Farelerde Deneysel Bakteriyel Pnömoni İndüksiyonunun ve fenotipleme bir Non-invaziv ve Teknik Olmayan yoğun Yöntem

Özet

Çeşitli yöntemler, farelerde bakteriyel pnömoni modelleme için literatürde tarif edilmiştir. Bu yazıda, orofarinksin pipetle bakteriyel inokulum aspirasyonu (yani, inhalasyon) yoluyla zatürree uyarılması için bir non-invaziv, ucuz, hızlı bir yöntem açıklanmaktadır. akciğer doğal bağışıklık yanıtının değerlendirilmesi için aşağı akış yöntemleri de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Özet

Toplum kökenli pnömoni, önemli bir halk sağlığı sorunu olmaya devam etmekle beraber, bakteriyel pnömoni fare modelleri son zamanlarda yatan hücresel ve moleküler patogenezi anlayışımızda önemli preklinik gelişmeler kolaylaştırmıştır. In vivo fare modelleri konak savunma tepkisi entegre fizyolojisini ve dayanıklılığını yakalamak bir şekilde alternatif basitleştirilmiş ex vivo yaklaşımlar ortaya değildir. Çeşitli yöntemler intrapulmoner aerosol içeren farelerde bakterilerin aşılanmasından, Burun içinden tatbikat, "kör" ve görsel koşullar altında oral endotrakeal kanülasyon ve deri endotrakeal kanülasyon için literatürde tarif edilmiştir. Tüm yöntemler göreceli yararları ve sınırlamaları vardır. Bu yazıda, detaylı fare ile aspirasyon (yani, inhalasyon) içeren bakterilerin intratrakeal teslimat için, non-invaziv teknik olarak yoğun olmayan, ucuz ve hızlı bir yöntem tarifise genel anestezi altında orofarenks pipetle bir bulaşıcı inokulum. Bu yöntem olmayan yakıcı biyolojik ve kimyasal maddeler, çok çeşitli akciğer verilmesi için kullanılan, ve hatta solunum prosedürlere az deneyimi olan Laboratuvar öğrenmek nispeten kolay olabilir. Aspirasyon pnömonisi yöntemi açıklayan ek olarak, aynı zamanda, özellikle, in vivo fare akciğer doğal immün yanıtının daha sonra analiz edilmesi için adım adım prosedürleri sağlayan bakteriyel açıklık ve enfekte solunum hücresel bağışıklık tepkisi ölçülmesi için yöntemler. pnömoni değerlendirmesine Bu entegre ve basit bir yaklaşım pulmoner doğuştan gelen bağışıklık üzerine genetik ve çevresel manipülasyon etkisi hızlı ve sağlam değerlendirme için izin verir.

Giriş

Toplum kökenli pnömoni aşılama iyileştirmeler ve antibiyotik stratejileri ^1,2 rağmen son 40 yılda ölüm oranlarında küçük genel değişiklikle, ABD'de enfeksiyon ölümlerin başta gelen nedenidir. halk sağlığı düzeyinde algılanabilir ilerleme olmamasına rağmen, son yıllarda dramatik gelişmeler öne akciğer enfeksiyonu fare modellerinin kullanımı ile mümkün bu adımların çoğu ile, pnömoni moleküler ve hücresel patogenezinin yapılmıştır. farenin genetik izlenebilir, murin ve insan bağışıklık sistemi ve ticari olarak temin edilebilir hale gelmiştir murin hedefli immünolojik reaktifler geniş bir dizi benzerliği bir araya alan hızlı bir ilerleme kolaylaştırmıştır.

literatürde tarif bakteriyel pnömoni Fare modelleri genellikle patojen aşılama için dört teknik yolları üzerine dayanıyordu: i) aerozolizasyonuna; ii) geçişsizanasal dağıtım; iii) oral doğum; ve iv) cerrahi intratrakeal enjeksiyon (yani, trakeotomi) ^3. Enfeksiyonun tüm yolları avantajları ve dezavantajları ³ var. oronazal florası, genel anestezi için gereksinimleri karışım özellikle, göreceli üst solunum yolunun maruz kalma potansiyeli distal akciğer teslim inokulum teslim patojenlerin lober dağılımı, teknik uzmanlık gereksinimleri ve prosedürel morbidite değişkenliği bu çapında büyük ölçüde değişiklik yaklaşımlar.

