בשלב הדמיה כמוני מולטימודליות עם דיגיטלי הולוגרפי מיקרוסקופי מדויקת מעריך דלקת מעיים ו אפיתל ריפוי פצעים

Summary

Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.

Abstract

שכיחות מחלות מעי דלקתיות, כלומר, מחלת קרוהן וקוליטיס כיבית, גדל באופן משמעותי בעשור האחרון. האטיולוגיה של IBD נותרת עלומה ואסטרטגיות טיפוליות נוכחיות מבוססות על הדיכוי הנוקב של מערכת החיסון. פיתוח טיפולים שמתמקדים דלקת מעיים וריפוי הפצע אפיתל יכול לשפר באופן משמעותי וניהול של IBD, אך זה דורש זיהוי מדויק של שינויים דלקתיים. נכון לעכשיו, לתרופות פוטנציאליות בדרך כלל מוערכות באמצעות מודלים של בעלי חי in vivo או עם טכניקות המבוססות תרבות תאים במבחנה. בדיקה היסטולוגית בדרך כלל דורשת את התאים או רקמות של עניין להיצבע, אשר עשוי לשנות את מאפייני מדגם ויתר על כן, הפרשנות של ממצאים יכול להשתנות לפי מומחיות חוקרת. מיקרוסקופיה הולוגרפית הדיגיטלית (DHM), מבוסס על זיהוי של עיכוב מרחק אופטי, מאפשרתכתם ללא הדמיה בניגוד כמותית שלב. זה מאפשר את התוצאות להיות מתואמים ישירות עם פרמטרים biophysical מוחלט. אנו מדגימים כיצד מדידת שינויים בצפיפות רקמה עם DHM, המבוססת על מדידה מקדמת שבירה, יכולה לכמת שינויים דלקתיים, ללא כתמים, בשכבות שונות של דגימות רקמה גסות מעכברים ובני אדם עם קוליטיס. בנוסף, אנו מדגימים ניטור ללא תווית multimodal רציפה של ריפוי פצע אפיתל במבחנה, אפשרית באמצעות DHM באמצעות הקביעה האוטומטית הפשוטה של האזור הפצוע ונחישות סימולטני של פרמטרים מורפולוגיים כגון מסה יבשה ועובי שכבת תאים נודדים. לסיכום, DHM מייצג כלי רב ערך, רומן וכמותיים להערכת דלקת מעיים עם ערכים מוחלטים עבור פרמטרים מותרים, כימות פשוטה של ריפוי פצע אפיתל במבחנה ולכן יש פוטנציאל גבוה u אבחון translationalse.

Introduction

מחלות מעי דלקתיות (IBD), כלומר, קוליטיס כיבית (UC) ומחלת קרוהן (CD) הם מחלות דלקתיות אידיופטית של מערכת העיכול ^1. מחקר לתוך הפתופיזיולוגיה הבסיסית של IBD והערכה תרופות פוטנציאליות חדשות או גישות אבחון חדשות ומתקדמות במיוחד בעל חשיבות. בשני המחקר הבסיסיים בניהול הקליני של חולי IBD, רירית המעי הפכה למוקד של תשומת לב ^2,3. רירית מייצג גבול אנטומיים, שבו יחסי הגומלין בין חיידקים commensal, תאי אפיתל מרכיבים תאיים שונים של מערכת החיסון במעי לתזמר הבטן הומאוסטזיס ^4,5. עם זאת, בחולים במחלות מעי דלקתיות, דלקת מעיים בלתי מבוקרת ומתמשך מוביל הרירית נזק, לזיהוי כמו כיבים או היצרות, אשר בסופו של דבר יכול להגיע לפסגה בתוך התפלגות תפקוד המחסום אפיתל, שבעצמה מחריף המקומי דלקת ^6.

