifizierung von RA Ebenen in der Entwicklungsrückenmark durch Kultivierung gepoolt Abschnitte von embryonalen Rückenmark getrennt und Hinzufügen konditionierten Medien aus diesen Kulturen zu F9 RARE-LacZ - Zellen ¹⁸ verwendet. Die Quantifizierung erfolgte nach LacZ - Färbung durch farbmetrische Messung durchgeführt ^11,12,18 eine Standard - ELISA - Plattenleser. Schließlich hat dieser Reporter-Zelllinie wurde in der Detektion der Anwesenheit von RA metabolischer Enzyme durch monitori verwendetng ändert sich in RA Ebenen ^12,18.

Hier berichten wir, dass die Empfindlichkeit dieser Reporterzelllinie ermöglicht auch die Messung von RA Ebenen erzeugt aus einzelnen cokultiviert E8.5 Embryonen. Dies ermöglicht den Vergleich zwischen einzelnen Embryonen verschiedener Genotypen. Als konkretes Beispiel ist Gpr161 Waise GPCR , die Neurulation teilweise durch die RA - Signalweg ^22, und wir berichten , mit dieser Reporterzelllinie zu untersuchen , die Wirkung einer rezessiven Mutation in Gpr161 (Gpr161 ^vl) auf insgesamt RA Ebenen in der regelt Embryo. Zusätzlich dazu ermöglicht die Vielseitigkeit und die Einfachheit der Verwendung dieser Reportersystem die Freiheit zu messen und RA Ebenen in verschiedenen Gewebeproben, auch in Neurosphärenkulturen erhalten aus adultem Rückenmark-Stammzellen zu vergleichen. Hier beschreiben wir die quantitative Bestimmung der relativen RA Ebenen in Embryonen und Neurosphere Kulturen durch direkte Co-Kultur mit der F9-RARE-LacZ RA repOrter-Zelllinie.

Protokoll

Alle tierischen Arbeit wurde nach getan genehmigt Rutgers-RWJMS IACUC Methoden.

1. Lösung und Medienvorbereitung

1. Bereiten Sie Lager und Pufferlösungen gemäß Tabelle 1. Bereiten Sie Arbeitslösungen gemäß Tabelle 2.

2. Kultur und Wartung von F9 RARE-LacZ-Zellen

1. Auftauen gefrorenen Zellen
   1. Bereiten F9 RARE-LacZ Zellkulturmedium , wie in Tabelle 2 aufgeführt.
   2. Mantel 10 cm - Kulturschalen (Zellkultur behandelt) mit 10 ml 0,2% Gelatine (siehe Tabelle 2) für 30 min bei RT. Waschen Sie die überschüssige Gelatine mit zwei Spülungen mit 10 ml destilliertem Wasser. Schnell in 9 ml F9 RARE-LacZ Zellkulturmedium in den Kolben die Gelatine vor dem Austrocknen zu verhindern.
   3. Tauen Sie ein Fläschchen mit F9 RARE-LacZ - Zellen ¹⁴ in einem 37 ° C Wasserbad für 2 - 3 min. Platten Zellen (etwa 1 x 10 ⁶ Zellen / ml) in das beschichtete Schale containing 9 ml Kulturmedium. Kultur bei 37 ° C, 5% CO _2. Ändern Sie das Medium am nächsten Tag.
2. Wartung von F9 RARE-LacZ - Zellen
   1. Aufrechterhaltung eines regelmäßigen Durchgang alle 2 - 3 Tage in einem Verhältnis von 1:10.
      Hinweis: Lassen Sie sich nicht in Zellen Konfluenz wachsen, wie dies in ihrer Differenzierung führen.
   2. Spalten die Kulturen bei einer Konfluenz von 80-90%. Entfernen Sie die Medien und wasche die Zellen mit 10 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Entfernen Sie die PBS und 1 ml Trypsin, Inkubation für 5 min. In 9 ml Kulturmedium, einer Pipette auf und ab und geteilte Zellen 01.10 für die Passage.
3. Einfrieren F9 RARE-LacZ - Zellen
   1. Trypsinize eine 10 cm Schale mit F9 RARE-LacZ-Zellen bei 80-90% Konfluenz als 2.2.2 in Schritt beschrieben. Übertragung der dissoziierten Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen und Spinn bei 200 xg für 5 min.
   2. Überstand entfernen und resuspendieren Zellpellet in 10 ml F9 RARE-LacZ freezing Medium (siehe Tabelle 2). Aliquot 1 ml in etikettierte Kryoröhrchen und Transfer Fläschchen in Gefrierbehälter. Platzieren Gefrierbehälter in -80 ° C Gefrierschrank O / N und Übertragungs Vials zu flüssigem Stickstoff Tanks am nächsten Tag.

