שיטה לא פולשנית הטכנית ללא עתירי עבור אינדוקצית phenotyping של דלקת ריאות חיידקית הניסויית עכברים

Summary

מספר שיטות תוארו בספרות למידול דלקת ריאות חיידקית בעכברים. בזאת, אנו מתארים לא פולשנית, לא יקר, שיטה מהירה גרימת דלקת ריאות באמצעות שאיפה (כלומר, שאיפה) של בידוד חיידקי pipetted לתוך הלוע התחתון. שיטות Downstream להערכה של התגובה החיסונית המולדת ריאתי הם גם מפורטות.

Abstract

למרות דלקת ריאות הנרכשת בקהילה נשארת אחת בעיות עיקריות בריאות הציבור, מודלים בעכברים של דלקת ריאות חיידקית הקלו התקדמות פרה-קלינית משמעותית לאחרונה בהבנתנו בפתוגנזה התאית והמולקולרית הבסיסית. בעכברי מודל vivo ללכוד פיזיולוגיה המשולבת ואיתנות תגובת ההגנה המארחת ב באופן לא נחשף על ידי גישות vivo לשעבר חלופיות, פשוט יותר. כמה שיטות תוארו בספרות עבור חיסון intrapulmonary של חיידקים בעכברים, כולל aerosolization, משלוח אפי, cannulation endotracheal Peroral תחת 'עיוור' ו דמיינו ההתניות cannulation endotracheal transcutaneous. כל השיטות יתרונות ומגבלות יחסית. בזאת, אנו מתארים בפרוטרוט שיטה לא פולשנית, טכני שאינו עתירה, זולות, מהירה למסירת intratracheal של חיידקי מערבת שאיפה (כלומר, שאיפה) על ידי העכברשל בידוד זיהומיות pipetted לתוך הלוע התחתון בעוד תחת הרדמה כללית. שיטה זו יכולה לשמש למסירה ריאתי של מגוון רחב של גורמים ביולוגיים וכימיים שאינם מאכלים, והוא קל יחסית ללמוד, אפילו למעבדות עם ניסיון קודם מינימאלי לנהלים ריאתי. בנוסף לתיאור שיטת דלקת ריאות שאיפה, כמו כן אנו מספקים נהלים צעד-אחר-צעד עבור assaying את הפעולות הבאות in vivo התגובה החיסונית המולדת ריאתי של העכבר, בפרט, שיטות לכימות אישור חיידקים התגובה החיסונית התאית של דרכי האוויר הנגוע. גישה משולבת ופשוט זה להערכת דלקת ריאות מאפשרת הערכה מהירה וחזקה של השפעת מניפולציות גנטיות וסביבתיות על חסינות מולדת ריאתי.

Introduction

קהילה רכשה דלקת ריאות נשארת הגורם המוביל למוות כתוצאה מהזיהום בארה"ב, עם שינוי הכולל מעט בשיעורי תמותה ב -40 השנים האחרונות למרות שיפורי חיסון ואסטרטגיות אנטיביוטיות ^1,2. למרות חוסר התקדמות ניכרת ברמת בריאות הציבור, בשנים האחרונות התקדמות דרמטית נעשתה הבנתנו בפתוגנזה המולקולרית התאית של דלקת ריאות, עם רבים של פעולות הבאות קדימה מתאפשרות על ידי השימוש במודלים של עכברים של דלקת ריאות. העקיבות הגנטיות של העכבר, הדמיון של murine ומערכות חיסון אנושיות, ואת המערך העצום של חומרים כימיים אימונולוגית במיקוד murine שהפך זמין מסחרי יחד הקלו התקדמות מהירה של השדה.