אפיתל ריפוי פצעים לכן חיוני להתחדשות אפיתל הבא דלקת אך גם דרישת ליבה עבור ההחלמה של כיבים במערכת עיכול או דליפת anastomotic לאחר עיכול ניתוח ^7. אפיתל ריפוי פצע ניתן לדמות ב פצע במבחנה בריפוי מבחנים במודלי Murine של דלקת מעי ^8,9. הוא במבחנת in vivo יש גישות חסרונות, המגבילים את הדיוק של הערכת ניסוי. ב מבחני חוץ גופייה, כמו מבחני שריטה קלסיים, דורשים נהלים מכתימים ממושכים או transfection עם chromophores ניאון. הם מוגבלים לעתים קרובות על ידי התפשטות הניטור של תאים הרציף שלהם והגירו כי לא יכול להיות אוטומטית ^10. מודלים בשנת vivo, כגון נתרן סולפט dextran (DSS) קוליטיס -induced, לעתים קרובות חסר-outs לקרוא חזק, בין שאר בשל הווריאציה המשמעותית לראות בסמני מעבדה, maמלך כגון סמנים ראויים להעריך חומרת קוליטיס ^11,12. ניתוח היסטולוגית של הרירית המוסתת כרגע עדיין הגישה התקפה ביותר כדי לקבוע חומרת קוליטיס אבל זה, כמו במבחנת מבחני ריפוי פצע אפיתל, דורש מכתים והוא תלוי המומחיות של חוקר ^13.

לאחרונה מיקרוסקופיה הולוגרפית דיגיטלי (DHM), נגזרת של מיקרוסקופיה שלב כמותי ^14, זוהה כלי שימושי להערכת ריפוי פצעים אפיתל במבחנה ובחי ^15. DHM מאפשר הערכה של צפיפות רקמת ידי מדידת עיכוב מרחק אופטי (OPD) , ^16-18 וכימותי שינויים ברקמה המתלווה לדלקת ¹⁹ אשר אבחן רומן סרטן הסיכויים. בנוסף, DHM מאפשר ניטור של דינמיקת מורפולוגיה תאים על ידי קביעת עובי תא, שטח פן מכוסה תא תאי כמות תוכן (חלבון) ^{15,20. ב מבחני חוץ גופית, DHM גם מאפשרת ניתוח של תהליכים פיזיולוגיים, למשל, חדירות מים הסלולר על ידי הערכת שינויים נפח תא ועובי 21,22. יתר על כן, מדידות DHM יכולות להיות אוטומטיות המונעת הטיה במדגם קשור חוקרת.}

הנה, אנחנו מדגימים את השימוש DHM במודל Murine של דלקת מעיים, וגם ליישם DHM ניתוח של דגימות רקמות אדם לניטור כמותי של ריפוי פצעים כמו assay ללא תווית במבחנה. ראשית, אנו מעריכים שינויים דלקתיים של שכבות קיר גסות שונות בעכברי colitic וחתכי רקמות מבני אדם עם IBD. לאחר שתיאר את ההליך בשלב הדמיה כמותי DHM, אנו מספקים הנחיות מפורטות לשימוש מרכיבי מיקרוסקופ, הכנת קטעי רקמה וגם לתאר את ההערכה של תמונות שלב כמותית רכשה.

לאחר מכן, אנו מראים כי DHM יכול להיות UTIlized לניטור multimodal רציף של ריפוי פצעים אפיתל במבחנה, ולתאר את ניתוח מאפיינים הסלולר כמו עובי שכבת תאים, מסה יבשה ונפח הסלולר לתת תובנה שינויי תא תרופה מושרה ואת פיסיולוגי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת האתיקה האזורית (Landesamt für נאטור, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, גרמניה) על פי חוק צער בעלי חיים הגרמני. ועדת האתיקה המקומית של אוניברסיטת מינסטר אישר את השימוש ברקמות אנושיות לניתוח היסטולוגית ומיקרוסקופ.

1. בעלי חיים וחומרים

1. השתמש נקבה או עכברי זכרים של זן DSS-רגיש נדרש השוקלים 20 עד 25 גר ', ואת הבית על פי חקיקת טיפול בבעלי החיים מקומית. ספק צ'או מיוחד עבור מכרסמים autoclaved שתיית כרצונך מים.
2. להשרות קוליטיס DSS חריפה על ידי מתן 3% w / v נתרן גופרתי dextran (DSS, משקל מולקולרי: 36,000-50,000 Da) במי ברז autoclaved במשך 5 ימים.
   הערה: עוצמת DSS היא משתנה מאוד בהתאם ליצרן יצווה. בדיקת DSS הספק שסופק על-ידי שלך הראשון לזירוז פעילות המחלה, עבורו daמשקל גוף ily הוא אינדיקטור אמין ואובייקטיבי.
3. לקבלת ערכה היסטולוגית של דגימות רקמה גסות, להרדים עכברים ידי הֲפָחָה CO ₂ (או כפי שצוין על ידי הנחיות לאומיות ומוסדיות) בסוף הניסוי.