3. Dissection von E8.5 Embryonen

1. Mating Cage Set-up und Stecker prüfen
   1. Set-up einen passenden Käfig, die eine Paarung Paar. Am Morgen des nächsten Tages, überprüfen Sie das Vorhandensein eines Vaginalpfropfens und bezeichnen den Tag ein Stecker als Tag 0,5 ²³ gefunden. Am Tag E8.5, Ernte Embryonen.
2. Dissection von Embry
   1. Opfere den Damm durch Genickbruch und sprühen Sie den Bauchbereich mit 70% Ethanol (siehe Tabelle 2). Machen Sie einen quer auf der Haut über dem Bauch schneiden chirurgische Schere und ziehen Sie die beiden Klappen auseinander (anterior und posterior) den Bauchbereich zu belichten. Machen Sie einen ähnlichen Schnittauf das Peritoneum den Bauch zu belichten.
   2. Suchen Sie die Uteri und Release Uteri aus den Eileitern und Mesometrium eine Schere ²³ verwendet wird . Legen Sie die Uteri in einer 6 cm-Schale (Nicht-Zellkultur behandelt) mit 10 ml 1x PBS überschüssiges Fett und Blut abzuwaschen. Übertragung auf eine andere 6 cm Schale mit frischen 10 ml 1x PBS.
   3. Separate eine Gebärmutter ein Embryo enthält, die durch sie schneiden mit chirurgische Scheren aus. Entfernen Sie die Gebärmutter und Decidua und lassen Sie die Dottersack des Embryos mit zwei Paaren von nicht enthält. 5 Zange ^23.
   4. Trenne die Dottersack von Embryos und übertragen den Dottersack in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für die genomische DNA-Extraktion für die Genotypisierung verwendet werden. Verwenden Sie eine P20-Pipette mit einem Breitbohrungsspitze, übertragen Sie den gesamten Embryo in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, das 10 & mgr; l Trypsin. Das Röhrchen auf Eis.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.3 - 3.2.4, bis alle Embryonen seziert wurden.
3. Embryo Distanzierung
   1. Inkubieren der 1,5-ml-Röhrchen Embryonen in Trypsin bei 37 ° C enthält, für 5 min enzymatische Dissoziation zu erleichtern.
      1. Man reibt vorsichtig mit einem P20-Pipette für die mechanische Dissoziation des Embryos verwendet, und die Platte das gesamte Volumen von 10 ul eines dissoziierten Embryo über eine Vertiefung F9 RARE-LacZ-Zellen in einer 96-Well-Platte enthält (siehe Schritt 5.1 zum Galvanisieren F9 RARE-LacZ-Zellen in einer 96-Well-Platte). Kultur O / N bei 37 ° C und 5% CO _2.

