JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.

Özet

Örneğin, iltihabik bağırsak hastalığı, sıklığı, Crohn hastalığı ve ülseratif kolit, son yıllarda önemli ölçüde artmıştır. IBD etyolojisi bilinmemektedir ve mevcut tedavi stratejileri bağışıklık sisteminin baskılanması belirsiz dayanmaktadır. Özellikle belirgin IBD yönetimini geliştirmek olabilir bağırsak iltihabı ve epitel yara iyileşmesini hedefleyen tedavilerin geliştirilmesi, ancak bu iltihabi değişikliklerin doğru bir algılama gerektirir. Şu anda, potansiyel ilaç adayları, genellikle in vivo veya in vitro hücre kültürü bazlı tekniklerle hayvan modelleri kullanılarak değerlendirildi. Histolojik muayene genellikle örnek özelliklerini değiştirebilir ve ayrıca, bulguların yorumlanması araştırmacı uzmanlığı ile değişebilir hücreleri veya ilgi dokulara lekeli olması gerektirir. Dijital holografik mikroskobu (DHM), optik yol uzunluğu gecikme tespitine dayanan sağlar,leke bırakmayan kantitatif faz kontrast görüntüleme. Bu sonuçlar, doğrudan mutlak biyofizik parametreleri ile ilişkili olduğu için izin verir. Bu kırılma endeksi ölçümü göre DHM doku yoğunluğundaki değişiklikler ölçümü, kolitli farelerin ve insanlardan elde edilen kolon doku örneklerinin farklı tabakalarda, boyama olmaksızın, iltihaplı değişiklikler ölçmek için gösterilmektedir. Ayrıca, bu tür kuru kütle ve göç hücrelerin tabaka kalınlığı gibi yaralı alan ve morfolojik parametrelerin eş zamanlı tayini basit otomatik belirlenmesi yoluyla DHM kullanılarak in vitro mümkün epitel yara iyileşmesi sürekli multimodal etiket ücretsiz izleme göstermektedir. Sonuç olarak, DHM değerli, roman ve kantitatif aracı olası parametreler için mutlak değerler ile bağırsak iltihabı değerlendirilmesi için, in vitro epitel yara iyileşmesinin basitleştirilmiş miktarının temsil ve bu nedenle öteleme tanı u için yüksek bir potansiyele sahiptirse.

Giriş

İltihaplı bağırsak yani hastalığı (IBD), ülseratif kolit (UC) ve Crohn hastalığı (CD), mide bağırsak 1 idiopatik enflamatuar hastalıklardır. IBD altta yatan patofizyoloji ve potansiyel yeni ilaçlar ya da yeni tanı yaklaşımları değerlendirmeye Araştırma özellikle önem taşımaktadır. Hem temel araştırma ve İBH hastalarının klinik yönetiminde, bağırsak mukoza dikkat 2,3 odağı haline gelmiştir. Mukoza bakterilere, epitel hücreleri, bağırsak, bağışıklık sisteminin çeşitli hücre bileşenleri arasındaki etkileşim bağırsak 4,5 homeostazı orkestra hangi anatomik sınırları temsil etmektedir. Ancak, İBH hastalarında, kontrolsüz ve kalıcı bağırsak iltihabı nihayet kendisi yerel inflamasyon 6 sinirlendiren epitel bariyer fonksiyonunun bozulması ile sonuçlanacak olabilir ülserasyonlar veya darlık gibi algılanabilir hasarı, mukozal yol açar.

epitel şifa inflamasyon aşağıdaki epitel rejenerasyonu için bu nedenle çok önemlidir ama aynı zamanda gastrointestinal cerrahi 7 sonrasında gastrointestinal ülser veya anastomoz kaçağı iyileşmesi için temel gereklilik olduğunu yara. Epitel şifa deneyleri şifa in vitro yara simüle ve bağırsak iltihabı 8,9 sıçan modellerinde olabilir yara. Hem in vitro ve in vivo yaklaşımlar deneysel değerlendirmenin doğruluğu sınırlayan sakıncaları var. In vitro deneyleri, klasik çizik deneyleri gibi, floresan kromoforlar ile uzun süren boyama yöntemleri veya transfeksiyon gerektirir. Genellikle 10 otomatik olamaz hücre proliferasyonu ve göçü devamlı olmayan izleme ile sınırlıdır. Dekstran sodyum sülfat (DSS) bağlı kolit in vivo modeller, sık olarak görülen önemli değişiklik, kısmen dayanıklı okumaları eksikliği laboratuvar belirteçleri de, mauygunsuz kral gibi belirteçler kolit şiddetini 11,12 değerlendirmek için. Iltihaplı mukozasında histolojik analiz şu anda hala kolit şiddetini belirlemek için en geçerli yöntemdir ancak bu, in vitro epitel yara iyileşme deneyleri gibi, boyama gerektirir ve araştırmacının uzmanlık 13 bağlıdır.