2. התקנה ניסיונית-קוליטיס DSS ו חוץ-גופית Wound מבחני ריפוי

1. תרבות הקמת תא של assay ריפוי הפצע.
   1. לגדל תאי קאקו-2 ב לחות 95% ו 5% CO ₂ בסביבה על 37 מעלות צלזיוס. השתמש בינוני RPMI עם 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין.
   2. זרע קאקו-2 תאים בצפיפות של 4 x 10 ⁵ תאים / ² ס"מ על 35 מ"מ צלחות פטרי עם תרבות-הכנס גבוה (ראה תרשים 4 א).
      הערה: הכנס יוצר שני באזורים מכוסי תא כי הם מופרדים עם רווח חינם תא מוגדר המייצג את האזור הפצוע להיות מנותח.
   3. שנה בינונית יומיים לאחר seedinז. בצע על ידי aspirating בינוני שיורית הראשונה עם תא פסולת באמצעות פיפטה אוטומטית, לשטוף עם 100 μl של בופר פוספט (PBS) ולהוסיף בינוני RPMI טרי או בינוני מקופח סרום.
   4. התרבות תאים עבור 24 שעות במדיום סרום מקופח (0.1% FBS) בתוספת 20 בסרום ng EGF / מ"ל ​​או 2 מיקרוגרם mitomycin ג / מ"ל ​​סרום כדי לזהות שינויים בהתנהגות ריפוי הפצע. הוסף בינוני RPMI רגיל לשלוט תאים למשך 24 שעות.
   5. לאחר 24 שעות של תרבות, להסיר ולסלק מוסיף תרבות כמתואר בשלב 3.4 ולבצע DHM.
2. אינדוקציה של קוליטיס DSS החריף
   1. ממיסים 3 גרם של DSS 100 מ"ל autoclaved מים כדי לקבל 3% (w / v) פתרון DSS. לספק פתרון זה במקום שתיית מים כרצונך עכברים למשך 7 ימים. חישוב 5 מ"ל של פתרון DSS לכל עכבר / יום. לספק מי autoclaved ללא DSS עבור עכברי שליטה כרצונך.
3. הכנה סעיפי cryostatic של murine ומעי גס אנושי
   1. להרדים עכברים ידי הֲפָחָה CO ₂ בסוף הניסוי.
   2. לנתח את הבטן בבעלי החיים על ידי laparotomy ^23. הסר את המעי הגס כולו באמצעות פינצטה בזהירות לחתוך את הקצה ileal רקטלית באמצעות מספריים כירורגיות. חותכים את המעי הגס עם מספריים longitudinally מן cecal עד הסוף רקטלית ולפתוח את המעי הגס. הסר את כל הצואה מן הדגימה באמצעות פינצטה ואחריו שטיפה עם PBS ^24.
   3. הכן לחמניות שויצריות ב לגלגל את המעי גס כולו עם כותנת ניצן longitudinally מן cecal עד הסוף רקטלית עם הרירית המעוקלת פנימה. שבץ דגימות גסות חיתוך טמפרטורה אופטימלית (אוקטובר) מתחם והישאר קפוא ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
   4. הטמע רקמה גסה אנושית דגימה כירורגית במתחם אוקטובר טמפרטורת חיתוך אופטימלי והישאר קפוא ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
   5. קטעי Cut של 7 מיקרומטר עובי של דגימות אוק-מוטבע-מתחם עם העזרה של cryotoלי ממש לפני הבחינה.
      ההערה: עובי המדגם האופטימלי תלוי התמדת תכונות הפיזור של סוג הרקמה תחת חקירה. עבור הניסויים שתוארו באמצעות רקמת המעי הגס, פרוסה בעובי> 10 מיקרומטר הגורם לעלייה משמעותית רעש בשל פיזור אור בתמונות בניגוד שלב כמותית DHM, בעוד דגימות של עובי <5 מיקרומטר להראות סיכון גבוה יותר בחיפוש אחר כלים המושרה נזק מתהליך חיתוך קריו.
   6. עבר מדורים לשקופית מובילה אובייקט זכוכית.