4. Laminectomy, Dissektion der erwachsenen lumbalen Rückenmark und Neurosphäre Kultur

1. Laminectomy
   1. Sacrifice ein Erwachsener (P60) Maus durch Genickbruch.
   2. Sprühen Sie die Rückenseite mit 70% Ethanol und machen eine Querschnitt mit chirurgische Scheren. Ziehen Sie beide Klappen (vordere und hintere) auseinander den Rücken und Wirbelsäule zu belichten.
   3. Mit chirurgische Schere, schneiden Sie die Muskeln für den Rücken ab.Suchen Sie den Lendenbereich des Rückenmarks, unter den Rippen. Mit Hilfe der Schere, machen einen tiefen Schnitt die Wirbelsäule an dieser Stelle zu durchtrennen, das Rückenmark zu belichten.
   4. Ziehen Sie den Lendenbereich der Wirbelsäule mit nicht auf. 5 Zange, so dass der freiliegenden Querschnitt des Rückenmarks ist mit Blick auf den Experimentator. Mit den Spitzen der feinen Schere, schneiden Sie den Wirbel und Muskeln bei 3 Uhr und 9 Uhr-Position des freiliegenden Ende. Fassen Sie die Dorsallappen des geschnittenen Wirbel mit einer Pinzette. Weiter diese Kürzungen kaudal, bis die Länge des lumbalen Rückenmark ausgesetzt ist.
   5. Lassen Sie das Rückenmark von den Wirbeln mit Nr. 5 sowie mit stumpfen Enden versehen Zange. Übertragen Sie das Rückenmark in ein 15 ml Röhrchen mit 3 ml DMEM / F12 Kulturmedium. Halten Sie sich auf Eis, bis alle lumbalen Rückenmark isoliert wurden.
2. Spinal Cord Dissection
   1. Gießen Sie das Kulturmedium mit dem Rückenmark in eine 6 cm Schale (Nicht-Zellkultur behandelt).
   2. Unter einem Stereomikroskop, entfernen Sie die Dorsalwurzelganglien und Blutgefäße um das Rückenmark Segment durch die Ganglien und Blutgefäße unter Verwendung von zwei Paaren nicht zu erfassen. 5 Zange und ziehen Sie sie vorsichtig weg vom Rückenmark. Übertragen Sie das Rückenmark Segment auf eine 6 cm Schale ohne Medium und Hackfleisch, das Gewebe fein ein Skalpell verwendet wird.
   3. Transfer zerkleinerte Gewebe zu 15 ml Röhrchen mit 1 ml Neurosphere Dissoziation Medien (siehe Tabelle 2). Setzen Sie Röhrchen auf Eis und wiederholen Sie die Schritte 4.2.1 - 4.2.2, bis alle Rückenmark verarbeitet wurden.
   4. Die Röhrchen zerkleinerte Gewebe in Dissoziation Medium für 10 min bei 37 ° C enthält, flick das Rohr auf der Seite, zu mischen und dann Inkubieren für weitere 10 min bei 37 ° C. Nach der enzymatischen Verdauung, verreiben mit feuerpolierten Pipetten Durchmesser für die mechanische Dissoziation abnimmt.
      Hinweis: Bereiten feuerpolierten Pipetten mit einem Durchmesser vor der Durchführung von Experimenten zu verringern. Nehmen Sie ein Glas PasteurPipette und das breite Ende mit einem sauberen Baumwoll stecken. Mit Hilfe eines Alkohol-Lampe, Feuer polieren die Spitzen der Pipetten in der Flamme mit unterschiedlichen Durchmessern zu schaffen: "regular", "fein" und "extra fein". Für "normale" poliert Pipetten, wirbeln das Ende der Pipette in der Flamme Runde der Kanten, ohne den abnehmendem Durchmesser (~ 1 mm). Drehen Sie das Ende der Pipette in der Flamme für eine etwas längere Zeit "fein" (~> 1 mm und> 5 mm Durchmesser) und "extra fein" (~ 0,5 mm) poliert Pipetten zu schaffen. Verwenden Sie keine Pipetten mit einem Durchmesser von weniger als 0,5 mm.
3. Neurosphäre Kultur
   1. Spin down-Röhrchen, die distanzierte Rückenmarksgewebe bei 200 × g für 10 min. Überstand entfernen und resuspendieren Zellpellet in 1 ml Neurosphere Kulturmedien (siehe Tabelle 2). Verreiben mit einem P1,000 Pipette durch eine P200 Pipetten gefolgt Dissoziation zu erleichtern.
      Hinweis: Vermeiden Sie die Einführung Blasen,die würde die Lebensfähigkeit der Zellen zu verringern.
   2. Transfer 10 ul dissoziierten Zellen in einem Hämozytometer und eine Zellzahl erhalten. Platten Zellen in einer Dichte von 1x10 ^5/10 ml in einem T25 - Kolben mit 10 ml Kulturmedien Neurosphäre. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 7 Tage bis Neurospheres ²⁴ angezeigt.
4. Neurosphere Dissociation
   1. Sammeln Sie Neurosphere Kultur und Transfer in 15 ml-Röhrchen. Spin bei 200 × g für 10 min. Entfernen Sie die meisten der Überstand zurückblieb 1 ml hinten. Man reibt mit einer P1,000 Pipette das Zellpellet und distanziere Neurosphären in einzelne Zellen zu suspendieren. Transfer 10 ul dissoziierten Zellen in einem Hämozytometer und eine Zellzahl zu bekommen.
   2. Plate 1 x 10 ⁵ distanzierte Neurosphere Zellen über eine Vertiefung F9 RARE-LacZ in einer 96-Well - Platte (Abschnitt 5.1 zur Plattierung F9 RARE-LacZ in 96-Well - Platte sehen). Platte 3 Brunnen als Repliken. Kultur O / N bei 37 ° C und 5% CO _2.

