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Resumen

Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.

Resumen

La incidencia de la enfermedad inflamatoria intestinal, es decir, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, ha aumentado considerablemente en la última década. La etiología de la IBD permanece desconocida y estrategias terapéuticas actuales se basan en la supresión no específica del sistema inmune. El desarrollo de tratamientos que se dirigen específicamente la inflamación intestinal y la curación de la herida epitelial podría mejorar significativamente la gestión de la EII, sin embargo esto requiere una detección precisa de los cambios inflamatorios. Actualmente, los posibles candidatos a fármacos se evalúan por lo general el uso de modelos animales in vivo o con técnicas basadas en cultivos celulares in vitro. El examen histológico por lo general requiere que las células o tejidos de interés para ser teñidas, que pueden alterar las características de la muestra y, además, la interpretación de los resultados puede variar por la experiencia del investigador. microscopía holográfica digital (DHM), basado en la detección de retardo de longitud del camino óptico, permite-Libre de manchas de imágenes de contraste de fase cuantitativa. Esto permite que los resultados que se correlacionan directamente con los parámetros biofísicos absolutos. Se demuestra cómo la medición de los cambios en la densidad del tejido con DHM, basado en la medición del índice de refracción, puede cuantificar alteraciones inflamatorias, sin tinción, en diferentes capas de muestras de tejido del colon de ratones y seres humanos con colitis. Además, demostramos monitoreo libre de etiquetas multimodal continua de la curación de heridas epiteliales in vitro, utilizando DHM posible gracias a la determinación automatizada sencilla de la zona de la herida y la determinación simultánea de los parámetros morfológicos, como una masa seca y espesor de la capa de células que migran. En conclusión, DHM representa un valioso, herramienta novedosa y cuantitativo para la evaluación de la inflamación intestinal con valores absolutos de los parámetros posibles, la cuantificación simplificada de la curación de heridas epiteliales in vitro y por lo tanto tiene un alto potencial de diagnóstico u traslacionalse.

Introducción

Enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), es decir, la colitis ulcerosa (UC) y la enfermedad de Crohn (CD) son trastornos inflamatorias idiopáticas del tracto gastrointestinal 1. La investigación sobre la fisiopatología subyacente de la EII y la evaluación de los potenciales nuevos fármacos o enfoques novedosos de diagnóstico es de particular importancia. Tanto en la investigación básica y el manejo clínico de los pacientes con EII, la mucosa intestinal se ha convertido en un foco de atención 2,3. La mucosa representa un límite anatómico, en la que la interacción entre bacterias comensales, células epiteliales y diversos componentes celulares del sistema inmunitario intestinal orquestar intestino homeostasis 4,5. Sin embargo, en los pacientes con EII, la inflamación intestinal incontrolada y persistente conduce a la mucosa daño, detectable como ulceraciones o estenosis, que finalmente pueden culminar en la descomposición de la función de la barrera epitelial, que a su vez agrava la inflamación local 6.

epitelial de cicatrización de la herida tanto, es crucial para la regeneración epitelial después de la inflamación, pero también es un requisito esencial para la cicatrización de las úlceras gastrointestinales o dehiscencia de la anastomosis después de la cirugía gastrointestinal 7. Epitelial cicatrización de la herida puede ser simulado en la herida in vitro los ensayos de curación y en modelos murinos de inflamación intestinal 8,9. Tanto in vitro como in vivo enfoques tienen inconvenientes, que limitan la precisión de la evaluación experimental. Ensayos in vitro, como los ensayos de cero clásicos, requerir procedimientos de tinción o prolongadas de la transfección con cromóforos fluorescentes. A menudo están limitadas por su monitorización discontinua de la proliferación celular y la migración que no puede ser automatizado 10. Modelos in vivo, tales como sulfato de dextrano sódico (DSS) La colitis inducida, con frecuencia carecen de robustos lectura de los, en parte debido a la variación significativa vista en los marcadores de laboratorio, marey dichos marcadores inadecuados para evaluar la gravedad de la colitis 11,12. El análisis histológico de la mucosa inflamada es actualmente todavía el método más válido para determinar la gravedad colitis pero esto, como los ensayos de curación de heridas epiteliales in vitro, requiere tinción y depende de la experiencia del investigador 13.