מודלי עכבר של דלקת ריאות חיידקית המתוארות בספרות יש לסמוך כלל על אחד ארבעה מסלולים טכניים עבור חיסון הפתוגן: אני aerosolization); ii) Intrמשלוח anasal; iii) משלוח Peroral; ו- IV) הזרקת intratracheal כירורגית (כלומר, קנה) ^3. כל המסלולים של זיהום יתרונות וחסרונות ^3. בפרט, חשיפה היחסית של דרכי הנשימה העליונות, פוטנציאל תערובת של צמחים oronasal, דרישות עבור הרדמה כללית, השתנות של הבידוד נמסר אל הריאות דיסטלי, הפצה אוֹנִי של פתוגנים נמסר, דרישות מומחיות טכנית, ותחלואה פרוצדורליים להשתנות משמעותית על פני אלה גישות.

נפוץ טכניקות זיהום Peroral כוללות endotracheal (translaryngeal) cannulation דרך או גישה 'עיוורת' (לא דמיין), או תחת ויזואליזציה בגרון ישירה ^3-5. שני שיטות, תוך חזק, דורשות הכשרה משמעותית וגם לשאת בסיכון של טראומה על דרך הנשימה העליונה. בדו"ח הנוכחי, אנו מתארים שיטה טכנית שאינם עתירה, לא פולשנית, לא יקרה, ומהירה של זיהום Peroral, wחיידקים בזאת (Klebsiella pneumoniae בדוגמא המסופקת) pipetted לתוך הלוע התחתון של עכבר הרדים מועברים אל הריאות באמצעות שאיפה (כלומר, שאיפה). אנו ואחרים השתמשנו בטכניקת דלקת ריאות שאיפה בהצלחה ^6-9. שיטת ריאות-משלוח תכליתי ובקלות לומדת זה יכול להתארך עד המסיירת הרבה סוכנים שאינם מאכלים נוספים אל הריאות, כולל ציטוקינים וחלבונים אחרים, מולקולות הקשורים הפתוגן (למשל, lipopolysaccharide), תאים (כלומר, העברת מאמצת), ורעלים (למשל, בליאומיצין). בנוסף לדיון שיקולים טכניים חשובים, אנחנו גם לתאר גישה משולבת, כמוני להערכת התגובה המארחת לאחר דלקת ריאות, כוללים מדידה במורד זרם של שחרור חיידקים (כלומר, יחידת מושבה להרכיב [CFU] quantitation באיברי הריאות היקפיות) ו לויקוציטים הצטברות במרחב האווירי.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם לחוק צער בעלי חיים ואת מדיניות שירות הבריאות האמריקני על טיפול אנושי ושימוש בחיות מעבדה לאחר בדיקה על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש של NIEHS.

1. הכנת ק pneumoniae תרבות

זהירות: בצע את כל השלבים ברדס 2 בטיחות ביולוגית ברמה (BSL2) או באזור BSL2 המיועד אחרים וזורקים פסולת בהתאם להנחיות המוסד BSL2.