5. RA Assay von E8.5 Embryonen und Rückenmark Neurosphären

1. Plating F9 RARE-LacZ in 96-Well - Platte
   1. Einen Tag vor der Ernte E8.5 Embryonen oder Dissoziation von Neurosphären, Mantel eine 96-Well-Platte mit 100 ul 0,2% Gelatine pro Vertiefung für 30 min bei RT. Saugen Sie die Gelatine und spülen Sie zweimal mit 200 ul destilliertem Wasser.
   2. Trypsinize F9 RARE-LacZ-Zellen in 10 cm-Schalen gehalten, wie in Schritt 2.2.2 beschrieben. Plate 1 x 10 ⁵ Zellen / Vertiefung von F9-RARE LacZ - Zellen, aber dieses Mal mit Kulturmedium ohne G418.
   3. Vorbereitung genug Vertiefungen für die Co-Kultur der Embryonen (~ 12 bis 20, abhängig von der Wurfgröße), Neurosphären (3 Vertiefungen / Genotyp) sowie für eine Standardkurve in dreifacher Ausführung (27 Vertiefungen).
2. Co-Kultur von F9 RARE-LacZ und E8.5 Embryonen oder Rückenmark Neurosphären
   1. Ernte-Embryonen, wie in Abschnitt detailliert 3.2 und Platte oben auf F9RARE-LacZ in der 96-Well-Platte aus dem Abschnitt 5.1. In ähnlicher Weise distanzieren Neurosphären und Platte oben auf F9 RARE-LacZ in der 96-Well-Platte, wie detailliert in Schritt 4.4. Kultur O / N bei 37 ° C und 5% CO _2.
3. Erzeugen einer Standardkurve
   1. Um eine Standardkurve zu erzeugen, bereiten all-trans RA (at-RA) Lösungen mit den folgenden Konzentrationen: 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, 1 pM, 100 fM, durch serielle Verdünnung des at- RA Lager mit F9 RARE-LacZ Kulturmedium (siehe Tabelle 1).
   2. 100 l dieser verschiedenen in-RA-Konzentrationen bis F9 RARE-LacZ-Zellen aus dem Abschnitt 5.1. Vergeben Brunnen unbehandeltem F9 RARE-LacZ-Zellen als negative Kontrolle enthält. Bereiten Sie Triplikaten jeder RA Konzentration und Negativkontrollen. Kultur O / N bei 37 ° C und 5% CO _2.
      Hinweis: F9 RARE-LacZ-Zellen reagieren in einer dosisabhängigen Weise linear variierenden Konzentrationen von all-trans-RA.
4. RA - Assay
   1. Nach O / N - Kultur der 96-Well - Platte , die die Standardkurven und Co-Kulturen enthält, die Medien zu entfernen und die Kulturen beheben , indem 100 & mgr; l von 2,5% Glutaraldehyd Zugabe (siehe Tabelle 2) für 15 min, RT. Entfernen Sie die Fixiermittel und waschen zweimal mit 200 ul 1x PBS, 10 min pro Wasch.
   2. Entfernen PBS und waschen dreimal mit 200 ul der LacZ Waschlösung (siehe Tabelle 2), 10 min pro Wasch. Während der dritten Wäsche, bereiten Sie die X-gal - Färbung Lösung in einem 15 - ml - Röhrchen in Folie verpackt (siehe Tabelle 2). Berechnen Sie, wie viel Färbelösung benötigt wird, und bereiten Sie die entsprechende Menge (200 & mgr; l / Well).
      Hinweis: X-gal-Färbung Lösung lichtempfindlich ist. Verwenden Sie die Farblösung innerhalb von 15 Minuten nach der Zubereitung.
   3. Bereiten Sie eine befeuchtete Kammer durch ein Papiertuch angefeuchtet mit destilliertem Wasser in einen Plastikbehälter groß genug Platzieren einer 96-Well-Platte zu halten. Geben Sie 200 ul der Xgal Färbungslösung pro Vertiefung der 96-Well-Platte und legen Sie die Platte in einer befeuchteten Kammer.
   4. befeuchteten Kammer inkubieren der 96-Well-Platte bei 37 ° C enthält, für die Entwicklung von blau gefärbten Niederschlag zu ermöglichen. Für E8.5 Embryonen Die Platte O / N (12 bis 16 h). Für Neurosphere Kulturen, brüten die Platte für 4 - 8 Stunden.
5. Messung der Absorption bei OD ₆₁₀ und Imaging
   1. Nach der Farbreaktion, die LacZ Färbelösung entfernen und mit 200 ul 1x PBS ersetzen. Messen Sie die Absorption bei 610 nm eine Standard-ELISA-Plattenlesegerät mit dem Reporter Reaktion auf RA zu quantifizieren. Bild einzelnen Wells ein Standard-Stereomikroskop mit einer Kamera ausgestattet ist.

6. Subklonierung von F9 RARE-LacZ-Zellen

1. Prüfen F9 RARE-LacZ rResponse RA
   1. Bevor Sie irgendwelche Experimente starten, testen Sie die Reaktion von F9 RARE-LacZ-Zellen RA. Platte F9 RARE-LacZ cells in 96-Well-Platte, und fügen Sie 1 nM all-trans-Retinsäure (siehe Schritt 5.3) (siehe Abschnitt 5.1). in einer befeuchteten Kammer bei 37 ° CO / N-inkubiert.
   2. Visualisieren Entwicklung blauer Farbniederschlag mit einem Mikroskop. Wenn die Farbentwicklung nicht einheitlich in den Zellen in der Vertiefung ist (siehe Abbildung 1B, links), führen die Subklonierung unten detailliert beschrieben.
2. Subklonierung von F9 RARE-LacZ - Zellen
   1. Teilen Sie die F9 RARE-LacZ-Zellen, die in 10-cm-Schalen, wie in Schritt 2.2.2 beschrieben. Anstelle einer im Verhältnis 1:10, eine niedrige Aussaatdichte von 1 x 10 ⁵ Zellen / 10 ml in einer 10 cm Teller Teller für das Wachstum von isolierten Kolonien zu ermöglichen , so dass jede Kolonie von einer einzigen F9 RARE-LacZ Zelle entsteht.
   2. Nach zwei Tagen Mantel eine 24-Well-Platte mit 500 ul 0,2% Gelatine pro Vertiefung für 30 min. Entfernen Gelatinelösung und spülen Vertiefungen zweimal mit 500 & mgr; l destilliertes Wasser. Ersetzen Sie Wasser mit 500 ul F9 RARE-LacZ Zellkulturmedium.
   3. Wählen Sie eine Kolonie mit einer sterilen P10 Pipettenspitze und Transfer in ein gut; tun dies 24 mal 24 einzelne Kolonien zu erhalten. Kultur bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 3 - 4 Tage.
   4. Teilen Sie die einzelnen Kolonien in zwei 24-Well-Platten. Nach 2 Tagen in der Kultur, in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und Kultur O / N 1 nM von RA hinzufügen. Führen Sie LacZ-Färbung detailliert wie in Abschnitt 5.4 für High-Responder zu testen. Visualisieren Farbreaktion jeder Vertiefung unter einem Mikroskop starken und einheitlichen Responder zu bestimmen.
   5. Sobald ein starker Subklon Responder bestimmt wird, erweitern Sie die entsprechende Kultur von den anderen 24-Well-Platte. erweitern weiter, dass Kolonie in einer 10 cm Schüssel, froren mehrere Fläschchen, wie in Abschnitt 2.3 detailliert und verwerfen alle anderen Kolonien.
      Hinweis: Nur etwa ein Viertel der ursprünglichen Kolonien in hoher Responder führen. Typischerweise ist die erste Runde der Subklonierung nicht in Uniform LacZ-Färbung führen und eine anschließende Runde der Subklonierung getan werden muss, umerreichen einheitliche starke Responder.