Microscopía holográfica Recientemente digital (DHM), una variante de la microscopía de fase cuantitativa 14, se identificó como herramienta útil para la evaluación de epitelial cicatrización de heridas in vitro y in vivo 15. DHM permite la evaluación de la densidad del tejido mediante la medición de retardo de longitud del camino óptico (OPD) , que el diagnóstico del cáncer perspectivas novela 16-18 y cuantificación de las alteraciones del tejido relacionado con la inflamación 19. Además, DHM permite la monitorización de la dinámica de la morfología celular mediante la determinación de espesor de la celda, el área de superficie de la célula cubierta y intracelular (proteína) la cantidad de contenido 15,20. En ensayos in vitro, DHM también permite el análisis de procesos fisiológicos, por ejemplo, celular permeabilidad al agua mediante la evaluación de los cambios en el volumen celular y el espesor de 21,22. Por otra parte, las mediciones se pueden automatizar DHM que evita el sesgo de la muestra por el investigador asociado.

A continuación, se demuestra el uso de DHM en un modelo murino de inflamación intestinal, y también aplicar DHM para el análisis de muestras de tejidos humanos para la monitorización cuantitativa de la cicatrización de heridas como un ensayo libre de etiquetas in vitro. En primer lugar, se evalúa alteraciones inflamatorias de las diferentes capas de la pared del colon-en ratones colíticos y secciones de tejidos de seres humanos con EII. Después de describir el procedimiento de formación de imágenes DHM fase cuantitativa, se proporcionan instrucciones detalladas para el uso de los componentes del microscopio, la preparación de secciones de tejido y también describir la evaluación de las imágenes de fase cuantitativos adquiridos.

A continuación, mostramos que DHM puede ser utilizado para la monitorización multimodal continua de la curación de heridas epiteliales in vitro, y describir el análisis de las características celulares como espesor de la capa de células, masa seca y el volumen celular dar una idea de las alteraciones inducidas por drogas y celulares fisiológica.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética regional (la Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Alemania) de acuerdo con la Ley de Protección de Animales alemán. El comité de ética local de la Universidad de Münster aprobó el uso de tejidos humanos para el análisis histológico y el microscopio.

1. Los animales y Materiales

  1. Utilice femenino o ratones macho de la cepa susceptible DSS requiere que pesan 20 a 25 g, y la casa de acuerdo a la legislación local cuidado de los animales. Proporcionar comida especial para roedores y en autoclave beber agua ad libitum.
  2. Inducir la colitis DSS aguda mediante la administración de un 3% w / v de dextrano sulfato sódico (DSS, peso molecular: 36,000-50,000 Da) en agua del grifo tratada en autoclave durante 5 días.
    NOTA: La potencia de DSS es muy variable dependiendo del fabricante y lote. Pruebe su proveedor DSS-proporcionada por primera vez para la inducción de la actividad de la enfermedad, para la que dapeso corporal AIA es un indicador fiable y objetiva.
  3. Para la evaluación histológica de las muestras de tejido del colon, la eutanasia a los ratones por CO 2 insuflación (o según lo especificado por las directrices nacionales e institucionales) al final del experimento.