1. לצמיחה השעיית ק pneumoniae, להפשיר מלאי גליצרול של חיידקים לחסן תרבות העבודה על ידי העברת 1 מ"ל של ק pneumoniae המניות ל -50 מ"ל של מרק סויה tryptic (TSB) בבקבוק 500 מ"ל או יותר.
2. הפוך מניות גליצרול על ידי הוספת 900 μl של יומן-שלב תרבותי ק pneumoniae 100 μl של גליצרול סטרילי והקפאה ב -20 ° C או -80 מעלות צלזיוס. עבור אחסון לטווח ארוך, C ° -80 מומלץ.
3. חיידקי תרבות מסעיףTEP 1.1 ידי ניעור הבקבוק לילה (14 - 18 שעות) ב 37 מעלות צלזיוס ב 200-225 rpm.In כדי לקדם צמיחה שלב יומן, לדלל 1-5 מ"ל של תרבות לילה זה לתוך בקבוק המכיל 50 מ"ל TSB בבוקר למקם בחזרה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד במשך ~ 2.5 שעות.
4. העבר 1 מ"ל של ק תרבות pneumoniae מהשלב האחרון לתוך צינור 1.5 מ"ל ו ספין ב 7500 XG במשך 2 דקות. גלולה לבנה צריכה להיות גלויה. הסר supernatant מבלי להפריע גלולה, בעדינות resuspend חיידקים עם פיפטה 1 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית, ספין שוב ב 7500 XG במשך 2 דקות.
   1. בצע 2x שלב זה לשטוף, העלאת הגלולה הסופית, השטף ב 1 מיליליטר של תמיסת מלח סטרילית.
5. בצע דילולים סדרו יומן חכם של בידוד מסודר זה. לדוגמה, להוסיף 400 μl של הבידוד לתוך 3.6 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית סדרתי לבצע 10 ^-1 -10 ^-9 סדרה דילול.
6. לקבוע את OD ₆₀₀ של שטף ק pneumoniae ידי הצבת 1 מ"ל של1:10 ו 1: 100 דילולים לתוך cuvettes הפנוי ומדידת OD _600, וממסך ראשון עם תמיסת מלח סטרילית. מדוד כפילויות כדי להבטיח דיוק. OD של ₆₀₀ 1.0 שווה בערך 4-7 x 10 ⁸ CFU / ml. ראוי לציין, כי מערכת היחסים בין OD ו CFU / ml לא יכול להיות ליניארי.
   1. השתמש OD ₆₀₀ מ הדילולים לחשב ריכוז של ק pneumoniae, החלת OD: המרה CFU / ml לעיל, ופעילות בתחום הפקטורינג של דילול.
7. השתמש ק ריכוז pneumoniae להכין את המנה CFU הבידוד הרצוי בנפח <100 μl למסירה עכברים (ראה להלן).
8. גם צלחת 100 μl של 10 ^-6 -10 ^-9 דילולים ו 100 μl של תמיסת מלח סטרילית על אגר סויה הפרט tryptic (TSA) צלחות ב RT. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולפקידה מושבות חיידקים על מנת לחשב ריכוז מדויק ששימש בניסוי ולשלוט על זיהום.
   הערה: ריכוז חיידקי בפועל של בידוד סופי עשויה להיות ± 500 CFU / ml כי ניבא על ידי ספיג. מבצעי הניסוי רצוי לאשר את OD _600: CFU / יחסים מ"ל במחקרים טייס לפני השימוש in vivo בעכברים, באופן אמפירי מתקנים את OD _600: CFU / המרה מ"ל מבוסס על הניסיון האישי שלהם.