3. טכני ציוד, תוכנה ונהלים עבור רכישה והערכה של הולוגרמות הדיגיטלי

1. מיקרוסקופ הולוגרפי הדיגיטלי הדמית תאים ורקמות כמוני
   1. השתמש במערכת מיקרוסקופ הולוגרפי דיגיטלית מחוץ ציר מאך-זנדר הדמיה תא חי ^25, כפי שמוצג באיור 1. ודא מיקרוסקופ מצוידעדשת מיקרוסקופ 10X, הבמה מיקרוסקופ עם בעל לשקפים מובילים אובייקט זכוכית צלחות פטרי בקוטר של 35 מ"מ, תא חימום לשמר טמפרטורה פיזיולוגית על 37 מעלות צלזיוס ותוכנות הדמית שלב כמוני ^25.
      הערה: לדוגמה, כמתואר קמפר ואח ²⁶ ו Langehanenberg ואח ^27...
      הערה: לחלופין, להשתמש במערכת דומה כי הוא מסוגל לבצע מיקרוסקופ שדה בהיר בשלב הדמיה כמותי של תאי חיים ומגלשות רקמות גזורות.
   2. עדשת קבל מיקרוסקופ נקי עם נייר ניקוי עדשת חומר ניקוי (למשל, אתנול) כפי מומלץ על ידי היצרן של מיקרוסקופ כדי להסיר אבק או זיהומים אחרים.
   3. הפעל את תוכנת רכישת תמונה של המיקרוסקופ DHM, לבחור במצב הדמיה "שדה בהיר" בורר "על" תאורת אור לבנה. ודא קוהלר-illumination של המדגם כפי מומלץ על ידי יצרן מיקרוסקופ תוך שמירה על המדגם בחלון הדמית החיה של תוכנת רכישת תמונה (לחלופין תוכנת רכישת תמונה רגילה יכולה לשמש בשלב זה).
      הערה: עוצמת התמונה צריכה להיות מופצת בצורה הומוגנית בתוך שדה הראייה ואת המיקום המדגם לא צריך לזוז במהלך refocusing האופטי עם כונן המוקד של המיקרוסקופ.
   4. "DHM" בחר במצב הדמיה, להפוך "את" תאורת אור לבן מתג "על" אור הליזר. בדוק כי התאורה עם אור לייזר הוא הומוגני (כלומר, כי עוצמת האור מופץ בצורה הומוגנית בחלון הדמיה חיה של התוכנה הרכישה הדמיה של המיקרוסקופ DHM) ולבחון כי דפוס פרינג הפרעה המוביל מחוץ ציר מופיע עם ניגודיות נאותה תמונות שנתפסו (הולוגרמות דיגיטלית).
2. הכנת סעיפי cryostat הדמיהעם DHM
   1. קח המדגם (סעיף cryostat על מנשא אובייקט זכוכית, עובי: 7 מיקרומטר, כמתואר 2.3) מהמקפיא. הפשר את המדגם עבור כ -5 דקות ב RT ואווירה נורמלית.
   2. להוסיף 50 - 100 μl פוספט בופר (PBS) כמו הטבעה בינונית על קטע הרקמות בעזרת פיפטה עד שהוא מכוסה לגמרי עם חיץ. מכסה את המדגם עם תלוש כיסוי זכוכית נקיה (עובי זכוכית 170 מיקרומטר).
      הערה: מעל ייבוש יכול לגרום לשינויים משמעותיים של מקדם השבירה ומאפיינים פיזור של המדגם.
   3. ודא התחתון של מוביל הזכוכית להחליק את המכסה מנקה מפני אבק וזיהום אחר שעלולה לגרום פיזור אור. המדגם הוא מוכן לחקירה עם מיקרוסקופ שדה בהיר DHM.
3. בשלב הדמיה כמותי של סעיפי רקמה עם DHM
   1. הפעל את מיקרוסקופ הולוגרפי הדיגיטלי, לבחור את עדשת מיקרוסקופ 10X הדמיה. הפעל את iרכישת תוכנה קוסמת של המיקרוסקופ DHM ובחר במצב הדמית קובץ בהיר.
   2. מניח את שקף הרקמות כמתואר 2) מחזיק שקופיות מיקרוסקופ, עם להחליק את המכסה מול המטרה מיקרוסקופ.
   3. חלף "על" התאורה בשדה הבהירה של המיקרוסקופ DHM. מקם את המדגם עם הבמה מיקרוסקופ ולהבטיח כי באזור הרקמה של עניין גלוי בחלון ניטור בזמן אמת. לשפר את החדות של התמונה באמצעות כונן המיקוד של מיקרוסקופ.
      הערה: כמו גם השטח של עניין, על שטח של שקופיות ללא רקמה צריכה גם להיות נוכחת שדה הראייה.
   4. לכידת תמונה בשדה בהירה של המדגם הממוקד בחדות באמצעות תוכנת רכישת תמונה.
