Неинвазивным и технически неинтенсивное метод индукции и Фенотипирование экспериментальной бактериальной пневмонии у мышей

Резюме

Существует несколько методов, были описаны в литературе для моделирования бактериальной пневмонии у мышей. Здесь мы опишем неинвазивный, недорогой, быстрый метод для индукции пневмонии с помощью аспирации (т.е. ингаляции) бактериального инокулюма пипеткой в ротоглотки. Downstream методы оценки легочной врожденного иммунного ответа также подробно.

Аннотация

Несмотря на то, внебольничная пневмония остается серьезной проблемой общественного здравоохранения, мышиные модели бактериальной пневмонии в последнее время способствовали значительные доклинические успехи в нашем понимании основного клеточного и молекулярного патогенеза. В естественных условиях мышиные модели захвата интегрированной физиологии и устойчивость ответа хозяина обороны в манера не выявлены альтернативные, упрощенные подходы естественных условиях экс. Существует несколько методов, были описаны в литературе для внутрилегочного инокуляции бактерий у мышей, в том числе аэрозолизация, интраназального, пероральной интубации пункции под «слепой» и визуализированных условий, а также чрескожного эндотрахеальную канюлю. Все методы имеют относительные преимущества и недостатки. Здесь мы опишем подробно неинвазивный, технически неинтенсивное, недорогой и быстрый способ доставки трахею бактерий , которые включает в себя стремление (то есть, ингаляции) с помощью мышиинфекционного инокулята пипеткой в ​​ротоглотки в то время как под общим наркозом. Этот метод может быть использован для легочной доставки широкого спектра не-едких биологических и химических агентов, и сравнительно легко узнать, даже для лабораторий с минимальным предшествующего опыта с легочным процедурами. В дополнение к описанию метода аспирационной пневмонии, мы также обеспечиваем процедуры шаг за шагом будут анализироваться последующем в естественных условиях легочной врожденной иммунной реакции мыши, в частности, методы количественной оценки бактериального клиренса и клеточный иммунный ответ инфицированного дыхательные пути. Такой комплексный и простой подход к оценке пневмонии позволяет быстро и надежной оценки влияния генетических и экологических манипуляций при легочном врожденного иммунитета.

Введение

Внебольничная пневмония остается ведущей причиной смерти от инфекции в США, с небольшим общим изменением показателей смертности за последние 40 лет , несмотря на улучшение вакцинации и антибиотиков стратегий ^1,2. Несмотря на отсутствие заметного прогресса на уровне общественного здравоохранения, в последние годы драматические успехи были достигнуты в нашем понимании молекулярном и клеточном патогенеза пневмонии, причем многие из этих шагов вперед стало возможным за счет использования мышиных моделях легочной инфекции. Генетический трактабильность мыши, подобие мышиного и иммунной системы человека, а также широкий спектр мышиных ориентированных на иммунологических реагентов, которые стали коммерчески доступными были вместе способствовали быстрому прогрессу области.

мышиных моделях бактериальной пневмонии, описанной в литературе, как правило, на которые ссылается один из четырех технических маршрутов для патогена прививки: I) аэрозолизацию; б) ВВЕДЕНИАнасаль доставки; III) пероральной доставки; и IV) хирургический интратрахеальное инъекции (т.е., трахеотомия) ^3. Все маршруты инфекции имеют свои преимущества и недостатки ^3. В частности, относительно воздействия верхних дыхательных путей, потенциал для примесью oronasal флоры, требования к общей анестезии, изменчивость посевного материала, подаваемого в дистальной легкого, распределение долевой поставляемых патогенов, требований технических знаний, а также процедурный заболеваемости широко различаются эти подходы.