2. Murine intratracheal (זה) שאיפה של ק pneumoniae מן הלוע התחתון

1. ודא כי עכברים מזוהים באופן ייחודי על ידי זנב סימן, קעקוע, או מזהים מאושרים אחרים.
2. צייר את מינון בידוד של חיידקים באמצעות פיפטה P200 לפני הסרת עכברים מן isoflurane כדי לזרז הליך. לקבלת התוצאות הטובות ביותר עם שאיפה זה, להשתמש בהיקף של <100 μl כדי למנוע הצפה. בזאת, להשתמש 2000 CFU / 50 μl של ק pneumoniae.
3. להרדים עכברים בתא ברור עם גז isoflurane (למשל, 2% isoflurane בקצב הזרימה של 1 ליטר / דקה) או לפי institהנחיות utional. מספר העכברים להרדים יחד נקבע לפי רמת נוחות של הנסיין, בדרך כלל 1-2 בכל פעם. שים נשימה ולאשר רמת ההרדמה פעם נשימות עמוקות גלויות ו 2-3 שניות ניתן לספור בין נשימות.
   הערה: אם קיים חשש לגבי תופעות בלבול אפשריות של הרדמה נדיפים (בשאיפה), הרדמה יכולה להיות מושגת במקום עם זריקת intraperitoneal של קטמין / xylazine. בשיטה המתוארת לעיל, הרדמה עמוקה נמשכת רק כמה דקות. אם הרדמה ממושכת יותר מושרה, משחת עיניים צריך לשמש כדי למנוע התייבשות העין.
4. לאחר העכבר הוא הרדים, למקם אותו בתנוחה אופקית semirecumbent, הושעה על ידי החותכות לסתי מן גומייה מתוחה בין יתדות על לוח פרספקס מלוכסנת (איור 1).
5. משוך בעדינות את לשון העכבר לצד עם זוג מלקחיים הלא חרוש בוטה מנת פיקדון לחלל הפה עם pipett P200דואר. עושה מאמצים גדולים על מנת להימנע גרימת טראומה או הלשון או הלוע התחתון.
6. תוך שמירה על הלשון חזר בו, לחסום את האף בעדינות באצבע בכפפות עד שהעכבר שואף. המשך כדי לכסות את האף עד שהעכבר נקט שתיים או יותר שאיפות, ולא נוזל גלוי חלל הפה. כיסוי האף מסייע להבטיח כי העכבר יהיה לשאוף את החיידקים אל תוך הריאות, כמו עכברים הם נושמים אף מחייב.
7. הסר את העכבר מלוח חיסון ולחזור לכלוב שלה, הצבת העכבר על גבו כדי למנוע מצעים או פסולת מחסימת nares בזמן שהעכבר מתאושש מן ההרדמה.
8. לאחר כל העכברים כבר במינון ויש לי שהתעוררו מהרדמה, עכברי בית בתוך חדרון / חדר המכילים עכברים רק כי כבר במינון עם ק pneumoniae. צג עכברים יומי, כולל משקולות הגוף אם הולך מעבר 48 שעות לאחר ההדבקה.
9. השתמש מחיה יומית ו / או חום משלים אם המאפשר העכברים ללכת מעבר 48hr.