Ergebnisse

Die F9 RARE-LacZ-Reporter ist ein Anhänger embryonalen Karzinomzelllinie auf mit Gelatine beschichtete Oberfläche gewachsen. Das Reporterkonstrukt erlaubt es den Zellen quantitativ mit einer proportional Induktion von beta-Galactosidase zu RA zu reagieren. ^11,12,14,18. Diese Zellen zeigen eine epitheliale Morphologie (Abbildung 1A). Aufgrund ihrer hohen Verdopplungsrate, empfiehlt es sich, daß diese Zellen alle 2 aufgeteilt werden - 3 Tage in einem Verhältnis von 1:10. Während unserer Arbeit mit dem Reporter - Zelllinie, haben wir beobachtet , dass selbst bei der Zugabe von G418 in das Kulturmedium, die Reaktion dieser Zellen auf RA schwächt nach mehreren Durchgänge (1B, links), und dies kann die Reporter Kapazität beeinflussen können von diese Zelllinie. Dieser Verlust an Reaktionsfähigkeit kann bei späteren Passagen zu teilweisem Verlust des Transgens zurückzuführen sein. Als solche periodische Subklonierung notwendig ist , starke und einheitliche Responder RA zu gewährleisten (Abbildung1B, rechts).

Während verschiedene Verwendungen dieser Zellinie zuvor ^12,14-18 veröffentlicht wurde, berichtet , ist hier die Verwendung dieser Zelllinie mit verschiedenen Genotypen endogene RA Ebenen aus einzelnen E8.5 - Embryonen zu messen. Die Gpr161 ^{vl / vl} Mutation führt zu einer verminderten embryonalen RA Signalisierung ^22. Wie durch Co-Kultur von distanzierte Embryonen gezeigt mit F9 RARE-LacZ - Zellen, diese Gpr161 ^{vl / vl} Embryonen endogene RA reduziert im Vergleich zum Wildtyp - Geschwister (2A). Wegen der Vielseitigkeit dieser Reporterzelllinie, die auch hier berichtet wird , ist eine neuartige Verwendung dieser Zellen RA Ebenen von Neurosphäre Kulturen von erwachsenen Gpr161 ^{wt / wt} - Mäusen (2B) erhalten erzeugt zu detektieren. Dieser Reporter-Zelllinie war in der Lage, dass Neurosphere Kulturen aus adulten Rückenmark-Stammzellen endogene RA produzieren zu demonstrieren. Die große diffrenz in Anfärbungsintensität zeigt eine größere Reporter-Zellantwort auf das Rückenmark Neurosphären im Vergleich zu E8.5 Embryonen. Dies kann auf viel größere RA Ebenen durch die Neurosphären über die Zeit im Vergleich zu E8.5-Embryonen erzeugt werden, die auf die Tatsache zurückzuführen sein könnte, dass Neurosphäre Kulturen homogenere sind als E8.5-Embryonen und damit RA-produzierende Zellen enthalten.

Zugabe von verschiedenen Konzentrationen von at-RA bewirkt eine dosisabhängige lineare Reaktion der Reporterzellen. Diese Reaktion kann kolorimetrisch gemessen werden, indem die Extinktion bei 610 nm zu lesen. Die erzeugte Standardkurve kann dann verwendet werden , RA Ebenen in den Proben zu quantifizieren, wie in Wildtyp - Neurosphäre Kulturen (3A) oder E8.5 - Embryonen (3B).