   5. "DHM" בחר במצב הדמיה, להפוך "את" הארת האור הלבנה ולהפוך "על" הארת ליזר האור. בחר את "זמן החשיפה" להקלטת הולוגרמה מתחת ל -3 msec, להבחין כי holographic מחוץ ציר בשולי הפרעה להופיע עם ניגודיות נאותה בחלון הדמית החיה של תוכנת רכישת הדמיה וללכוד הולוגרמה דיגיטלית.
   6. חזור על שלבי 3.3.3 - 3.3.5 עד מספר מספיק של תמונות שדה בהירות הולוגרמות דיגיטלית של אזורי מדגם השונים הוקלט. רכישת הולוגרמה הושלמה.
4. הכנת מבחני ריפוי פצעים הדמיה DHM
   1. הפעילו את תא חימום צלחת פטרי של המיקרוסקופ DHM על 1 - 3 שעות לפני תחילת הניסוי כדי להבטיח תנאי טמפרטורה יציבה במהלך המדידות DHM.
   2. הכן שולחן העבודה עם הציוד הדרוש (צלחת פטרי עבור assay ריפוי הפצע מתואר 2.3): טפטפות, פינצטה, מכסה זכוכית עבור צלחת פטרי, 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) שנאגרו תרבית תאים בינוניים עם פיזיולוגיים טמפרטורה (37 מעלות צלזיוס) במשך הכנת המדגם בסביבה סטרילית.
      הערה: בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) מורכב 10% עוברית להמליט בסרום (FCS), 20 מ"מ HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic חומצה), ו -850 מ"ג / L NaHCO _3.
   3. הסר את מכסה הפלסטיק מצלחת פטרי ולהסיר את תרבית תאים בינוניים עם טפטפת. הסר את הסוגר מלמטה צלחת פטרי באמצעות פינצטה.
   4. לשטוף את המדגם 1 - 2 פעמים עם 1 HEPES בינוני מ"ל תרבית תאים שנאגרו על מנת להסיר תאים מתים מרכיבים תאיים הנותרים (למשל, סרום) באזור הפצע. הוסף 2 מ"ל HEPES תרבית תאים בינוניים שנאגרו מכסה את צלחת פטרי עם מכסה זכוכית.
   5. ודא כי מכסה הזכוכית וחלק תחתון צלחת פטרי נוקו מפני אבק וזיהום אחר. לדוגמא מוכנה תצפית זמן לשגות עם DHM.
5. ניטור רציף multimodal של ריפוי פצעים במבחנה עם DHM
   1. הפעילו את תא חימום צלחת פטרי של המיקרוסקופ DHM על 1 - 3 שעות לפניתחילת הניסוי כדי להבטיח תנאי טמפרטורה יציבה במהלך המדידות DHM.
   2. חלף "על" מיקרוסקופ הולוגרפי הדיגיטלי, בחר את עדשת 10X מיקרוסקופ הדמיה. הפעל את תוכנת רכישת תמונה של המיקרוסקופ DHM ובחר במצב הדמיה "שדה בהיר". ודא כי תא חימום צלחת פטרי פועל בטמפרטורה פיזיולוגית (37 מעלות צלזיוס).
   3. מניחים את צלחת פטרי עם assay ריפוי הפצע, הכין כמתואר 4), בתא חימום של המיקרוסקופ DHM.
   4. בחר מצב הדמיה בשדה בהיר ומקם את המדגם עם הבמה מיקרוסקופ תוך התבוננות אותו בחלון ניטור בזמן אמת של התוכנה רכישת התמונה של המיקרוסקופ DHM. שים לב כי האזור הרצוי של המדגם מופיע ממוקד בחדות תחת תאורה של אור לבן.
   5. צלם תמונות שדה בהירות של אזורים השונים של המדגם (אזור הפצע או בסביבותיה עם תאים ומחוברים) תחת לבןתאורת אור עם תוכנת רכישת תמונה ומראה מסמך, צפיפות תאים והומוגניות.
   6. "שדה בהיר" בחר במצב הדמיה של המיקרוסקופ DHM. בחר אזור הפצע מתאים תחת תאורה אור לבן בחלון ניטור בזמן אמת עם תוכנת רכישת התמונה של המיקרוסקופ DHM. ודא שאזור הפצע הוא ללא תאים מתים ולא שרידים בסרום, ולהבטיח כי שני הצדדים כוללים שכבת תאים הומוגנית אחת, רצוי עם גבולות ישר.
   7. לכידת תמונת אור לבנה של אזור הפצע הראשוני במצב הדמיה בשדה בהיר עם תוכנת רכישת תמונה של המיקרוסקופ DHM.
   8. הפעל "off" תאורה אור לבן, בחר "DHM" מצב מתג "על" תאורת לייזר. בחר זמן חשיפה של מתחת ל -3 msec עבור הולוגרמה הקלטה (להבחין כי בשולי הפרעה מחוץ ציר הולוגרפית להופיע עם ניגודיות נאותה בחלון הדמית החיה של תוכנת רכישת תמונה של Tהוא DHM מיקרוסקופ) וללכוד הולוגרמה דיגיטלית.