En son dijital holografik mikroskobu (DHM), kantitatif faz mikroskobu 14 bir varyantı, in vitro ve in vivo 15 epitel yara iyileşmesinin değerlendirilmesi için yararlı bir araç olarak tespit edilmiştir. DHM (OPD) optik yol uzunluğu gecikme ölçümü doku yoğunluğunun değerlendirilmesini sağlar hangi umutları yeni kanser tanısı 16-18 ve inflamasyon ile ilgili doku değişikliklerinin 19 ölçümü. Ayrıca, DHM hücre kalınlığı, hücre kaplı yüzey alanı ve hücre içi (protein) içerik miktarının belirlenmesi ile hücre morfolojisi dinamikleri izlenmesine olanak sağlar 15,20. İn vitro tahlillerde, DHM fizyolojik süreçleri, örneğin, hücre hacmi ve kalınlık 21,22 değişimlerinin değerlendirilmesiyle hücresel su geçirgenliğinin analiz edilmesini sağlar. Ayrıca, DHM ölçümleri araştırmacı-ilişkili örnek önyargı engeller otomatik hale getirilebilir.

Burada, bağırsak iltihabı bir murin modelinde DHM kullanımını göstermek ve ayrıca bir etiket içermeyen in vitro deneyi olarak yara iyileşmesi kantitatif kontrolü için, insan doku numuneleri analizlerine dhm uygulanır. İlk olarak, IBD insanlardan, kolitli farelerin ve doku bölümleri farklı kolon duvar tabakalarının enflamatuar alterasyonların değerlendirir. DHM kantitatif faz görüntüleme işlemini anlattıktan sonra, biz edinilen sayısal faz görüntüler değerlendirilmesini tarif de mikroskop bileşenleri, doku kesitlerinin hazırlanması ve kullanımına ilişkin ayrıntılı yönergeler sağlar.

Daha sonra, DHM UTI olabileceğini göstermekin vitro epitel yara iyileşmesi sürekli multimodal izlenmesi için lized ve hücre tabakası kalınlığı, kuru kütlesinin ve hücresel hacmi gibi hücresel özelliklerinin analizini açıklar ilaca bağlı ve fizyolojik hücre değişiklikler hakkında fikir verir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Alman Hayvanları Koruma Kanunu uyarınca, bölgesel etik kurul (Landesamt für Natur, Çevre und Verbraucherschutz, LANUV, Almanya) tarafından onaylanmıştır. Münster Üniversitesi yerel etik kurul histolojik ve mikroskop analizi için insan dokularının kullanılmasını onayladı.

1. Hayvanlar ve Malzeme

  1. Yerel hayvan bakımı mevzuatına göre kadın ya da 20 gr 25 tartmak gerekli DSS-duyarlı suş erkek fareler ve evin kullanın. Kemirgenler için özel chow sağlamak ve su ad libitum içme otoklava.
  2. Otoklavlanmış musluk suyu ile 5 gün: dekstran sülfat sodyum (36,000-50,000 Da DSS, molekül ağırlığı) ağırlık / hacim% 3 uygulanmasıyla, akut DSS kolit başlatmak.
    NOT: DSS gücü üretici ve toplu bağlı oldukça değişkendir. , Hastalık aktivitesinin uyarılması için ilk tedarikçisi tarafından sağlanan DSS test hangi da içinily vücut ağırlığı, güvenilir ve objektif bir göstergedir.
  3. Kolon doku örneklerinin histolojik değerlendirme için, deney sonunda CO 2 insuflasyon (veya ulusal ve kurumsal rehberlere tarafından belirtildiği gibi) fareler euthanize.