2. Configuración experimental para DSS-colitis y in vitro Los ensayos de curación de heridas

  1. Cultivo de células y ensayo de establecimiento de la cicatrización de heridas.
    1. Crecer células Caco-2 en una humedad del 95% y 5% de CO 2 medio ambiente a 37 ° C. Utilice medio RPMI con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina.
    2. Seed células Caco-2 a una densidad de 4 x 10 5 células / cm 2 en 35 mm placas de Petri con la alta cultura-inserción (véase la Figura 4A).
      NOTA: El inserto genera dos áreas de célula cubierta que se separan con un espacio libre de células se define en representación de la zona de la herida que va a analizarse.
    3. Cambie medio dos días después de seedingramo. Realizar aspirando primero medio residual con los residuos celulares mediante el uso de una pipeta automática, enjuague con 100 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se añade medio RPMI fresco o medio privadas de suero.
    4. células de cultivo para 24 horas en medio privadas de suero (0,1% de FBS), complementado con 20 ng de suero EGF / ml o 2 mg de mitomicina c / ml de suero para detectar alteraciones en el comportamiento de cicatrización de heridas. Añadir medio normal RPMI con las células control durante 24 horas.
    5. Después de 24 horas de cultivo, retirar y desechar insertos de cultivo como se describe en el paso 3.4 y realizar DHM.
  2. La inducción de la colitis DSS aguda
    1. Disolver 3 g de DSS en 100 ml de agua en autoclave para obtener un 3% (v w /) solución de DSS. Proporcionar esta solución en lugar de agua potable a los ratones ad libitum durante 7 días. Calcular 5 ml de solución por DSS-ratón / día. Proporcionar agua tratada en autoclave sin DSS para los ratones de control ad libitum.
  3. Preparación de las secciones criostáticas de murino y de colon humano
    1. La eutanasia a los ratones por CO 2 insuflación al final del experimento.
    2. Diseccionar el abdomen de los animales mediante laparotomía 23. Retire todo el colon con cuidado utilizando pinzas y cortar el extremo ileal y rectal utilizando tijeras quirúrgicas. Cortar el colon con una tijera longitudinalmente desde el cecal hasta el final rectal y abrir el colon. Retirar todas las heces de la muestra utilizando unas pinzas, seguido de un lavado con PBS 24.
    3. Preparar brazos de gitano enrollando todo el colon con un bastoncillo de algodón longitudinalmente desde el ciego hasta el final del recto con la mucosa curvada hacia el interior. Incrustar muestras de colon en el compuesto temperatura óptima de corte (OCT) y mantenerse congeladas a -80 ° C hasta su uso posterior.
    4. Incrustar tejido colónico humano a partir de la pieza quirúrgica en una óptima temperatura de corte compuesto OCT y se congeló a mantenerse -80 ° C hasta su uso posterior.
    5. Corte secciones de 7 m de espesor de las muestras de compuesto OCT-embebido con la ayuda de un cryotome justo antes de un examen.
      NOTA: El espesor óptimo de la muestra depende de la persistencia y las propiedades de dispersión del tipo de tejido bajo investigación. Para los experimentos descritos utilizando tejido de colon, grosor de corte> 10 micras causa importante aumento en el ruido debido a la dispersión de la luz en imágenes de contraste de fase DHM cuantitativos, mientras que las muestras de espesor <5 micras muestran un mayor riesgo de daño inducido por los artefactos del proceso de corte crio.
    6. Transferir secciones sobre un porta portaobjetos de vidrio.