   9. לכידת הולוגרמה מדגם במצב DHM עם תוכנת רכישת התמונה משחזרת תמונה שלב כמותית עם תוכנת שחזור של המיקרוסקופ DHM כדי לבדוק את איכות התמונה.
   10. בחר השהיית זמן מתאים (למשל, 3 - 5 דקות) לרכישת הולוגרמה זמן לשגות עם תוכנת רכישת התמונה של המיקרוסקופ DHM.
   11. בחרו במצב רכישת זמן לשגות של התוכנה רכישת התמונה שבה המדגם הוא מואר רק עם אור לייזר במהלך הרכישה הולוגרמה.
   12. התחל התצפית DHM זמן לשגות של assay ריפוי הפצע.
   13. עצור את רכישת זמן לשגות לאחר הזמן המיועד, לבחור במצב הדמיה בשדה בהיר ולתעד את המראה הסופי של המדגם תחת הדמיה אור לבן.
6. לשחזר הולוגרמות דיגיטלית של רקמות גזורות ולקבוע את מקדם השבירה הממוצע כפרמטר לכמתצפיפות רקמה
   1. לשחזר תמונות שלב כמוני מן הולוגרמות הדיגיטלית של רקמות גזורות עם התוכנה של המיקרוסקופ DHM, למשל, כמתואר קמפר et al. ²⁶ ו Langehanenberg et al. ^27.
   2. קבע את ניגוד שלב ממוצע Δφ בשכבות רקמות שונות (אפיתל, submucosa, stroma) באזורים נבחרו כראוי אינטרסים (ROIs) ^19.
   3. קבע את מקדם השבירה של מדיום ההטבעה באמצעות refractometer או לחלופין באמצעות ערך מתאים מהספרות. (ערכי מקדם שביר עבור תקשורת הטבעה אופיינית: n _מים = 1.334 ^28, n _{בופר פוספט (PBS)} = 1.337 ^29, n _{תא בינוני תרבות} = 1.337-1.339 ^29,30).
   4. חשבתי את המדדים השבירים של שכבות רקמה שונות לעומת שלב ממוצע ערכי ¹⁹
      (1)
      הערה: ב EQ. 1 λ הוא אורך הגל של אור הליזר (כאן: λ = 532 ננומטר), D העובי של רקמות הגזורות (כאן: 7 מיקרומטר) ו- n _המדיום הוא מקדם השבירה של מדיום ההטבעה (כאן: n _בינוני = n _PBS = 1.337, שייקבע על ידי אבה-Refractometer).
7. לשחזר ולהעריך הולוגרמות דיגיטלית מן לשגות זמן ריפוי פצע תצפית סדרה
   1. לשחזר תמונות שלב כמותית מסדרת הולוגרמה הזמן לשגות שהושגה במהלך תצפית ריפוי פצע עם תוכנת מיקרוסקופ DHM ^26,27.
   2. נרמל כל סדרה של תמונות שלב כמותית לדימוי עם ניגודיות שלב מקסימלית.
   3. קבע את התחום _ג S כי הוא מכוסה על ידי התאים את התמונות בשלב DHM כמותית על ידי פילוח תמונה, אשר יכול להיות לכלנוצר באמצעות מאבחן תא תוכנה חופשית (www.cellprofiler.org ^31).
   4. חשבתי את ניגוד שלב הממוצע של _התא בתאי Δφ ב _ג באזור S.
   5. תחזר את DM המסה היבש הסלולר _מתא Δφ בניגוד שלב ממוצע התחום _ג S ¹⁵
      (2)
      הערה: המשוואה 2 DM מציין את המסה היבשה הסלולר, _ג S מציג את האזור כי היא נכבשה על ידי התאים α = 0.002 מ ^'2 / קילו.
   6. קבע את _התא מקדם השבירה n הסלולר אינטגרלי ואת מקדם השבירה של _המדיום n תרבית תאים בינוניים. לקבוע _תא n בנפרד באופן ניסיוני מתאי מושעה כמתואר ³⁰ ולמדוד _בינוני n עם refractometer. Alternaבקנייה להשתמש בערכי ספרות עבור _תא n ³⁰ ו n ^29,30 _{בינוני.}
   7. חשב את _התא ד עובי התא הממוצע מ λ, _תא Δφ, n _התא n _בינוני ^26,32
      (3)
      הערה: ב EQ. 3 _תא הפרמטר d הוא עובי התא הממוצע, λ מציין את אורך גל האור של אור הליזר, _תא Δφ מציין את ניגוד השלב הממוצע, ו- n _תא n _בינוני הם מקדמים שבירת הסלולר האינטגרלי ואת מקדם השבירה של המדיום שמסביב.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