Abbildung 1. Maintenance und Subklonierung von F9 RARE-LacZ-Zellen. (A) ein Phasenkontrastbild von F9 RARE-LacZ - Zellen gezeigt. Diese Zellen haben eine Verdopplungszeit von ~ 10 Stunden und muss alle 3 Tage übergeben werden. (Ca. 70 bis 80% Konfluenz) im Verhältnis 1:10 (B) periodische Überprüfung der Kulturen mit Zugabe von 1 nM at-RA und anschließender LacZ Färbung getan werden muss, Kulturen bleiben stark und einheitlich Responder RA (rechts) zu gewährleisten. Im Falle einer schlechten und ungleichmäßigen Responder (links), Subklonierung durchgeführt werden müssen. Maßstabsbalken 100 um. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. LacZ Färbung von Co-kultivierten Proben (Dissociated E8.5 Embryos / Neurosphären) und F9 RARE-LacZ - Zellen. (A) E8.5 Mausembryo s verschiedener Genotypen wurden dissoziiert und plattiert oben auf F9 RARE-LacZ-Zellen. LacZ-Färbung 24 Stunden ermöglicht später Visualisierung der Antwort der F9 RARE-LacZ-Zellen auf endogene RA durch Co-kultivierten Proben hergestellt. Die Gpr161 ^vl Mutation führt zu einer verminderten endogenen RA wie durch die reduzierte Reaktion der Reporterzellen sichtbar gemacht . (B) links. Ein Phasenkontrastbild von Neurosphären kultiviert aus adulten Rückenmark neuronale Stammzellen gezeigt. Recht. Neurosphären aus adulten Gpr161 abgeleitet wurden ^{wt / wt} Rückenmark distanzierte und auf der RARE-LacZ Zellen F9 plattiert. Die Anwesenheit von blauer Niederschlag folgenden LacZ-Färbung zeigen die Anwesenheit von endogenem RA in dieser Neurosphären. Der Unterschied in der Färbeintensität zwischen Neurosphere und E8.5 Embryo Co-Kulturen zeigen ein höheres Maß an RA in Neurosphären als E8.5 Embryonen. Maßstabsbalken 100 um.target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Standardkurve und farbmetrische Quantifizierung von RA Ebenen. Die Reaktion der F9 RARE-LacZ - Reporterzelllinie kann colorimetrisch bei 610 nm gemessen werden , um eine Standard - ELISA - Plattenlesegerät verwendet wird . (A) repräsentative Kurve Standard verwendet , um relativ RA Ebenen der Quantifizierung Wildtyp Neurosphere Kultur s. (B) Quantifizierung der relativen RA Ebenen von co-kultiviert E8.5 Embryonen. N = 3; * P <0,05, Student-t-Test. Die Fehlerbalken SEM. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Stock Puffer / Lösungen	Komponenten	Lagerbedingungen
10% Natriumdeoxycholat Monohydrat (C 24 H 39 NaO 4 · H 2 O)	10 ml in 100 ml dH 2 O	4 ºC
1 M Magnesiumchlorid (MgCl 2)		RT
100x Kaliumferrocyanid (K 4 [Fe (CN) 6] · 3 H 6 O)	2,12 g in 10 ml dH 2 O	RT im Dunkeln
100x Kaliumferricyanid (K 3 [Fe (CN) 6])	1,64 g in 10 ml dH 2 O	RT im Dunkeln
20 mg / ml X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid)	5 ml Dimethylformamid 20 mg / ml Stammlösung zu machen	-20 ºC
10 mM (3 mg / ml) all-trans Retinsäure	Man löst 50 mg in 16,67 ml absolutem Ethanol. Bereiten Je 1 ml.	in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen amber -80 ºC in der Dunkelheit,
Papain	ein Fläschchen in 7 ml HBSS auflösen	4 ºC

Tabelle 1. Puffer und Lösungszusammensetzungen.

Arbeits Puffer / Lösungen	Komponenten	Lagerbedingungen
F9 RARE-LacZ Zellkulturmedium	50 ml fötales Rinderserum (FBS) (Endkonzentration 10%)	Filter-sterilisieren.
	5 ml 100x Penicillin Streptomycin (Endkonzentration 1X)	Lagerung bei 4 ° C.
	4ml 50 mg / ml G418 (Endkonzentration 0,4 mg / ml)
	500 ml DMEM / F-12 (mit L-Glutamin und HEPES)
0,2% Gelatine	25 ml 2,0% Gelatine	Lagerung bei 4 ° C.
	80 ml destilliertem Wasser
	Gut mischen
70% Ethanol	30 ml 95% Ethanol	Legen Sie in Sprühflasche.
	70 ml destilliertem Wasser	Shop bei RT
Neurosphere Dissoziation Medium	1 ml 20U Papain	Vorbereitung frisch jedes Mal,
	100 ul 13 mg / ml Trypsin
	100 & mgr; l 7 mg / ml Hyaluronsäure
	28 & mgr; l 10 mg / ml DNaseI
	50 & mgr; l 4 mg / ml Kynureninsäure
Neurosphere Kulturmedium	DMEM / F-12 (mit L-Glutamin und HEPES)	Vorbereitung frisch jedes Mal,
	2% B-27 Ergänzung
	20 ng / ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF)
	20 ng epidermalem Wachstumsfaktor (EGF)
2,5% Glutaraldehyd	250 & mgr; l 50% Glutaraldehyd	Vorbereitung frisch jedes Mal,
	4750 ul 1x PBS
LacZ Waschlösung	0,5 ml 10% Desoxycholat (Endkonzentration 0,1%)	Lagerung bei 4 ° C.
	1,0 ml 100% NP-40 (Endkonzentration 0,2%)
	50 ml 10X PBS
	destilliertem Wasser auf 500 ml
X-gal-Färbung Lösung	1x Kaliumferrocyanid	Vorbereitung frisch jedes Mal,
	1x Kaliumferricyanid
	1 mg / ml X-gal
	mit LacZ Waschlösung geeignete Volumen
F9 RARE-LacZ Einfriermedium	F9 RARE-LacZ Kulturmedium + 5% DMSO	Vorbereitung frisch jedes Mal,