3. נוזל שטיפה ברונכואלוואולרית (BALF) איסוף וניתוח

1. להרדים עכברים בהתאם להנחיות מוסדיות. הנה, להשתמש זריקה קטלנית של 150 מ"ג / נתרן pentobarbital ק"ג או במינון שווה ערך של פתרון המתת חסד מסחרי ואחריו exsanguination, כמו זה ימנע סיבוכים אפשריים לריאות הקשורים משאיפת CO ₂ ו נקע בצוואר הרחם.
2. עכבר עמד על גב לעקר עכבר על ידי ריסוס פרווה עם אתנול 70%, בעיקר על אזור החזה והצוואר.
3. ביצוע חתך אורכי ממש מתחת לעצם החזה, אז מחזיק את החזה עם מלקחיים, ניק הסרעפת, המאפשר הריאה ליפול חזרה לתוך חלל החזה. לחתך דרך חלל החזה משני צדי בכלי הדם ולאחר מכן, דרך הצוואר, חשיפת קנה הנשימה.
4. כמו קנה הנשימה מוקפת שרירי אורך משני הצדים, לחתוך בזהירות דרכה במרכז לדחוף רקמות לצדדים, כמוזה ימנע חיתוך כלי הדם שמסביב, אשר יכול להציג את הדם לתוך קנה הנשימה. אם כלי הדם הוא חתוכות, לנקות את האזור שמסביב עם גזה לפני גישת לומן קנה הנשימה.
5. השתמש במספריים כירורגית או מחט ולחתוך את קנה הנשימה על ¼ של הדרך למטה מהראש ולהכניס צינורית מצורף מזרק 1 מ"ל מראש עם 1 מ"ל של תמיסת מלח פוספט שנאגרו 1x (PBS) caudally לתוך קנה הנשימה. אם עכברים באמצעות <8 שבועות של גיל או נקבות, לצמצם את היקף lavaging כדי 600-800 μl.
6. דחוף את נפח לתוך הריאות לאט, מה שמאפשר את כל האונות לנפח ולאחר מכן משוך את נפח בחזרה החוצה עם המזרק, לחזור 3x. אם PBS יוצא נחירי הצינורית לא נדחפה רחוק מספיק לתוך קנה הנשימה או אינפלציה מתרחשת מהר מדי. לחלופין, אם הריאות אינן ניפוח היטב, הצינורית נדחקה ב רחוק מדי, וכך למנוע מעט.
7. אסוף שוטף נקווה בתוך שפופרת 15 מ"ל על הקרח.
8. סיבובהנוזל האווירי שטיפה 1,200 XG במשך 5 דקות, לאסוף supernatant לתוך צינור 1.5 מ"ל ולהקפיא ב -80 ° C. בהמשך, השתמש supernatant (כלומר, BALF) למדידת חלבון, ציטוקינים, ו עבור מבחני ביוכימיים שונים אחרים. הגלולה מייצגת תאים מהמרחב ברונכואלוואולרית.
9. אם תאי הדם האדומים (RBCs) ניכרים התא גלולה על בסיס צבע, lyse עם 1 מ"ל של חיץ תמוגה ACK עבור 1 דקות ואחריו תוספת של 5 מ"ל של 1x PBS כדי לעצור את התגובה תמוגה לדלל למאגר. טיפול בכל הדגימות זהות, בין אם מטופל או לא עם חיץ תמוגה ACK.
10. תאים ספין 1,200 XG במשך 5 דקות, למזוג supernatant, ולהביא את התאים עד 1 מ"ל של PBS 1x.
11. תאים וורטקס וספירה על hemocytometer עבור ספירה של תא אווירי הכולל.
12. בהתבסס על צפיפות של תאים להוסיף כ 80-150 μl (~ 80 μl עבור עכבר נגוע ~ 150 עבור עכבר נאיבי) אל חדר שקופיות על צנטריפוגות cytospin. תא ספיןים על שקופיות מיקרוסקופ מכתים המשך כדי לקבוע אוכלוסיות תאי הפרש.
13. אפשר תאים להתייבש בשקופיות לילה. כתם תאים עם כתם תלת (למשל, המיתי 3 [ראה טבלה]) על ידי טבילת השקופיות 7 פעמים ב מקבע, 9 פעמים כתם 1, ו -7 פעמים כתם 2 (לא שטיפות בין כתמים), ולאפשר לו להתייבש. אחרי הכתם התייבש, מגלשות coverslip באופן ידני לספור הפרשים ידי מיקרוסקופ. באופן כללי, נויטרופילים מונוציטים / מאקרופאגים נבדלים בקלות על ידי גודלם ומורפולוגיה גרעינית.