התקנה טיפוסית הדמיה DHM עבור דיגיטלי הולוגרפי מיקרוסקופית (DHM)

כדי לבצע הדמיה בשדה בהיר והדמיה בניגוד שלב כמותית DHM, אנחנו מוחלים מיקרוסקופ הפוכה כמתואר ב איור 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

אנו מראים כי DHM מספק הערכה מדויקת של ניזק היסטולוגית במודלים קוליטיס בעכברי דגימות רקמה גסה אנושיות vivo לשעבר. יתר על כן, אנו לראות DHM יכול לפקח ריפוי פצע אפיתל ברציפות תוך מתן מידע multimodal זמנית על שינויים הסלולר. ב DHM, השחזור של הולוגרמות שנתפסו דיגיטלי מבוצע ³²

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Azoxymethane (AOM)	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	A5486
Cell Culture Flask	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	658170
Costar Stripette	Corning Inc., New York, USA	4488
Dextran sulphate sodium (DSS)	TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden	DB001
DMEM/Ham's F12	PAA Laboratories - Pasching - Austria	E15-813
EGF	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	SPR3196
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	E 9884
Falcon Tube 50 ml	BD Biosciences, Erembodegem, Belgium	352070
Isopentane (2-Methylbutane)	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	M32631-1L
Methylene blue	Merck, Darmstadt, Germany	1159430025
Mitomycin C	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	M4287
Microscope Slides	G. Menzel, Braunschweig, Germany	J1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek compound	Sakura, Zoeterwonde, Netherlands	4583
Pen/Strep/Amphotericin B	Lonza, Verviers, Belgium	1558
Phosphate buffered saline, PBS	Lonza, Verviers, Belgium	4629
RPMI 1640	Lonza, Verviers, Belgium	3626
Sodium Chloride 0.9%	Braun, Melsungen, Germany	5/12211095/0411
Standard diet	Altromin, Lage, Germany	1320
Tissue-Tek Cryomold	Sakura, Leiden, Netherlands	4566
Trypsin EDTA	Lonza, Verviers, Belgium	7815
Vitro – Clud	R. Langenbrinck, Teningen, Germany	04-0002
µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high	ibidi GmbH, Munich, Germany	81176
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert	ibidi GmbH, Munich, Germany	80050
Equipment
MICROM HM550	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA	46320
Digital holographic microscope
Component	Model	Company
Inverted Microscope	iMIC	Till Photonics, Graefelfing, Germany
Laser	Compass 315M	Coherent GmbH, Luebeck, Germany
Microscope lens	Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3	Zeiss, Goettingen, Germany
CCD camera	DMK 41BF02	The Imaging Source, Bremen, Germany