Tabelle 2. Arbeitspuffer und Lösungszusammensetzungen.

Diskussion

Die F9 RARE-LacZ - Zelllinie ¹⁴ ist ein leistungsfähiges System , das ^12,14,17,18 durch Gewebe Explantate für den Nachweis von RA erzeugt verwendet werden kann. Es ist empfindlich gegenüber RA - Konzentrationen so niedrig wie 100 fM, ohne unspezifische Reaktion in den Zellen unbehandelt mit RA ^12,14,18 nachgewiesen. Darüber hinaus reagieren die Reporterzellen zu all-trans - Retinsäure in linearer Weise innerhalb eines bestimmten Konzentrationsbereich, also die LacZ Reaktions ermöglicht verwendet quantifiziert und werden , um die Größe der RA Ebenen ^12,14,18 zu bestimmen. Die schnelle und einfache RA - Reportertest präsentiert hier nutzt die F9 RARE-LacZ - Reporterzelllinie für die Visualisierung (Abbildung 2) und relative quantitative Messung (Abbildung 3) von Embryonen und kultivierten adulten neuralen Stammzellen. Diese Reportersystem ermöglicht den Vergleich von endogenem RA Ebenen zwischen den einzelnen Proben, wie in Figur 2 gezeigt ist . Es ist empfindlich genug, um zu erkennen , RAerzeugt durch einzelne E8.5 - Embryonen (2A) als auch RA , hergestellt von kultivierten Neurosphären (2B). Die dosisabhängige Antwort dieser Zellinie zu Konzentrationen von RA Variation ermöglicht die Quantifizierung von RA Ebenen (3A) in den Proben als auch den Vergleich der relativen RA Ebenen zwischen den Proben (3B). Es ist wichtig, dass die F9 RARE Reporterzelllinie die Gesamtmenge an RA durch den Gewebeproben über die Zeit der Inkubation erzeugt misst beachten. Dies entspricht dem Netto-Saldo der RA-Synthese und Katabolismus.

Während die F9 RARE-LacZ Zelle Reportersystem hochempfindliche und vielseitig ist, gibt es mehrere kritische Schritte zur Fehlerbehebung, die wir aufgenommen, um haben die Zuverlässigkeit dieses Systems zu gewährleisten. Zunächst wird , wie in 1 gezeigt ist , ist es wichtig , um die Gesundheit dieser Zellen durch regelmäßige Passagen zu halten , ohne sie zu lassen gZeile bis zur Konfluenz. Zweitens haben wir beobachtet später neigen Passagen in inkonsistenten RA Reaktionen führen, auch wenn die Kulturen werden ständig unter Selektion mit G418 gehalten. Zur Behebung dieses wird empfohlen Kulturen nach 20 Passagen zu verwerfen und ein neues Fläschchen aufzutauen. Darüber hinaus müssen regelmäßige Kontrollen durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Reporterzellen noch stark Responder auf die Anwesenheit von RA in den Medien sind. Drittens, wenn die frühen Passagen zeigen schlechte oder ungleichmäßige Reaktion auf RA (1B, links), eine oder mehrere Runden von Subklonieren erforderlich sein können , bis starke Responder erhalten werden (Abbildung 1B, righ t). Schließlich vor Kultur CO-, wird empfohlen, dass Gewebeproben wie Embryonen und Neurosphären zu einzelnen Zellen dissoziiert sind. Wir haben gezeigt, dass die Dissoziation der Proben Ergebnisse in konsistenter farbmetrischen Messungen beobachtet. Dies kann zu einer gleichmäßigeren Verteilung von RA in den Kulturvertiefungen zurückzuführen sein, da die dissoziierten Zellen in uni sindFormular Kontakt mit den Reporterzellen.