3. Equipo Técnico, Software y procedimientos para la adquisición y evaluación de hologramas digitales

  1. microscopio holográfico digital para celular cuantitativa y obtener imágenes de tejidos
    1. Utilizar un sistema de microscopía fuera del eje Mach-Zehnder digitales holográfica de imágenes de células vivas 25, como se muestra en la Figura 1. Asegúrese de que el microscopio está equipado con una10X lente de un microscopio, una platina de microscopio con un soporte para diapositivas portaobjetos de vidrio y placas de Petri con un diámetro de 35 mm, una cámara de calentamiento para conservar la temperatura fisiológica a 37 ° C y el software para imágenes de fase cuantitativa 25.
      NOTA: Por ejemplo, como se describe en Kemper et al 26 y 27 Langehanenberg et al...
      NOTA: También puede utilizar un sistema similar que es capaz de realizar la microscopía de campo claro y Fase cuantitativa de imágenes de células vivas y las diapositivas de tejidos disecados.
    2. Lente de microscopio limpio y condensador con papel de limpieza de lentes y un agente de limpieza (por ejemplo, etanol) según lo recomendado por el fabricante del microscopio para eliminar el polvo u otras contaminaciones.
    3. Ejecutar el software de adquisición de imágenes del microscopio DHM, seleccione el modo "campo brillante" de imagen y cambio "en" iluminación de luz blanca. Garantizar Köhler-Correcación de la muestra tal como se recomienda por el fabricante microscopio, mientras que la observación de la muestra en la ventana de imagen en directo del software de adquisición de imágenes (alternativamente, un software estándar de adquisición de imágenes se puede utilizar en este paso).
      NOTA: La intensidad de la imagen debe ser distribuido de manera homogénea en el campo de visión y la posición de la muestra no debe moverse durante la reorientación óptica con la unidad de enfoque del microscopio.
    4. Seleccione el modo "DHM" imagen, "apagar" iluminación de luz blanca y el interruptor "on" la luz láser. Compruebe que la iluminación con luz láser es homogénea (es decir, que la intensidad de la luz se distribuye homogéneamente en la ventana de imagen en directo del software de adquisición de imágenes del microscopio DHM) y observe que el portador de patrón de franjas de interferencia fuera del eje aparece con contraste adecuado en el imágenes capturadas (hologramas digitales).
  2. Preparación de secciones de criostato para formación de imágenescon DHM
    1. Tome la (sección de criostato sobre un portaobjetos de vidrio, espesor: 7 micras, tal como se describe en el punto 2.3) de la muestra del congelador. Descongelar la muestra durante aproximadamente 5 min a temperatura ambiente y atmósfera normal.
    2. Añadir 50 - solución salina tamponada con fosfato 100 l (PBS) como medio de inclusión en la sección de tejido con una pipeta hasta que está completamente cubierto con tampón. Cubrir la muestra con un cubreobjetos de vidrio limpio (espesor de vidrio de 170 micras).
      NOTA: El secado excesivo puede inducir cambios significativos del índice de refracción y propiedades de dispersión de la muestra.
    3. Asegúrese de que la parte inferior del soporte de vidrio y la hoja de la cubierta se limpian del polvo y otros contaminantes que pueden inducir la dispersión de la luz. La muestra está lista para la investigación con microscopía de campo brillante y DHM.
  3. Fase cuantitativa de imágenes de secciones de tejido con DHM
    1. Encienda el microscopio holográfico digital, elegir la lente del microscopio 10X para la imagen. Iniciar el iSoftware de adquisición de mago del microscopio DHM y seleccionar el modo de imagen brillante de archivos.
    2. Colocar el portaobjetos de tejido como se describe en 2) en el soporte del portaobjetos del microscopio, con la hoja de la cubierta frente al objetivo del microscopio.
    3. Switch "sobre" la iluminación de campo brillante del microscopio DHM. Coloque la muestra con la platina del microscopio y asegurar que el área de tejido de interés es visible en la ventana de monitoreo en vivo. Mejorar la nitidez de la imagen utilizando la unidad de enfoque del microscopio.
      NOTA: Además de la zona de interés, un área de diapositiva sin tejido también deben estar presentes en el campo de visión.
    4. Capturar una imagen de campo brillante de la muestra se centró fuertemente el uso del software de adquisición de imágenes.
    5. Seleccionar el modo de imagen "DHM", "apagar" la iluminación de luz blanca y girar "sobre" la iluminación de luz láser. Seleccione el "tiempo de exposición" para la grabación del holograma por debajo de 3 ms, observar que holographic fuera del eje franjas de interferencia aparecen con un contraste adecuado en la ventana de imágenes en vivo del software de adquisición de imágenes y la captura de un holograma digital.
    6. Repita los pasos 3.3.3 - 3.3.5 hasta que se haya registrado un número suficiente de imágenes de campo claro y hologramas digitales de diferentes áreas de la muestra. adquisición holograma se ha completado.
  4. Preparación de ensayos de cicatrización de la herida para imágenes DHM
    1. Conectar la cámara de calentamiento placa de Petri del microscopio DHM sobre 1-3 h antes del inicio del experimento para garantizar condiciones de temperatura estables durante las mediciones DHM.
    2. Preparar banco de trabajo con el equipo necesario (placa de Petri para el ensayo de cicatrización de la herida se describe en 2.3): pipetas, pinzas, tapa de vidrio para la placa de Petri, 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) tamponada con medio de cultivo celular fisiológica la temperatura (37 ° C) para la preparación de muestras en el entorno estéril.
      NOTA: medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) se compone de 10% de suero de ternero fetal (FCS), mM HEPES 20 (4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico), y 850 mg / L de NaHCO3.
    3. Retire la tapa de plástico de la placa de Petri y se elimina el medio de cultivo de células con una pipeta. Retire la inserción de la parte inferior del plato de Petri con unas pinzas.
    4. Lavar la muestra 1 - 2 veces con 1 ml de tampón HEPES medio de cultivo celular con el fin de eliminar las células muertas y restantes componentes celulares (por ejemplo, suero) en el área de la herida. Añadir 2 ml de HEPES medio de cultivo celular tamponado y la tapa de la caja de Petri con la tapa de cristal.
    5. Asegúrese de que la tapa de vidrio y el fondo del plato de Petri se han limpiado de polvo y otros contaminantes. Muestra está lista para la observación lapso de tiempo con DHM.