2. Deneysel Kurulum DSS-kolit ve In-vitro Yara İyileşmesi Tahliller

  1. Hücre kültürü ve yara iyileşmesi testinin kurulması.
    1. 37 ° C'de% 95 nem ve% 5 CO2 ortamında Caco-2 hücreleri, büyütün. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile RPMI ortamı kullanın.
    2. Yüksek kültür eki ile 35 mm Petri tabaklarda 4 x 10 5 hücre / cm2 yoğunluğunda Tohum Caco-2 hücreleri (bkz, Şekil 4A).
      NOT: insert yaralı bölgeyi temsil eden tanımlanmış hücre boş alan analiz edilecek ayrılmış iki hücre kaplı alanları oluşturur.
    3. iki gün sonra, ortam seedin değiştirmeörn. Önce, otomatik pipet kullanılarak hücre artıkları ile arta kalan ortam aspire gerçekleştirmek fosfat tamponlu tuzlu su, 100 ul (PBS) ile yıkayın ve taze RPMI ortamı ya da serum yoksun orta ekleyin.
    4. yara iyileşmesi davranış değişiklikleri tespit etmek için 20 ng EGF / ml serum ya da 2 ug mitomisin C / ml serum ile takviye edilmiş serum yoksun ortamında (% 0.1 FBS) içinde 24 saat süre ile kültür hücreleri. 24 saat boyunca kontrol hücrelerine normal RPMI ortamı ekleyin.
    5. Kültür 24 saat sonra, kaldırma ve adım 3.4 de tarif edildiği gibi kültür ekleri atmak ve dhm gerçekleştirin.
  2. Akut DSS kolit indüksiyon
    1. (Ağırlık / hacim) DSS çözeltisi% 3 elde etmek için su otoklava 100 ml DSS hazırlanan, 3 g. 7 gün boyunca fareler ad libitum içme suyu yerine bu çözüm sağlar. fare / günlük DSS çözeltisi 5 ml hesaplayın. Kontrol farelerde ad libitum için DSS olmadan otoklavlanmış su sağlar.
  3. Kemirgen ve insan kolon cryostatic kesit hazırlanması
    1. Deneyin sonunda CO2 üfleme ile fareler öldürülür.
    2. Laparotomi 23 tarafından hayvanların karın teşrih. dikkatle cımbız kullanarak tüm kolon çıkarın ve cerrahi makas kullanarak İleal ve rektal ucunu kesti. rektal sonuna kadar çekal boylamasına bir makasla kolon kesin ve kolon açın. PBS 24 ile yıkama ardından cımbız kullanarak örnekten tüm dışkı çıkarın.
    3. içeriye kavisli mukoza ile rektal sonuna kadar çekal boylamasına tomurcuk bir pamuk ile tüm kolon yuvarlayarak İsviçre rulo hazırlayın. uygun kesme ısısı (OCT), bileşik kolonik örnekleri gömme ve sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de donduruldu tutun.
    4. uygun kesme ısısı OCT bileşiği cerrahi numunenin insan kolon dokusunun yerleştirme ve sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de donduruldu tutun.
    5. Bir cryoto yardımıyla Ekim-bileşik gömülü dokulardan 7 mikron kalınlığında kesilmiş bölümlerimuayene beni hemen önce.
      NOT: Optimum numune kalınlığı sebat ve soruşturma altında doku tipinin saçılma özelliklerine bağlıdır. nedeniyle kantitatif DHM faz kontrast görüntülerde ışık saçılması kolon doku, gürültü> 10 mikron neden önemli bir artış dilim kalınlığı kullanılarak açıklanan deneyler için kalınlığı örnekleri <5 mikron cryo kesme işleminden hasar kaynaklı eserler için daha yüksek bir risk gösterirken.
    6. Bir bardak nesne taşıyıcı slayta bölümleri aktarın.