Mehrere Modifikationen wurden auch dem ursprünglichen Protokoll ¹⁴ hergestellt. Zunächst RA Antwort der F9 RARE-LacZ - Zellen wurden durch direkt quantifiziert Fixierung der Zellen und die Absorption bei 610 nm gemessen wurde, statt Zellen zu sammeln und zu ¹⁴ Lysat für b-Galactosidase - Aktivität zu analysieren. Eine weitere Modifikation ist die direkte Co-Kultur von dissoziierten Proben mit F9 RARE-LacZ vor der Quantifizierung von RA Antwort. Bisherige Verfahren berichtet Proben getrennt Kultivierung und das Hinzufügen von nur die Medien aus diesen Kulturen bis F9 RARE-LacZ ^16,18.

Trotz seiner ist ein leistungsfähiges System, das F9 RARE-LacZ-Reportertest hat einige Einschränkungen. Eine Einschränkung dieses Reporterzelllinie ist, dass, obwohl es stark auf die Anwesenheit von all-trans-RA reagiert, es reagiert auch auf andere Retinoinsäureisomere einschließlich 9-cis-RA und 13-cis-RA; sie sind jedoch 100fach empfindlicher auf all-trans-RA compaRot zu den anderen Isomeren ^18. Eine weitere Einschränkung dieses Systems ist , dass die lineare Dosis-abhängige Reaktion nur zwischen 10 ^-13 M bis 10 ^-7 M RA ^at-14,18 fällt; Wenn also Vergleich RA Ebenen außerhalb dieser Grenzen, könnte es notwendig sein, eine serielle Verdünnung der Probe durchzuführen, bis die Messungen im linearen Bereich fallen. Schließlich, da dies in erster Linie ein kolorimetrischer Test, wird der Endpunkt der Farbentwicklung zwischen den Proben und Experimenten variieren. Somit ist es wichtig, dass eine Standardkurve immer für jeden einzelnen Versuch, um in parallel überzogen werden, der Reporterzellantwort zur Quantifizierung verwendet werden.

Zusammenfassend haben wir die Verwendung des F9 RARE-LacZ RA Reporterzelllinie berichtet RA Ebenen quantitativ E8.5 Embryonen und zuvor nicht in Neurosphären zu messen. Die Vielseitigkeit dieses Reportersystem kann die Quantifizierung von RA Ebenen in nahezu jeder Zelle oder Gewebetyp erlauben, und may führen zur Entwicklung von verschiedenen Anwendungen in der Zukunft.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
C3H/HeSn-Gpr161vl/J mouse strain	Jackson Laboratory	000316
F9 RARE-LacZ reporter cell line			from Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia)
DMEM/F-12 (with L-glutamine and HEPES)	ThermoFisher Scientific	11330-057
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified	ThermoFisher Scientific	26140-079	Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm in 37 °C for media preparation
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122	Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; light-sensitive
G418	ThermoFisher Scientific	10131-027	Store at 4 °C; light-sensitive
2% Gelatin	Sigma Aldrich	G1393	Store at 4 °C
B-27 supplement (2 % stock solution)	ThermoFisher Scientific	17504-044	Store at -20 °C in 1-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm at room temperature for media preparation
Murine Epidermal Growth Factor (EGF)	PeproTech	315-09	Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1xPBS; prepare working concentrations by diluting with 1x PBS; store at -20 °C
Murine Fibroblast Growth Factor (FGF)-basic	PeproTech	450-33	Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1x PBS; prepare working concentrations by diluting with 1x PBS; store at -20 °C
50% glutaraldehyde	Amresco	M155	Store at 4 °C
Sodium deoxycholate monohydrate (C24H39NaO4 · H2O)	Sigma Aldrich	D5670	Store at RT
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside)	Promega	V3941	Store stock at -20 °C
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	41639	Store at RT
all-trans Retinoic Acid (at-RA)	Sigma Aldrich	R-2625	Store 1 ml aliquots of stock in -80 °C; extremely sensitive to light
TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12605-010	Store at RT
0.25% trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific	25200-056	alternative to TrypLE Express; aliquot and store at -20 °C
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	ThermoFisher Scientific	14170-112	Store at 4 °C
10x phosphate buffered solution (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010-023	Store at 4 °C
Papain	Worthington	LK003176	Store at 4 °C.
Trypsin	Worthington	LS003703	Store in 1 ml aliquots at -20 °C.
Hyaluronic acid	Calbiochem	385908	Store 200 μl aliquots at -20 °C.
DNaseI	Worthington	LS002139	Store in 200 μl aliquots at -20 °C
Kynurenic acid	Sigma Aldrich	K3375	Store in 200 μl aliquots at -20 °C
95% ethanol
Mr. Frosty Freezing container	ThermoFisher Scientific	5100-0001
10 cm culture dish (non-cell culture treated)
10 cm culture dish (cell culture treated)
6 cm culture dish (non-cell culture treated)
96-well cell culture plates
1.5 ml microcentrifuge tubes
1.5 ml amber microcentrifuge tubes
1.5 ml cryovials
37 °C water bath
surgical scissors
fine surgical scissors
no. 5 forceps
blunt-ended forceps
scalpel blade
glass pasteur pipettes
cotton
alcohol lamp
ELISA plate reader
stereomicroscope