Широко используемые методы пероральные инфекции включают эндотрахеальную (трансларингеальной) катетеризацию либо через «слепого» (не визуализируется) подхода, или под прямой визуализации гортани ^3-5. Оба метода, в то время как надежные, требуют существенной подготовки, а также несут риск травмы верхних дыхательных путей. В настоящем докладе мы опишем технически неинтенсивное, неинвазивный, недорогой и быстрый метод пероральной инфекции, шНастоящим бактерии (Klebsiella пневмонии в приведенном примере) пипеткой в ротоглотки наркозом мыши доставляются в легкие с помощью аспирации (т.е., ингаляции). Мы и другие успешно ^6-9 использовали технику аспирационной пневмонии. Этот универсальный и легко узнали способ легкого доставки может быть продлен до поставки многих дополнительных не-едких веществ в легкие, в том числе цитокинов и других белков, патоген-ассоциированных молекул (например, липополисахаридными), клетки (например, усыновитель передачи), и токсины (например, блеомицин). В дополнение к обсуждению важных технических соображений, мы также описывают комплексный количественный подход к оценке последующего ответа хозяина к пневмонии, в том числе вниз по течению измерения бактериального клиренса (т.е. колониеобразующих единица [КОЕ] Количественное в легких и периферических органах) и лейкоцитарного накопление в воздушном пространстве.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с Законом об охране животных и политики по гуманной уходу и использованию лабораторных животных США общественной службы здравоохранения после рассмотрения по уходу и использованию животных комитета NIEHS.

1. Получение К. Пневмококк Культура

Внимание: Выполните все шаги в уровне биологической безопасности 2 (BSL2) капюшон или другой BSL2 назначенный район и отказаться от отходов согласно требованиям BSL2 института.

1. Для роста подвески К. Пневмококк, оттаивать глицерина запас бактерий и прививают рабочую культуру путем переноса 1 мл К. Пневмококк запас до 50 мл трипсинизированном соевого бульона (ТСБ) в 500 мл или больше колбу.
2. Сделать запасы глицерина путем добавления 900 мкл культивируют лог-фазы К. Пневмококк к 100 мкл стерильного глицерина и замораживанием при -20 ° С или -80 ° С. Для длительного хранения, рекомендуется -80 ° C.
3. Культура бактерий из SТЭП 1.1 встряхивая колбу в течение ночи (14 - 18 ч) при температуре 37 ° С при 200-225 rpm.In для того, чтобы способствовать росту лог-фазы, развести 1-5 мл этой ночной культуры в колбу, содержащую 50 мл TSB утром и поместить обратно при 37 ° C при встряхивании в течение ~ 2,5 ч.
4. Передача 1 мл К. Пневмококк культура от последнего шага в 1,5 мл трубки и спина при 7500 мкг в течение 2 мин. Белый осадок должен быть виден. Удалить супернатант, не нарушая гранул, осторожно ресуспендируют бактерии с пипеткой в ​​1 мл стерильного физиологического раствора, и снова закрутить при 7500 мкг в течение 2 мин.
   1. Выполните это мыть шаг 2x, в результате чего до окончательного, промытый осадок в 1 мл стерильного физиологического раствора.
5. Выполните лог-накрест серийные разведения этой аккуратной посевного материала. Например, добавьте 400 мкл посевного материала в 3,6 мл стерильного физиологического раствора последовательно , чтобы сделать серию 10 ^-1 -10 ^-9 разбавления.
6. Определить OD ₆₀₀ промытого K. Пневмококк путем размещения 1 мл1:10 и 1: 100 разбавление в одноразовые кюветы и измерения OD _600, маскировка первый стерильным физиологическим раствором. Мера дубликатов для обеспечения точности. OD ₆₀₀ 1,0 примерно соответствует 4-7 × 10 ⁸ КОЕ / мл. Заметим, что соотношение между наружным диаметром и КОЕ / мл, не может быть линейным.
   1. Используйте OD ₆₀₀ из разведений для расчета концентрации К. Пневмококк, применяя OD: преобразование КОЕ / мл выше, и факторинг в разведении.
7. С помощью К. Концентрация Пневмококк , для получения желаемой дозы инокулята КОЕ в <объеме 100 мкл для доставки на мышах (см ниже).
8. Также пластина 100 мкл 10 ^-6 -10 ^-9 разведений и 100 мкл стерильного физиологического раствора на отдельные трипсиновый соевый агар (ТСА) пластин при комнатной температуре. Инкубируют при 37 ° С в течение ночи и перечислить бактериальные колонии для расчета точной концентрации, которая была использована в эксперименте, и для контроля за загрязнением.
   Примечание: Фактическая концентрация бактериальной конечной посевного материала может составлять ± 500 КОЕ / мл, что предсказанный оптической плотности. Экспериментаторы идеале должен подтвердить OD _600: КОЕ / мл отношения в экспериментальных исследованиях перед использованием в естественных условиях у мышей, эмпирически перенастройки OD _600: КОЕ / мл конверсию на основе их личного опыта.