3. Teknik Donanım, Dijital Hologram Edinme ve Değerlendirme Yazılım ve Prosedürler

  1. kantitatif hücre ve doku görüntüleme için dijital holografik mikroskop
    1. Şekil 1'de gösterildiği gibi, canlı hücre görüntüleme 25 için bir off-eksenli Mach-Zehnder dijital holografik mikroskopi sistemi kullanın. Mikroskop ile donatılmış olduğundan emin olun10X mikroskop objektifi 35 mm bir çapı olan bir cam bir nesne taşıyıcısı slaytlar ve Petri kutularına için bir tutucu ile birlikte, bir mikroskop aşamasında bir ısıtma odası kantitatif faz görüntüleme 25 fizyolojik 37 ° C sıcaklık ve yazılım korumak için.
      Not: Örneğin, Kemper ve ark 26 ile Langehanenberg diğ 27 de tarif edildiği gibi...
      NOT: Alternatif olarak, parlak bir alan mikroskobu ve canlı hücrelerin nicel faz görüntüleme ve disseke doku slaytları gerçekleştirme yeteneğine sahip benzer bir sistemi kullanın.
    2. Temiz mikroskop lensi ve lens temizleme kağıdı ve toz veya diğer kirlilikler kaldırmak için mikroskop üreticisi tarafından tavsiye edildiği gibi bir temizlik maddesi (örneğin, etanol) ile kondansatör.
    3. beyaz ışık aydınlatma "konulu" "parlak bir alan" görüntüleme modu ve anahtarı seçin, DHM mikroskop görüntü elde etme yazılımını başlatın. Köhler-illumin sağlamak(Alternatif olarak, standart bir görüntü elde etme yazılımı bu aşamada kullanılabilir) görüntü tedarik yazılımı canlı görüntüleme penceresinde örnek gözlemlerken mikroskop üretici tarafından tavsiye edildiği gibi örnek yapımı.
      NOT: Görüntü yoğunluğu görüş alanı içinde homojen dağıtılması gerekmektedir ve örnek pozisyon mikroskop odak sürücü ile optik yeniden odaklanma sırasında hareket etmemelidir.
    4. Lazer ışığı "konulu" beyaz ışık aydınlatması ve anahtarı "kapalı" açmak "DHM" görüntüleme modunu seçin. Lazer ışığı ile aydınlatma homojen olup olmadığını kontrol edin (yani, ışık şiddeti homojen DHM mikroskop görüntüleme toplama yazılımı canlı görüntüleme penceresinde dağıldığı) ve off-eksen taşıyıcı girişim saçak deseni yeterli kontrast ile görüntülenir gözlemleyin çekilen görüntüler (dijital hologramlar).
  2. görüntüleme için kriyostat kesitleri hazırlanmasıDHM ile
    1. (Kalınlık, cam obje taşıyıcı üzerine kriyostat bölümü: 7 mikron, 2.3 de açıklandığı gibi) numune alın dondurucu. RT ve normal atmosfer, yaklaşık 5 dakika boyunca numune Defrost.
    2. tamamen tamponu ile kaplanana kadar, bir pipet kullanılarak, doku bölümünün üzerine orta gömme kütlesi olarak 100 ul fosfat tamponlu tuz (PBS) - 50 ekleyin. Temiz bir cam kapak slip (cam kalınlığı 170 mikron) ile örnek örtün.
      NOT: Aşırı kurutma kırılma indeksi önemli değişiklikler ve örnek saçılma özelliklerini uyarabilir.
    3. Cam taşıyıcı ve kapak kayma alt ışık saçılması neden olabilir toz ve diğer kirleticilerden temizlenir emin olun. Örnek parlak bir alan mikroskobu ve DHM ile soruşturma için hazırdır.
  3. DHM doku bölümlerinin kantitatif faz görüntüleme
    1. Dijital holografik mikroskop açın görüntüleme için 10X mikroskop merceği seçin. i başlatBüyücü edinimi DHM mikroskop yazılım ve parlak dosya görüntüleme modunu seçin.
    2. mikroskop objektif bakan kapak kayma ile, mikroskop lamı tutucu) 2'de açıklandığı gibi doku slayt yerleştirin.
    3. DHM mikroskop parlak alan aydınlatma "konulu" anahtarı. mikroskop aşaması ile örnek yerleştirin ve ilgi doku alanı canlı izleme penceresinde görünür olduğundan emin olun. mikroskop odak sürücüsünü kullanarak görüntü netliğini iyileştirmek.
      Not: yanısıra ilgi alanı, doku olmayan sürgünün bir alan, görüş alanında mevcut olmalıdır.
    4. görüntü elde etme yazılımı kullanarak keskin odaklanmış örnek parlak bir alan görüntü yakalamak.