  5. Monitorización multimodal continua de la curación de heridas in vitro con DHM
    1. Encienda la cámara de calentamiento placa de Petri del microscopio DHM cerca de 1 - 3 horas antesal comienzo del experimento para garantizar condiciones de temperatura estables durante las mediciones DHM.
    2. Switch "sobre" el microscopio holográfico digital, seleccionar la lente del microscopio 10X para la imagen. Ejecutar el software de adquisición de imágenes del microscopio DHM y seleccionar el modo de imagen "de campo claro". Asegúrese de que la cámara de calentamiento para la placa de Petri está operando una temperatura fisiológica (37 ° C).
    3. Coloque la placa de Petri con el ensayo de curación de heridas, preparado como se describe en 4), en la cámara de calentamiento del microscopio DHM.
    4. Seleccionar el modo de imagen de campo claro y la posición de la muestra con la platina del microscopio, mientras que la observación de que en la ventana de monitoreo en vivo del software de adquisición de imágenes del microscopio DHM. Observe que el área deseada de la muestra aparezca enfocada fuertemente bajo iluminación de luz blanca.
    5. Capturar imágenes brillantes de campo de diferentes áreas de la muestra (área de la herida y sus alrededores con células confluentes) bajo blancoiluminación de luz con el software de adquisición de la imagen y la apariencia del documento, la densidad celular y la homogeneidad.
    6. Seleccionar el modo de imagen "de campo claro" del microscopio DHM. Elija un área de la herida adecuado bajo iluminación blanca de la luz en la ventana de monitoreo en vivo con el software de adquisición de imágenes del microscopio DHM. Asegúrese de que el área de la herida está libre de células muertas y no hay restos de suero, y asegúrese de que ambas partes incluyen una sola capa de células homogénea, preferentemente con bordes rectos.
    7. Capturar una imagen de luz blanca de la zona de la herida inicial en el modo de imagen de campo claro con el software de adquisición de imágenes del microscopio DHM.
    8. "Apagar" iluminación de luz blanca, seleccione el modo "DHM" y el interruptor "en la" iluminación láser. Seleccionar un tiempo de exposición de por debajo de 3 ms para el registro de holograma (observar que holográfica fuera del eje franjas de interferencia aparecen con un contraste adecuado en la ventana de imágenes en vivo del software de adquisición de imágenes de tque DHM microscopio) y la captura de un holograma digital.
    9. Captura de un holograma muestra en el modo de DHM con el software de adquisición de imagen y reconstruir una imagen de fase cuantitativa con el software de reconstrucción del microscopio DHM con el fin de comprobar la calidad de la imagen.
    10. Seleccionar un retardo de tiempo adecuado (por ejemplo, 3 a 5 min) para de lapso de tiempo de adquisición de holograma con el software de adquisición de imágenes del microscopio DHM.
    11. Seleccione el modo de adquisición de lapso de tiempo del software de adquisición de imágenes en el que la muestra solamente se ilumina con luz láser durante la adquisición de holograma.
    12. Iniciar la medición del DHM lapso de tiempo del ensayo de cicatrización de la herida.
    13. Detener la adquisición de lapso de tiempo después de la hora prevista, seleccionar el modo de imagen de campo claro y documentar el aspecto final de la muestra en la imagen de luz blanca.
  6. Reconstruir hologramas digitales de tejidos disecados y determinar el índice de refracción promedio como un parámetro para cuantificarla densidad del tejido
    1. Reconstruir imágenes de fase cuantitativas de los hologramas digitales de tejidos disecados con el software del microscopio DHM, por ejemplo, como se describe en Kemper et al. 26 y Langehanenberg et al. 27.
    2. Determinar la diferencia de fase Δφ promedio en diferentes capas de tejido (epitelio, submucosa, estroma) en regiones elegidas adecuadamente de interés (ROI) 19.
    3. Determinar el índice de refracción del medio de inclusión mediante el uso de un refractómetro o, alternativamente, mediante el uso de un valor apropiado de la literatura. (valores de índice de refracción de los medios de comunicación típica incrustación: n = 1.334 agua 28, n tampón fosfato salino (PBS) = 1,337 29, n medio de cultivo celular = 1,337 a 1,339 29,30).
    4. Calcular los índices de refracción de las diferentes capas de tejido del contraste de fase Valores 19
      figure-protocol-16830 (1)
      NOTA: En la Ec. 1 λ es la longitud de onda de la luz láser (aquí: λ = 532 nm), d el espesor de los tejidos disecados (en este caso: 7 m) yn medio es el índice de refracción del medio de inclusión (en este caso: n medio = n PBS = 1.337, determinado por un refractómetro Abbe-).
  7. Reconstruir y evaluar hologramas digitales del lapso de tiempo de observación serie cicatrización de heridas
    1. Reconstruir imágenes fase cuantitativa de la serie lapso holograma tiempo obtenido durante la observación cicatrización de la herida con el software microscopio DHM 26,27.
    2. Normalizar cada serie de imágenes de fase cuantitativa a la imagen con contraste de fase máxima.
    3. Determinar el área S c que está cubierta por las células en las imágenes de fase cuantitativos DHM por la segmentación de imágenes, que puede ser porformado usando el generador de perfiles de células software libre (www.cellprofiler.org 31).
    4. Calcular el contraste de fase media de la célula células Δφ en la zona S c.
    5. Recuperar el DM masa seca celular de la célula de contraste de fase Δφ media en la zona S c 15
      figure-protocol-18261 (2)
      NOTA: En la ecuación 2 DM indica la masa seca celular, S c presenta la zona que está ocupada por las células y α = 0,002 m 2 / kg.
    6. Determinar la célula de refracción celular integral índice n y el índice de refracción del medio de medio de cultivo de células n. Determinar celular n por separado experimentalmente a partir de células en suspensión como se describe en el 30 y medir medio n con un refractómetro. Alternativamente utilizar valores de la literatura para la celda n 30 yn medio 29,30.
    7. Calcular el promedio de células d espesor de la celda de λ, célula Δφ, n celular y n medio 26,32
      figure-protocol-19255 (3)
      NOTA: En la Ec. 3 la célula parámetro d es el espesor medio de celda, λ denota la longitud de onda de luz de la luz láser, célula Δφ indica la diferencia de fase media, y n celular y n medio son el índice de refracción celular integral y el índice de refracción del medio circundante.