2. Мышиные Интратрахеального (она) аспирация К. Пневмококк из ротоглотки

1. Убедитесь в том, что у мышей однозначно определены хвост знака, татуировки или другого одобренного идентификатора.
2. Оформи дозирование посевного материала бактерий с использованием P200 пипетки перед извлечением мышей из изофлуран, чтобы ускорить процедуру. Для достижения наилучших результатов вместе с ним стремление, использовать объем <100 мкл, чтобы предотвратить переполнение. При этом использовать 2000 КОЕ / 50 мкл К. Пневмококк.
3. Обезболить мышей в прозрачной камере с изофлуран газа (например, 2% изофлуран при скорости потока 1 л / мин) или в соответствии с Institutional руководящих принципов. Число мышей обезболить вместе определяется уровнем комфорта экспериментатора, как правило, 1-2 за один раз. Соблюдайте дыхание и подтвердить уровень анестезии, как только глубоких вдохов видны и 2-3 сек можно пересчитать между вдохами.
   Примечание: Если есть опасения по поводу возможных искажающих эффектов летучих (ингаляционных) анестетиков, анестезия может быть достигнуто вместо того, чтобы с интраперитонеальной инъекции кетамина / ксилазина. С помощью метода, описанного выше, глубокой анестезии длится всего несколько минут. При более длительной анестезии индуцируется, глазная мазь следует использовать, чтобы предотвратить глазную высыхание.
4. После того, как мышь под наркозом, поместите его в положении лежа на спине в положении полулежа, подвешенного на верхних резцов из резиновой ленты , натянутой между колышками на наклонной доске из плексигласа (рисунок 1).
5. Осторожно потяните язычок мыши на стороне с парой тупых не-ребристых щипцов и депозитной дозы в ротовую полость с P200 pipettе. Проявлять большую осторожность, чтобы избежать вызывать травмы либо языка или ротоглотки.
6. Удерживая язык убирается, мягко закупорить нос пальцем в перчатке, пока мышь не вдыхает. Продолжить, чтобы покрыть нос, пока мышь не примет два или больше ингаляций, и жидкость не видна в полости рта. Покрытие нос помогает гарантировать, что мышь будет вдыхать бактерии в легкие, как мыши являются облигатными бризеры нос.
7. Отключив мышь от инокуляции доски и вернуться к своей клетке, помещая мышь на спине, чтобы предотвратить постельное белье или от мусора блокирование ноздрей в то время как мыши восстанавливается после анестезии.
8. После того, как все мыши были дозированного и пробудились от наркоза, домовые мыши в кабине / комнате , содержащие только мышей , которые были питателем с К. Пневмококк. Монитор мышей ежедневно, в том числе веса тела , если выход за пределы 48 ч после заражения.
9. Используйте ежедневный затор и / или дополнительного тепла, если позволяет мышам выйти за пределы 48ч.