    5. Seç "DHM" görüntüleme modu, lazer ışığı aydınlatma "konulu" beyaz ışık aydınlatması "kapalı" açmak ve kapatmak. 3 milisaniyenin altında hologram kayıt için "pozlama süresi" seçtiğinizden emin hologr gözlemlemekaphic eksen dışı girişim saçaklar görüntüleme toplama yazılımı canlı görüntüleme penceresi yeterli kontrast görünür ve bir dijital hologram yakalamak.
    6. parlak bir alan görüntüler ve farklı örnek alanların dijital hologramlar yeterli sayıda kaydedildi kadar 3.3.5 - Tekrar 3.3.3 adımları. Hologram satın alma artık tamamlanmıştır.
  4. DHM görüntüleme için yara iyileşmesi tahlilleri hazırlanması
    1. DHM ölçümler sırasında sabit sıcaklık koşulları temin etmek üzere 3 saat önce deney başlamadan göre - 1 DHM mikroskop Petri kabı ısıtma odasına açın.
    2. Gerekli ekipman (2.3 anlatılan yara iyileşmesi tahlil için Petri kabı) ile tezgah hazırlayın pipetler, cımbız, Petri kabı için cam kapak, 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), fizyolojik hücre kültür ortamının tamponlu steril bir ortamda numune hazırlama için sıcaklık (37 ° C).
      NOT: Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)% 10 fetal dana serumu (FCS), 20 mM HEPES (4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit) ve 850 mg / L NaHCO 3 oluşmaktadır.
    3. Petri kabı, plastik kapağı çıkarın ve bir pipet ile hücre kültür ortamı çıkarın. cımbız kullanarak Petri kabı alttan çıkartın.
    4. Ölü hücreleri ve yara alanında kalan hücre bileşenleri (örneğin, serum) ortadan kaldırmak amacıyla tamponlu 1 mi HEPES hücre kültürü ortamı ile 2 kez - Örnek 1 yıkayın. 2 ml HEPES tamponlu hücre kültür ortamı ekleyin ve cam kapaklı Petri kabı kap.
    5. cam kapak ve Petri kabı alt toz ve diğer kirleticilerden temizlenmiş olduğundan emin olun. Örnek DHM ile zaman atlamalı gözlem için hazırdır.
  5. DHM in vitro yara iyileşmesi sürekli modelli izleme
    1. önce 3 saat - DHM mikroskop yaklaşık 1 Petri kabı ısıtma odasına açınDeneyin başlamasından DHM ölçümler sırasında sabit sıcaklık koşulları temin etmek üzere.
    2. Dijital holografik mikroskop "konulu" anahtarı, görüntüleme için 10X mikroskop merceği seçin. DHM mikroskop görüntü elde etme yazılımını başlatın ve "aydınlık alan" görüntüleme modunu seçin. Petri kabı ısıtma haznesi fizyolojik bir sıcaklık (37 ° C) çalıştığından emin olun.
    3. DHM mikroskop etüvde 4'te tarif edildiği gibi hazırlanmıştır yara iyileşme testi ile petri) yerleştirin.
    4. parlak bir alan görüntüleme modunu seçin ve DHM mikroskop görüntü elde etme yazılımı canlı izleme penceresinde gözlemlerken mikroskop aşaması ile örnek yerleştirin. numunenin istenen alan keskin beyaz ışık aydınlatma altında odaklı görünür gözlemleyin.
    5. Beyaz altında numune farklı alanlarda parlak bir alan görüntüler (yara alan ve konfluent hücreleri ile çevresinde) Yakalamagörüntü elde etme yazılım ve belge görünümü, hücre yoğunluğu ve homojenlik ışık aydınlatma.
    6. DHM mikroskop "parlak bir alan" görüntüleme modunu seçin. DHM mikroskop görüntü elde etme yazılımı ile canlı izleme penceresinde beyaz ışık aydınlatma altında uygun bir yara alanı seçin. yara alan ölü hücreler ve hiçbir serum kalıntılarından serbest olduğundan emin olun ve her iki taraf da tercihen düz sınırları tek bir homojen hücre tabakası içerir emin olun.
    7. DHM mikroskop görüntü elde etme yazılımı ile parlak bir alan görüntüleme modunda ilk yara alanının beyaz ışık görüntü yakalamak.
    8. lazer aydınlatma "konulu" "DHM" modunu ve anahtarı seçin, beyaz ışık aydınlatması "kapalı" konuma getirin. hologram kayıt için aşağıdaki 3 msn bir pozlama süresi (parazit saçaklar t görüntü elde etme yazılımı canlı görüntüleme penceresi yeterli kontrast görünür holografik off-ekseni gözlemlemek seçinO mikroskobu DHM) ve dijital hologram yakalamak.