4. קביעת עומס חיידקים ברקמות ריאות היקפיות

1. לפני שמתחילים: להכין צינורות דילול עם 900 μl של 1x PBS עבור הריאות והטחול ו -90 μl של 1x PBS לדם. צלחות לייבל עבור culturing חיידקים ולהגדיר בטמפרטורת החדר; ולכן, ברגע רקמות נאספו זמן יהיה ממוזער בין המגון ציפוי התפתחות חיידקים.
   הערה: בשל deposi הטרוגניתtion של חיידקים בתוך הריאות שעלולות להתרחש עם שאיפה, מומלץ כי עכברים בודדים לשמש לניתוח או של cellularity דרכי נשימה המוחלטת או מוחלט ניטלת חיידקים (דו-צדדיות) ריאות.
2. להרדים את העכבר לפי צעד 3.1 ובהמשך לאסוף דם מן החדר השמאלי, צבת לתוך צינור heparinized כדי למנוע קרישה. הסר את כל אונה של הריאות ומכניסים צינור 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של PBS 1x, ואחריו הסרת הטחול והשמה לתוך 2 מ"ל של 1x PBS. מניחים צינורות על הקרח. תשמור על עצמך כדי לנקות מכשירים עם אתנול בין כל רקמה / עכבר.
3. Homogenize רקם על קרח, רצוי עם homogenizers הפנוי כי ניתן לשנות בין כל דגימה. טיפי homogenizer פנויים ניתן autoclaved לשימוש חוזר בין ניסויים.
4. לאחר רקמות כבר הומוגני, לבצע דילולים צלחת סדרתי. דגימות פלייט של רקמות / דילול נתון בשני עותקים בצלחת TSA יחידה על ידי ציור קו הפרדה על הפלסטיק. ציפוי diהצעות lution מוצגים להלן (בכל המקרים, 10 μl של המדגם היא התפשטה לצלחת) ומבוססים על necropsy 24 שעות לאחר ההדבקה. אם לנתח 48-72 דגימות hr, מספר רב יותר של דילולים ייתכן שיהיה צורך מצופה בשל ניטל חיידקים מוגבר בנקודות מאוחר יותר זמן.
   1. לדם - לדלל 01:10 על ידי הוספת 10 μl של דם לתוך 90 μl של PBS 1x סטרילי. פלייט מסודר 01:10 דגימות מדוללות כפול. ברגע הדם כבר מצופה, ספין דם שיורית 9,300 XG במשך 10 דקות כדי לחלץ פלזמה למדידת ציטוקינים chemokines.
   2. עבור ריאות - לדלל 01:10 - 1: 100 על ידי הוספת 100 μl של הריאות הומוגני לתוך 900 μl של PBS 1x סטרילי סדרתי. פלייט homogenate מסודר וכל דילולים בשני עותקים.
   3. עבור טחול - לדלל 1: 10-1: 100 על ידי הוספת 100 μl של הטחול הומוגני לתוך 900 μl של PBS 1x סטרילי סדרתי. פלייט homogenate המסודר הוא הדילולים בשני עותקים.
5. אפשר דגימות התפשטות להתייבש בקצרה.
6. הפוך צלחות TSA ומניח C חממת סטטי 37 מעלות למשך הלילה.
7. לקבוע את מספר חיידקים מיישבים על ידי חישוב ממוצע מושבות חיידקים משני צידי הצלחת ומכל דילול. גורמים דילולים הראשוניים של 5 מיליליטר עבור ריאות ו -2 מיליליטר עבור טחול לקבוע CFUs רקמות מוחלט.

תוצאות

עכברים C57BL / 6 נדבקו עם 2000 CFU של ק pneumoniae 43,816 (סרוטיפ 2) דרך שאיפת לוע תחתונה לריאות. במינון זה, עכברים בדרך כלל מתחילים להראות תסמינים קליניים 12-24 שעות לאחר פגיעה כולל עייפות, פרווה פרועה, וירידה במשקל של 5-10% (איור 2 א). בתוך 48-72 שעות לאחר פגיעה,...

Discussion

מודלים Murine של דלקת ריאות חיידקית, שותפות עם מיקוד גנים in vivo התערבויות ביולוגיות תרופתי, סיפקו תובנות קריטיות לתוך התגובה ההגנה המארחת ריאתי. התקדמות גדולה נעשתה בפרט בהבנתנו של כמוקינים ומולקולות דבקות השולטים גיוס של נויטרופילים הכניסה למרחב האוירי הנגועה ^...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Klebsiella pneumoniae, serotype 2	ATCC	43816
Tryptic soy broth	Becton Dickenson	211825
Excel Safelet IV Catheters, 18 G x 1 1/4"	Claflin Medical Equipment	MEDC-031122
Hema 3 Solution 1	Fisher	23-122-937
Hema 3 Solution 2	Fisher	23-122-952
Hema 3 Fixative	Fisher	23-122-929
27½ gauge tuberculin syringes	Fisher	14-826-87
Lithium heparin plasma collectors	Fisher	2675187
L-shaped disposable spreaders	Lab Scientific	DSC
1x PBS, pH 7.4	prepared in-house	n/a	Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g)
ACK lysis buffer	prepared in-house	n/a	NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4