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Resultados

Configuración típica de los DHM de imagen digital para microscopía holográfica (DHM)

Para llevar a cabo formación de imágenes de campo brillante y la imagen de contraste de fase cuantitativa DHM, se aplicó un microscopio invertido como se representa en la Figura 1 B. El sistema fue modificado uniendo un módulo DHM, como se describió anteriormente

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Discusión

Demostramos que DHM proporciona una evaluación precisa del daño histológico en modelos murinos de colitis y muestras de tejido del colon humanas ex vivo. Además, hemos demostrado DHM puede monitorizar de forma continua la curación de heridas epiteliales mismo tiempo, proporcione información multimodal sobre las alteraciones celulares. En DHM, la reconstrucción de hologramas capturadas digitalmente se realiza numéricamente 32. Por lo tanto, en comparación con la microscopía de campo claro, c...

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Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

We thank Faekah Gohar for proofreading the manuscript. We thank Sonja Dufentester and Elke Weber for expert technical assistance.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
Azoxymethane (AOM)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyA5486
Cell Culture FlaskGreiner Bio-One, Frickenhausen, Germany658170
Costar StripetteCorning Inc., New York, USA4488
Dextran sulphate sodium (DSS)TdB Consulatancy, Uppsala, SwedenDB001
DMEM/Ham's F12PAA Laboratories - Pasching - AustriaE15-813
EGFSigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanySPR3196
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyE 9884
Falcon Tube 50 mlBD Biosciences, Erembodegem, Belgium352070
Isopentane (2-Methylbutane)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyM32631-1L
Methylene blueMerck, Darmstadt, Germany1159430025
Mitomycin CSigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyM4287
Microscope SlidesG. Menzel, Braunschweig, GermanyJ1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek compound                                 Sakura, Zoeterwonde, Netherlands4583
Pen/Strep/Amphotericin BLonza, Verviers, Belgium1558
Phosphate buffered saline, PBSLonza, Verviers, Belgium4629
RPMI 1640Lonza, Verviers, Belgium3626
Sodium Chloride 0.9%Braun, Melsungen, Germany5/12211095/0411
Standard dietAltromin, Lage, Germany1320
Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Netherlands4566
Trypsin EDTALonza, Verviers, Belgium7815
Vitro – CludR. Langenbrinck, Teningen, Germany04-0002 
 µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, highibidi GmbH, Munich, Germany81176
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insertibidi GmbH, Munich, Germany80050
Equipment
MICROM HM550Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA46320
Digital holographic microscope
ComponentModelCompany
Inverted MicroscopeiMICTill Photonics, Graefelfing, Germany
LaserCompass 315MCoherent GmbH, Luebeck, Germany
Microscope lensZeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3Zeiss, Goettingen, Germany
CCD cameraDMK 41BF02The Imaging Source, Bremen, Germany

Referencias

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