    9. görüntü elde etme yazılımı ile DHM modunda örnek hologramı Yakalama ve görüntü kalitesini kontrol etmek için DHM mikroskop yeniden yazılımı ile kantitatif faz görüntüyü yeniden.
    10. DHM mikroskop görüntü elde etme yazılımı ile time-lapse Hologram edinimi için - (5 dk örneğin, 3) uygun bir gecikme zamanı seçin.
    11. örnek, yalnızca hologram edinimi sırasında lazer ışığı ile aydınlatılmış olduğu görüntü elde etme yazılımı time-lapse edinimi modunu seçin.
    12. yara iyileşmesi testinin time-lapse DHM gözlem başlatın.
    13. Amaçlanan süre sonra time-lapse edinimi durdurmak parlak bir alan görüntüleme modunu seçmek ve beyaz ışık görüntüleme altında numunenin son görünümünü belgelemek.
  6. disseke dokuların dijital hologramlar yeniden ve ölçmek için bir parametre olarak ortalama kırılma endeksi belirlemekdoku yoğunluğu
    1. Kemper ve ark., 26. ve Langehanenberg ve ark., 27 de tarif edildiği gibi, örneğin, DHM mikroskop, bir yazılım ile kesilerek dokuların dijital hologramlar kantitatif faz görüntüleri yeniden.
    2. Çıkarları (ROI) 19 uygun seçilmiş bölgelerde farklı doku katmanları (epitel, submukoza, stroma) ortalama faz kontrast Δφ belirleyin.
    3. Bir refraktometre kullanılarak veya alternatif literatürden uygun bir değer kullanarak gömme ortamın kırılma indeksi belirleyin. (tipik gömme ortamı için kırılma indisi değerleri: n Su = 1.334 28, N Fosfat tuz (PBS) = 1.337 29, N, hücre kültür ortamı = 1,337-1,339 29,30 tamponlu).
    4. Ortalama faz kontrast 19 değerleri farklı doku katmanlarının kırılma indeksleri hesaplayın
      figure-protocol-13986 (1)
      NOT: Denklem. Kesilmiş, doku kalınlığı d (burada 7 um): 1 λ (λ = 532 nm Burada) lazer ışığının dalga boyu ve n, ortam burada gömülü maddenin (kırılma endeksi: orta = N PBS n bir Abbe-Refraktometre tarafından belirlenen = 1.337).
  7. Yeniden ve seri gözlem yara iyileşme time-lapse dijital hologramlar değerlendirmek
    1. DHM mikroskop yazılımı 26,27 ile yara iyileşmesi gözlem sırasında elde edilen zaman atlamalı hologram serisi kantitatif faz görüntüleri yeniden.
    2. maksimum faz kontrast görüntü kantitatif faz görüntülerin her dizi normalleştirmek.
    3. Her olabilir görüntü bölütleme nicel DHM faz görüntüler hücreler tarafından kapsanan alan: C, belirlemeözgür yazılım hücre profiler kullanılarak oluşturulan (www.cellprofiler.org 31).
    4. Konum: C hücreler Δφ hücresinin ortalama faz kontrast hesaplayın.
    5. Konum: C 15 ortalama faz kontrast Δφ hücreden hücre kuru kütle DM almak
      figure-protocol-15211 (2)
      NOT: 2 DM hücresel kuru kitle gösterir Denklem, S c hücreleri ve α = 0.002 m 2 / kg tarafından işgal edilmiş bir alan sunuyor.
    6. Tamamlayıcı hücre kırılma indisi n, hücre ve hücre kültür ortamı n ortamın kırılma endeksi belirlemek. 30 anlatıldığı gibi asılı hücrelerden ayrı deneysel n hücre belirleyin ve bir refraktometre ile n orta ölçün. Alternatif n hücresinin 30 ve orta 29,30 n için literatür değerleri kullanabilirsiniz.
    7. L, Δφ hücresi n hücre ve n orta 26,32 ortalama hücre Kalınlığı d hücre hesaplamak
      figure-protocol-16118 (3)
      NOT: Denklem. 3 Parametre d hücre λ, lazer ışık ışık dalga boyu ortalama hücre kalınlığı belirtir; ise, Δφ hücre ortalama faz kontrast gösterir ve hücre ve n orta n ayrılmaz hücresel refraktif indeks ve çevresindeki ortamın kırılma indeksi vardır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Dijital Holografik Mikroskopi için DHM Görüntüleme için tipik Kurulum (DHM)