3. БАЛ (БАЛ) Сбор и анализ

1. Эвтаназии мышей на институциональных руководящих принципов. При этом используют смертельную инъекцию 150 мг / кг пентобарбитала натрия или эквивалентной дозы коммерческого раствора эвтаназии с последующим кровопусканием, так как это позволяет избежать возможных осложнений в легких , связанных с СО ₂ вдоха и цервикальной дислокации.
2. Позиция мыши на спине и стерилизовать мышь путем распыления меха с 70% этанола особенно на груди и области шеи.
3. Сделать продольного разреза чуть ниже грудины, затем, удерживая грудины с пинцетом, юзеры диафрагма, что позволяет легкое упасть обратно в грудную полость. Нарезать через грудной полости по обе стороны от сосудистую сеть и затем вверх через шею, подвергая трахеи.
4. По мере того как трахея окружена продольными мышцами с обеих сторон, аккуратно прорезать середину и толкать ткань к сторонам, аэто позволяет избежать резки окружающую сосудистую сеть, которая могла бы ввести кровь в трахею. Если сосудистую систему порезал, очистить окрестности с марлей до доступа к трахеи просвет.
5. С помощью хирургических ножниц или иглы надрезать трахеи примерно на четверть пути вниз от головки и вставить канюлю, присоединенную к 1 мл шприц предварительно загруженной с 1 мл 1х фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) в каудальном направлении в трахею. Если с помощью мыши, <8-недельного возраста или женщин, уменьшить объем lavaging 600-800 мкл.
6. Нажмите громкость в легкое медленно, позволяя все лопасти, чтобы раздуть, а затем потяните объем обратно с шприц, повторяя 3 раза. Если PBS выходит из ноздрей канюля не были вытеснены достаточно далеко в трахею или инфляция происходит слишком быстро. В качестве альтернативы, если легкие не надувать хорошо, канюля была отодвинута слишком далеко, так что снимать немного.
7. Собрать объединенные типы недвижимости в 15 мл пробирку на льду.
8. Вращениевоздушное пространство промывную жидкость при 1200 х г в течение 5 мин, собирают супернатант в 1,5 мл пробирку и замораживают при температуре -80 ° С. В дальнейшем используют надосадочную жидкость (то есть, БАЛ) для измерения белка, цитокины, а также для различных других биохимических анализов. Осадок представляет собой клетки из бронхоальвеолярного пространства.
9. Если эритроциты (эритроцитов) очевидны в осадок клеток на основе цвета, лизируют с 1 мл ACK буфера для лизиса в течение 1 мин с последующим добавлением 5 мл 1x PBS, чтобы остановить реакцию лизиса и разбавить буфер. Обращайтесь со всеми пробами одинаково, либо лечение или нет с ACK буфера для лизиса.
10. Спин клетки при 1200 мкг в течение 5 мин, декантируют супернатант, и довести клетки в 1 мл 1x PBS.
11. Вихревые и подсчета клеток на гемоцитометра для подсчета общего количества клеток воздушном пространстве.
12. На основе плотности клеток добавляют примерно 80-150 мкл (~ 80 мкл для зараженной мыши и ~ 150 за наивный мышь) в слайд-камеру на цитоспина центрифуге. Спин клетокs на предметные стекла микроскопа для последующего окрашивания клеток для определения дифференциальной популяции.
13. Разрешить клетки высохнуть на слайды в течение ночи. Пятно клетки с тримарана пятна (например, Хема 3 [смотри таблицу]) путем погружения слайды 7 раз в фиксаторе, 9 раз в пятно 1 и 7 раз в пятно 2 (без полоскания между пятнами) и дайте высохнуть. После того, как пятно высохнет, покровное слайды и вручную рассчитывать дифференциалы под микроскопом. Как правило, нейтрофилы и моноциты / макрофаги легко отличить по их размеру и морфологии ядра.