Yaygın kullanılan oral enfeksiyon teknikleri veya doğrudan laringeal görselleştirme ^3-5 altında bir 'kör' (non-görüntülenmiştir) yaklaşımı ya vasıtasıyla endotrakeal (translaryngeal) kanül içerir. Her iki yöntem de, sağlam iken, önemli eğitim gerektiren ve aynı zamanda üst solunum travma riski taşımaktadır. Mevcut raporda, w, oral enfeksiyon teknik, yoğun olmayan non-invaziv, ucuz ve hızlı bir yöntem tarifburada bakteriler (verilen örnekte Klebsiella pneumoniae) aspirasyon (yani, inhalasyon) yoluyla akciğerlere iletilir bir anestezi fare orofarenks pipetlenir. Biz ve diğerleri başarıyla ^6-9 aspirasyon pnömonisi tekniği kullandık. Bu çok yönlü ve kolayca öğrenilebilir akciğer dağıtım yöntemi, sitokinlere ve başka proteinlere, patojenle ilişkili moleküller (örneğin lipopolisakkarid), hücrelerin (örneğin, adoptif transfer) da dahil olmak üzere akciğer, pek çok ek olmayan kostik maddelerin iletimi için uzatılabilir ve toksinler (örneğin, bleomisin). Önemli bir teknik konuları ele ek olarak, aynı zamanda alt-bakteriyel açıklık ölçümünde (yani, koloni oluşturan birim [CFU] akciğer ve periferik organlarda miktar tayini), lökosit gibi pnömoni sonraki ana cevabın değerlendirilmesi için entegre, kantitatif bir yaklaşım tarif hava sahasında birikimi.

Protokol

Bütün deneyler Hayvan Bakımı ve NIEHS Kullanımı Komitesi tarafından incelendikten sonra Hayvan Refahı Yasası ve İnsani Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımına İlişkin ABD Kamu Sağlığı Hizmetleri Politikası'na uygun olarak yapıldı.

K. 1. Hazırlık pneumoniae Kültür

Dikkat: Bir biyogüvenlik düzeyi 2 (BSL2) başlık veya başka bir BSL2 belirlenmiş alandaki tüm adımları uygulayın ve enstitü BSL2 kurallarına göre atık atmak.

1. K. süspansiyon büyümesi için pneumoniae, bakteri, bir gliserol stokundan çözülmesi ve K. 1 ml aktarılarak bir çalışma kültürünün aşılanması 500 ml'lik bir ya da daha büyük bir şişe içinde triptik soya suyu (TSB) içinde, 50 ml pneumoniae stok.
2. Kültürlü log-faz K. 900 ul ekleyerek gliserol stokları yapmak pneumoniae steril gliserol, 100 ul -20 ° C veya -80 ° C donma. Uzun süreli depolama için, -80 ° C tavsiye edilir.
3. s 'den bir bakterigece boyunca balon çalkalanarak 1.1 TEP -, 200-225 rpm.In log fazı büyümesini teşvik etmek için 37 ° C'de (14 ila 18 saat) sabah 50 ml TSB içeren bir şişeye, bu gece boyunca kültürün 1-5 ml seyreltik ~ 2.5 saat boyunca çalkalanarak 37 ° C'de geri koyun.
4. K. 1 ml aktarın 2 dakika süreyle 7500 xg'de 1.5 ml tüp ve spin içine son adımından pneumoniae kültürü. Beyaz pelet görünür olmalıdır. yavaşça steril tuzlu su, 1 ml pipet ile bakteri tekrar süspansiyon, pelet bozmadan süpernatantı ve 2 dakika boyunca 7500 x g hızında tekrar döndürür.
   1. Bu yıkama adımı 2x gerçekleştirmek steril tuzlu su, 1 ml nihai, yıkanır ve yetiştirme.
5. Bu temiz inokulum log-bilge seri dilüsyonları gerçekleştirin. Örneğin, seri 10 ^-1 -10 ^-9 seyreltme dizi yapmak için steril serum fizyolojik 3.6 ml inokulum 400 ul ekleyin.
6. Yıkanmış K. OD ₆₀₀ belirleyin pneumoniae 1 ml koyarak1:10 ve 1: steril tuzlu su ile ilk kesme tek kullanımlık küvetler ve OD ₆₀₀ ölçmek içine 100 dilüsyonları. doğruluğunu sağlamak için çiftleri ölçün. 1.0 bir OD ₆₀₀ 4-7 x 10 ⁸ CFU / ml eşdeğerdir. OD CFU ilişkisi / ml doğrusal unutmayın.
   1. K. konsantrasyonunu hesaplamak için dilüsyonları gelen OD ₆₀₀ kullanın pneumoniae, OD uygulayarak: CFU / ml üzerinde dönüşüm ve faktoring seyreltme.
7. K. kullanın pneumoniae konsantrasyonu (aşağıya bakınız) farelere dağıtımı için bir <100 ul hacim içinde, istenen aşı CFU doz hazırlanması için.
8. Ayrıca 10 ^-6 -10 ^-9 seyreltileri, 100 ul ve oda sıcaklığında tek tek triptik soya ağarı (TSA) plakaları üzerine steril tuzlu su, 100 ul plaka. 37 ° C'de gece boyunca inkübe edildi ve deneyde kullanıldı ve kirlenme kontrol etmek için tam konsantrasyonu hesaplamak için bakteri kolonileri numaralandırmak.
   NOT: Son inokulum Gerçek bakteri konsantrasyonu 500 CFU / absorbans tahmin ml ± olabilir. Kendi kişisel deneyime dayalı CFU / ml dönüşüm: ampirik OD ₆₀₀ tekrar ayarlanmasına, farelerde in vivo kullanımdan önce pilot çalışmalarda CFU / ml ilişki: deneyci ideal OD ₆₀₀ teyit etmelidir.

K. 2. Fare intratrakeal (it) Aspirasyon orofarenksten pneumoniae

1. Bu fareler sağlamak benzersiz kuyruk işareti, dövme veya onaylanmış diğer tanımlayıcı ile tanımlanır.
2. prosedürünü hızlandırmak için izofluran fareleri çıkarmadan önce P200 pipet kullanarak bakteri inokulum dozaj hazırlayın. o aspirasyon ile en iyi sonuçları elde etmek için, taşmasını önlemek için <100 ul bir hacme kullanın. Burada K. 2000 CFU / 50 ul kullanın pneumoniae.
3. Izofluran gaz (1 L / dakika akış hızında, örneğin,% 2 izofluran) açık bir oda içinde veya enstitüsü göre fareler anesteziutional kurallar. Birlikte anestezi farelerin sayısı deneyci konfor düzeyi, aynı anda tipik olarak 1-2 ile tespit edilir. nefes gözlemleyin ve derin nefes görülebilir ve 2-3 sn nefesler arasında sayılabilir kez anestezi seviyesini onaylamak.
   NOT: Uçucu (inhalasyon) anestezik olası karıştırıcı etkileri hakkında endişe varsa, anestezi ketamin / xylazine intraperitoneal enjeksiyonu ile yerine elde edilebilir. Yukarıda tarif edilen yöntemle, Derin anestezi sadece birkaç dakika sürer. daha uzun süreli anestezinin ise, göz merhemi okular kuruma önlemek için kullanılmalıdır.
4. Fare uyuşturulduktan sonra, bir eğimli pleksiglas gemide mandal (Şekil 1) arasında gerilmiş bir lastik bant gelen maksiller kesici tarafından askıya bir semirecumbent yatar pozisyonda, içinde konumlandırmak.
5. Yavaşça P200 pipett ile ağız boşluğuna künt bir olmayan çıkıntılı forseps çifti ve mevduat dozu ile yan fare dilini çekine. dil ya da orofarenks ya travmayı uyaran önlemek için büyük özen.
6. geri dil tutarken fare nefes kadar hafifçe eldivenli parmak ile burun tıkamak. Fare iki veya daha fazla inhalasyonları almıştır ve hiçbir sıvı ağız boşluğunda görünür oluncaya kadar burun kapsayacak şekilde devam ediyor. burun kapsayan fareler zorunlu burun solunumu bağımlısı olarak fare, akciğerlere bakterileri nefes sağlamaya yardımcı olur.
7. aşılama kurulu fareyi çıkarın ve fare anestezi sonrası iyileşme ise burun deliğine engelleme yatak veya enkaz önlemek için sırtında fare koyarak, kendi kafesine geri dönün.
8. Bir kez tüm fareler dozda edilmiş ve anestezi uyandı, K. ile dozlanmış olan tek fareler içeren bir hücre / odasında ev fareleri 48 saat sonrası enfeksiyon ötesinde eğer pneumoniae. vücut ağırlıkları da dahil olmak üzere, günlük fareler izleyin.
9. fareler 48 ötesine gitmek için izin eğer günlük püre ve / veya tamamlayıcı ısı kullanınhr.

3. Bronkoalveolar Lavaj Sıvısı (BALS) Toplama ve Analizi

1. kurumsal kurallarına göre fareler Euthanize. Bu _CO2 inhalasyonu ve servikal dislokasyon ile ilişkili akciğer mümkün komplikasyonları önler olarak burada, 150 mg / kg sodyum pentobarbital ya kansız bırakılarak ardından ticari bir ötanazi çözeltisinin eşdeğer doz öldürücü bir enjeksiyon kullanımı.
2. sırtında pozisyon fare ve özellikle göğüs ve boyun bölgesinde üzerinde% 70 etanol ile kürk püskürtülerek fare sterilize edin.
3. daha sonra forseps ile sternum tutarak, sadece sternum altında uzunlamasına kesim olun, nick akciğer sağlayan diyafram, göğüs boşluğuna geri düşmek. trakea açığa damarsal her iki tarafındaki göğüs boşluğu yoluyla kesilmekte ve sonra boynundan yukarı.
4. trakea iki tarafında boyuna kasların tarafından çevrelenmiş olarak, dikkatle, ortasından kesilmiş ve yanlara doku itmekBu trakea içine kan getirebilir çevreleyen damarsal, kesme önler. damar nicked ise, önce trakea lümeni erişim için gazlı bez ile çevredeki temizleyin.
5. nick trakea baş aşağı yolda yaklaşık ¼ cerrahi makas veya bir iğne kullanın ve kaudal trakea içine 1x fosfat tamponlu salin (PBS) 1 ml önceden yüklenmiş bir 1 ml şırınga bağlı bir kanül yerleştirin. kullanarak fareler ya da kadınların 8 hafta
6. tüm loblar şişirmek ve sonra 3x tekrarlayarak, şırınga ile geri dışarı hacmi çekmeye izin yavaşça akciğer içine hacmi itin. PBS burun deliklerinin çıkan ise kanül trakea içine yeterince itti edilmemiştir ya da enflasyon çok hızlı gerçekleşiyor. akciğerleri iyi şişirme değil Alternatif olarak, kanül çok itti olmuştur, bu yüzden biraz geri çekin.
7. Buz üzerinde 15 ml bir tüp içinde havuzlanmış yıkama toplayın.
8. Çevirmek5 dakika boyunca 1200 x g'de hava boşluğu lavaj sıvısı, 1.5 ml tüp içine süpernatan toplamak ve -80 ° C'de dondurun. Daha sonra, protein, sitokinler ve çeşitli diğer biyokimyasal tahlillerde ölçülmesi için supernatant (yani, BALF) kullanın. Pelet bronkoalveoler boşluktan hücreleri temsil eder.
9. Kırmızı kan hücreleri (RBC) rengine göre hücre peleti belirgin ise, 1 x PBS, 5 ml ilave edilir, 1 dakika boyunca ACK lisiz tamponu 1 ml lize parçalama reaksiyonu durdurun ve tampon sulandırmak için. ACK lisiz tamponu ile muamele edilmiş olsun veya olmasın, aynı Tüm örnekler ele alın.
10. Sıkma hücreler 5 dakika süreyle 1.200 xg, süpernatant süzün ve 1 x PBS, 1 ml hücre getir.
11. Toplam hava sahası hücrelerinin sayımı için bir hemasitometre Vortex ve sayım hücreleri.
12. hücrelerin yoğunluğuna dayalı (80 virüslü bir fare için ul ve naif bir fare için ~ 150 ~) bir sitospin santrifüj slayt odasına yaklaşık 80-150 ul ekleyin. Spin hücremikroskop üzerine s hücre ayırıcı nüfusu belirlemek sonraki boyama kayar.
13. Hücreler gecede slaytlar üzerinde kurumaya bırakın. Leke leke 2 slaytlar sabitleştirici 7 kez, leke 1 9 kez, ve 7 kez batırarak tri-leke (örneğin, Hema 3 [tabloya bakınız]) ile hücreleri (lekeleri arasında durulama), ve kurumasını bekleyin. leke kuruduktan sonra, elle lamel slaytlar ve mikroskopta farklılıkları saymak. Genel olarak, nötrofiller ve monosit / makrofajlar kolayca boyutu ve çekirdek morfolojisine ile ayırt edilir.

4. Akciğer ve periferik dokularda Bakteriyel Yük belirlenmesi

1. Başlamadan önce: akciğer ve dalak için 1x PBS 900 ul ve kan 1x PBS 90 ul seyreltme tüpler hazırlamak. bakteri kültürü için ve oda sıcaklığında ayarlanmış etiket plakaları; Bu yüzden, doku toplandığında zaman bakteri büyümesi için homojenizasyon ve kaplama arasındaki en aza indirilmiş olacaktır.
   Not: nedeniyle heterojen deposi içinaspirasyon ile oluşabilir akciğerlerde bakterilerin tion, bireysel fareler toplam havayolu selülaritede veya toplam (iki taraflı) akciğer bakteriyel yükü ya analizinde kullanılması tavsiye edilir.
2. Adım 3.1 göre fare Euthanize ve daha sonra pıhtılaşmayı önlemek için bir heparinli tüpe koyarak, sol karıncıktan kan toplamak. 1x PBS 2 ml dalak ve yerleştirme uzaklaştırılarak elde edilmiş 1 x 5 ml PBS içeren 15 ml'lik bir tüp içinde akciğer lobları yer çıkarın. buz üzerinde tüpler yerleştirin. Her doku / fare arasında etanol ile aletleri temizlemek için özen gösterin.
3. tercihen her bir numune arasında değiştirilebilir tek homojenizatör ile buz üzerinde doku homojenize edilir. Tek kullanımlık homojenleştirici ipuçları deneyler arasında yeniden kullanım için otoklava sokulabilir.
4. dokusu homojenize edildikten sonra, seri dilüsyonları ve plakayı gerçekleştirin. plastik üzerine bir ayrım çizgi çizerek, tek bir TSA plaka üzerinde nüsha olarak verilen bir doku / seyreltme plaka örnekleri. Kaplama ve didökülmesinden önerileri aşağıda gösterilmiştir (her durumda, örneğin 10 ul plaka üzerine yayılır) ve 24 saat sonra, enfeksiyon otopsi dayanmaktadır. 48-72 saat örnekleri analiz için, dilüsyonları daha çok sayıda daha sonraki zaman noktalarında artan bakteri yükü nedeniyle kaplama gerekebilir.
   1. Kan - steril 1x PBS 90 ul içine kan 10 ul ekleyerek 1:10 sulandırmak. Plaka temiz ve iki nüsha halinde 01:10 seyreltilmiş numuneler. Kan kaplama sonra 10 dakika sitokinler ve kemokinlerin ölçümü için plazma elde etmek için, 9,300 xg, artık kan dönerler.
   2. seri steril 1x PBS 900 ul içine homojenize akciğer 100 ul ekleyerek 100: Akciğer İçin - 1 - 1:10 sulandırmak. Plaka düzgün homojenat ve iki nüsha halinde tüm dilüsyonlar.
   3. Dalak için 1 - sulandırmak: 10-1: 100 seri steril 1x PBS 900 ul içine homojenize dalak 100 ul ekleyerek. Plaka düzgün homojenat ve iki nüsha halinde, her iki dilüsyonlar.
5. yayılmış örnekler kısaca kurumaya bırakın.
6. Gecede bir statik 37 ° C inkübatör TSA plakaları ve yeri ters çevirin.
7. levhasının her iki tarafından ve her çözücüden bakteri kolonileri ortalayarak kolonize bakteri sayısını belirler. akciğer için 5 ml ve dalak için 2 ml başlangıç ​​dilüsyonları faktör toplam doku CFU belirlemek için.

Sonuçlar

C57BL / 6 fareleri K. 2000 CFU ile enfekte edilmiştir akciğerlere orofaringeal aspirasyon yoluyla pneumoniae 43816 (serotip 2). Bu dozda, fareler genelde klinik belirtiler uyuşukluk, karıştırdı kürk ve% 5-10 (Şekil 2A) kilo kaybı da dahil olmak üzere 12-24 saat sonrası enfeksiyon göstermeye başlar. 48-72 saat sonrası enfeksiyon içinde, farelerin birçok tipik azalmış aktivite ile hunched duruşlar% 20 kilo kaybı ve sonuçların ortala...

Tartışmalar

Bakteriyel pnömoni Murin modelleri, pulmoner konak savunma tepkisi içine kritik anlayışlar sağladı, gen hedefleme ve in vivo biyolojik ve farmakolojik girişimlerin ortak oldular. Büyük gelişmeler enfekte hava sahasında ^10,11 nötrofillerin işe yöneten kemokinler ve adezyon moleküllerinin anlayışımızda özellikle yapılmıştır. Pnömoni in vivo modelleri, hücre bazlı veya alternatif yaklaşımlar aksine, aynı zamanda endokrin içine anahtar anlayışlar sağlad...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Klebsiella pneumoniae, serotype 2	ATCC	43816
Tryptic soy broth	Becton Dickenson	211825
Excel Safelet IV Catheters, 18 G x 1 1/4"	Claflin Medical Equipment	MEDC-031122
Hema 3 Solution 1	Fisher	23-122-937
Hema 3 Solution 2	Fisher	23-122-952
Hema 3 Fixative	Fisher	23-122-929
27½ gauge tuberculin syringes	Fisher	14-826-87
Lithium heparin plasma collectors	Fisher	2675187
L-shaped disposable spreaders	Lab Scientific	DSC
1x PBS, pH 7.4	prepared in-house	n/a	Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g)
ACK lysis buffer	prepared in-house	n/a	NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4