Şekil 1 B gösterildiği gibi parlak alan görüntüleme ve kantitatif DHM faz kontrast görüntüleme gerçekleştirmek için, biz ters bir mikroskop uygulamalı. 25 daha önce tarif edildiği gibi sistem, bir DHM modülü ekleme ile modifiye edilmiştir. Mach-Zehnder...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu DHM murin kolit modellerinde histolojik hasar ve insan kolon doku numuneleri ex vivo doğru değerlendirilmesini sağladığını gösterir. Ayrıca, DHM sürekli olarak aynı anda, hücresel değişiklikler hakkında çok modlu bilgi temin ederken epitel yara iyileşmesi takip göstermiştir. DHM olarak, dijital yakalanan hologramların yeniden sayısal 32 gerçekleştirilir. Bu nedenle, parlak bir alan mikroskobu, Zernike faz kontrast ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ile kar...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

We thank Faekah Gohar for proofreading the manuscript. We thank Sonja Dufentester and Elke Weber for expert technical assistance.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
Azoxymethane (AOM)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyA5486
Cell Culture FlaskGreiner Bio-One, Frickenhausen, Germany658170
Costar StripetteCorning Inc., New York, USA4488
Dextran sulphate sodium (DSS)TdB Consulatancy, Uppsala, SwedenDB001
DMEM/Ham's F12PAA Laboratories - Pasching - AustriaE15-813
EGFSigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanySPR3196
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyE 9884
Falcon Tube 50 mlBD Biosciences, Erembodegem, Belgium352070
Isopentane (2-Methylbutane)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyM32631-1L
Methylene blueMerck, Darmstadt, Germany1159430025
Mitomycin CSigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyM4287
Microscope SlidesG. Menzel, Braunschweig, GermanyJ1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek compound                                 Sakura, Zoeterwonde, Netherlands4583
Pen/Strep/Amphotericin BLonza, Verviers, Belgium1558
Phosphate buffered saline, PBSLonza, Verviers, Belgium4629
RPMI 1640Lonza, Verviers, Belgium3626
Sodium Chloride 0.9%Braun, Melsungen, Germany5/12211095/0411
Standard dietAltromin, Lage, Germany1320
Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Netherlands4566
Trypsin EDTALonza, Verviers, Belgium7815
Vitro – CludR. Langenbrinck, Teningen, Germany04-0002 
 µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, highibidi GmbH, Munich, Germany81176
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insertibidi GmbH, Munich, Germany80050
Equipment
MICROM HM550Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA46320
Digital holographic microscope
ComponentModelCompany
Inverted MicroscopeiMICTill Photonics, Graefelfing, Germany
LaserCompass 315MCoherent GmbH, Luebeck, Germany
Microscope lensZeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3Zeiss, Goettingen, Germany
CCD cameraDMK 41BF02The Imaging Source, Bremen, Germany