4. Определение бактериальной нагрузки в легких и периферических тканях

1. Перед началом: подготовить разведения пробирки с 900 мкл 1x PBS для легкого и селезенки и 90 мкл 1x PBS для крови. Этикетка пластины для культивирования бактерий и установить при комнатной температуре; Поэтому, как только ткань была собрана время будет сведено к минимуму между гомогенизацией и обшивкой для роста бактерий.
   Примечание: В связи с гетерогенной deposiции бактерий в легких, которые могут возникнуть при аспирации, рекомендуется, чтобы отдельные мышей можно использовать для анализа либо общей клеточности воздушной трассы или полного (двустороннего) легкого бактериальной нагрузки.
2. Эвтаназии мышь, как на шаге 3.1, а затем собирают кровь из левого желудочка, помещая в гепаринизированной трубки, чтобы избежать свертывания крови. Удалить все долей легких и места, в 15 мл пробирку, содержащую 5 мл 1x PBS с последующим удалением селезенки и размещения в 2 мл 1x PBS. Поместите пробирки на лед. Позаботьтесь, чтобы очистить инструменты с этанолом между каждой ткани / мышь.
3. Однородный ткани на льду, предпочтительно с одноразовыми гомогенизаторов, которые можно изменять между каждым образцом. Одноразовые наконечники гомогенизатор может быть автоклавного для повторного использования между экспериментами.
4. После того, как ткань была гомогенизируют, выполнять серийные разведения и пластины. Пластинчатые образцы данной ткани / разбавления в двух экземплярах на одной пластине TSA, нарисовав разделительную линию на пластике. Обшивка и дипредложения люция приведены ниже (во всех случаях, 10 мкл образца наносили на пластину), и основаны на 24 ч после инфицирования аутопсии в. При анализе образцов 48-72 ч, в то большее количество разведений, возможно, потребуется, чтобы быть покрыты за счет увеличения бактериальной нагрузки в более поздние моменты времени.
   1. Для получения крови - разбавить в соотношении 1:10, добавляя 10 мкл крови в 90 мкл стерильного 1x PBS. Тарелка аккуратным и 1:10 разбавленные образцы в двух экземплярах. После того, как кровь была гальваническим, спина остатки крови при 9300 х г в течение 10 мин для извлечения плазмы для измерения цитокинов и хемокинов.
   2. Для Lung - развести в соотношении 1:10 - 1: 100 путем добавления 100 мкл гомогенизированной легких в 900 мкл стерильного 1x PBS последовательно. Тарелка аккуратно гомогенат и все разведений в двух экземплярах.
   3. Для Селезенка - разбавить 1: 10-1: 100 путем добавления 100 мкл гомогенизированной селезенки в 900 мкл стерильного 1x PBS последовательно. Тарелка аккуратно гомогенат и оба разведений в двух экземплярах.
5. Разрешить распространение образцов немного высохнуть.
6. Обратить TSA пластины и место в статическом 37 ° C инкубаторе в течение ночи.
7. Определить количество бактерий колонизаторов путем усреднения бактериальных колоний с обеих сторон пластины и из каждого разведения. Фактор в начальных разведениях 5 мл для легкого и 2 мл для селезенки, чтобы определить общее количество КОЕ ткани.

Результаты

C57BL / 6 заражали 2000 КОЕ К. Пневмококк 43816 (серотип 2) с помощью ротоглотки аспирации в легкие. При этой дозе у мышей , как правило , начинают показывать клинических симптомов 12-24 ч после инфекции , включая летаргии, взъерошенными меха, и потеря веса на 5-10% (рисунок 2

Обсуждение

Мышиные модели бактериальной пневмонии, в партнерстве с генной ориентации и в естественных условиях биологических и фармакологических вмешательств, обеспечили критические идеи в легочную хозяина защитной реакции. Большие успехи были достигнуты , в частности , в нашем понимании ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Klebsiella pneumoniae, serotype 2	ATCC	43816
Tryptic soy broth	Becton Dickenson	211825
Excel Safelet IV Catheters, 18 G x 1 1/4"	Claflin Medical Equipment	MEDC-031122
Hema 3 Solution 1	Fisher	23-122-937
Hema 3 Solution 2	Fisher	23-122-952
Hema 3 Fixative	Fisher	23-122-929
27½ gauge tuberculin syringes	Fisher	14-826-87
Lithium heparin plasma collectors	Fisher	2675187
L-shaped disposable spreaders	Lab Scientific	DSC
1x PBS, pH 7.4	prepared in-house	n/a	Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g)
ACK lysis buffer	prepared in-house	n/a	NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4