Referanslar

  1. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Inflammatory bowel disease: clinical aspects and established and evolving therapies. Lancet. 369 (9573), 1641-1657 (2007).
  2. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
  3. Florholmen, J. Mucosal healing in the era of biologic agents in treatment of inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol. 50 (1), 43-52 (2015).
  4. Merga, Y., Campbell, B. J., Rhodes, J. M. Mucosal barrier, bacteria and inflammatory bowel disease: possibilities for therapy. Dig Dis. 32 (4), 475-483 (2014).
  5. Young, V. B., Kahn, S. A., Schmidt, T. M., Chang, E. B. Studying the Enteric Microbiome in Inflammatory Bowel Diseases: Getting through the Growing Pains and Moving Forward. Front Microbiol. 2, 144(2011).
  6. Atreya, R., Neurath, M. F. IBD pathogenesis in 2014: Molecular pathways controlling barrier function in IBD. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (2), 67-68 (2015).
  7. Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors. Front Biosci. 4, 303-309 (1999).
  8. Burk, R. R. A factor from a transformed cell line that affects cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (2), 369-372 (1973).
  9. Singh, A., Nascimento, J. M., Kowar, S., Busch, H., Boerries, M. Boolean approach to signalling pathway modelling in HGF-induced keratinocyte migration. Bioinformatics. 28 (18), 495-501 (2012).
  10. Sakalar, C., et al. Pronounced transcriptional regulation of apoptotic and TNF-NF-kappa-B signaling genes during the course of thymoquinone mediated apoptosis in HeLa cells. Mol Cell Biochem. 383 (1-2), 243-251 (2013).
  11. Serada, S., et al. Serum leucine-rich alpha-2 glycoprotein is a disease activity biomarker in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis. 18 (11), 2169-2179 (2012).
  12. Turovskaya, O., et al. RAGE, carboxylated glycans and S100A8/A9 play essential roles in colitis-associated carcinogenesis. Carcinogenesis. 29 (10), 2035-2043 (2008).
  13. Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617(2012).
  14. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors (Basel). 13 (4), 4170-4191 (2013).
  15. Bettenworth, D., et al. Quantitative stain-free and continuous multimodal monitoring of wound healing in vitro with digital holographic microscopy. PLoS One. 9 (9), 107317(2014).
  16. Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Sci Rep. 5, 9976(2015).
  17. Wang, Z., Tangella, K., Balla, A., Popescu, G. Tissue refractive index as marker of disease. J Biomed Opt. 16 (11), 116017(2011).
  18. Majeed, H., et al. Breast cancer diagnosis using spatial light interference microscopy. J Biomed Opt. 20 (11), 111210(2015).
  19. Lenz, P., et al. Digital holographic microscopy quantifies the degree of inflammation in experimental colitis. Integr Biol (Camb). 5 (3), 624-630 (2013).
  20. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
  21. Klokkers, J., et al. Atrial natriuretic peptide and nitric oxide signaling antagonizes vasopressin-mediated water permeability in inner medullary collecting duct cells. Am J Physiol Renal Physiol. 297 (3), 693-703 (2009).
  22. Jourdain, P., et al. Determination of transmembrane water fluxes in neurons elicited by glutamate ionotropic receptors and by the cotransporters KCC2 and NKCC1: a digital holographic microscopy study. J Neurosci. 31 (33), 11846-11854 (2011).
  23. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
  24. Bettenworth, D., et al. The tripeptide KdPT protects from intestinal inflammation and maintains intestinal barrier function. Am J Pathol. 179 (3), 1230-1242 (2011).
  25. Kemper, B., et al. Modular digital holographic microscopy system for marker free quantitative phase contrast imaging of living cells. Proc. SPIE. 6191, (2006).
  26. Kemper, B., von Bally, G. Digital holographic microscopy for live cell applications and technical inspection. Appl Opt. 47 (4), 52-61 (2008).
  27. Langehanenberg, P., von Bally, G., Kemper, B. Autofocusing in digital holographic microscopy. 3D Research. 2 (1), 1-11 (2011).
  28. Daimon, M., Masumura, A. Measurement of the refractive index of distilled water from the near-infrared region to the ultraviolet region. Applied optics. 46 (18), 3811-3820 (2007).
  29. Przibilla, S., et al. Sensing dynamic cytoplasm refractive index changes of adherent cells with quantitative phase microscopy using incorporated microspheres as optical probes. J Biomed Opt. 17 (9), 0970011-0970019 (2012).
  30. Kemper, B., et al. Integral refractive index determination of living suspension cells by multifocus digital holographic phase contrast microscopy. J Biomed Opt. 12 (5), 054009(2007).
  31. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100(2006).
  32. Marquet, P., et al. Digital holographic microscopy: a noninvasive contrast imaging technique allowing quantitative visualization of living cells with subwavelength axial accuracy. Opt Lett. 30 (5), 468-470 (2005).
  33. Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging. Appl Opt. 47 (19), 176-182 (2008).
  34. Hanauer, S. B., et al. Maintenance infliximab for Crohn's disease: the ACCENT I randomised trial. Lancet. 359 (9317), 1541-1549 (2002).
  35. Colombel, J. F., et al. Adalimumab for maintenance of clinical response and remission in patients with Crohn's disease: the CHARM trial. Gastroenterology. 132 (1), 52-65 (2007).
  36. Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. N Engl J Med. 369 (8), 699-710 (2013).
  37. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
  38. Monteleone, G., et al. Mongersen, an oral SMAD7 antisense oligonucleotide, and Crohn's disease. N Engl J Med. 372 (12), 1104-1113 (2015).
  39. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
  40. Sandborn, W. J., et al. Ustekinumab induction and maintenance therapy in refractory Crohn's disease. N Engl J Med. 367 (16), 1519-1528 (2012).
  41. Natividad, J. M., et al. Commensal and probiotic bacteria influence intestinal barrier function and susceptibility to colitis in Nod1-/-; Nod2-/- mice. Inflamm Bowel Dis. 18 (8), 1434-1446 (2012).
  42. Melgar, S., et al. Validation of murine dextran sulfate sodium-induced colitis using four therapeutic agents for human inflammatory bowel disease. Int Immunopharmacol. 8 (6), 836-844 (2008).
  43. Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. Int J Clin Exp Pathol. 7 (8), 4557-4576 (2014).
  44. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
  45. Zhao, K., Wang, W., Guan, C., Cai, J., Wang, P. Inhibition of gap junction channel attenuates the migration of breast cancer cells. Mol Biol Rep. 39 (3), 2607-2613 (2012).
  46. Pavillon, N., et al. Early cell death detection with digital holographic microscopy. PLoS One. 7 (1), 30912(2012).
  47. Hindryckx, P., et al. Clinical trials in ulcerative colitis: a historical perspective. J Crohns Colitis. 9 (7), 580-588 (2015).
  48. Neurath, M. F., Travis, S. P. Mucosal healing in inflammatory bowel diseases: a systematic review. Gut. 61 (11), 1619-1635 (2012).
  49. Bryant, R. V., Winer, S., Travis, S. P., Riddell, R. H. Systematic review: histological remission in inflammatory bowel disease. Is 'complete' remission the new treatment paradigm? An IOIBD initiative. J Crohns Colitis. 8 (12), 1582-1597 (2014).
  50. Marchal Bressenot, A., et al. Review article: the histological assessment of disease activity in ulcerative colitis. Aliment Pharmacol Ther. 42 (8), 957-967 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 115Gastroenterolojidijital holografik mikroskopikantitatif faz g r nt lemeetiket i ermeyenleke b rakmayaninflamasyonyara iyile mesikantitatif mikroskopi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır