Um método não-invasivo e tecnicamente não-intensivo para indução e fenotipagem of Experimental pneumonia bacteriana em ratos

Resumo

Vários métodos foram descritos na literatura para a modelagem de pneumonia bacteriana em murganhos. Aqui, nós descrevemos um método de baixo custo, rápida não-invasiva para induzir pneumonia por aspiração (isto é, por inalação) de um inoculo bacteriano pipetados para a orofaringe. métodos a jusante para avaliação da resposta imune inata pulmonar também são detalhados.

Resumo

Embora a pneumonia adquirida na comunidade continua sendo um grande problema de saúde pública, modelos murinos de pneumonia bacteriana recentemente facilitada avanços pré-clínicos significativos em nossa compreensão da patogênese celular e molecular subjacente. Modelos in vivo rato capturar a fisiologia integrada e resiliência da resposta de defesa do hospedeiro em uma forma não revelada por, simplificado vivo abordagens alternativas ex. Vários métodos foram descritos na literatura para a inoculação de bactérias intrapulmonar em ratinhos, incluindo o tratamento com aerossóis, administração intranasal, endotraqueal canulação perorai sob condições "cegas" e visualizadas, e canulação endotraqueal transcutânea. Todos os métodos têm méritos e limitações relativas. Aqui, nós descrevemos em pormenor um método não-invasivo, tecnicamente não intensiva, de baixo custo, e para a entrega rápida intratraqueal de bactérias que envolve a aspiração (isto é, por inalação) pelo mousede um inoculo infeccioso pipetados para a orofaringe, enquanto sob anestesia geral. Este método pode ser utilizado para a administração pulmonar de uma grande variedade de agentes químicos e biológicos não cáustico, e é relativamente fácil de aprender, mesmo para laboratórios com o mínimo de experiência anterior com procedimentos pulmonares. Além de descrever o método de pneumonia por aspiração, nós também fornecemos procedimentos passo-a-passo para ensaio subsequente in vivo resposta imune inata pulmonar do rato, em particular, métodos de quantificação de apuramento bacteriana e resposta imune celular das vias aéreas infectado. Esta abordagem integrada e simples para avaliação da pneumonia permite a avaliação rápida e robusta do efeito de manipulações genéticas e ambientais sobre a imunidade inata pulmonar.

Introdução

Pneumonia adquirida na comunidade continua a ser a principal causa de morte por infecção em os EUA, com pouca mudança global nas taxas de mortalidade nos últimos 40 anos, apesar de melhorias na vacinação e estratégias de antibióticos ^1,2. Apesar da falta de progresso perceptível ao nível da saúde pública, nos últimos anos avanços dramáticos foram feitos em nosso entendimento da patogênese molecular e celular de pneumonia, com muitos desses passos em frente possibilitadas pelo uso de modelos de ratos com infecção pulmonar. A rastreabilidade genética do rato, a semelhança do murino e sistema imunológico humano, e a vasta gama de reagentes imunológicos alvo de murino que se tornaram disponíveis comercialmente, em conjunto, facilitou o progresso rápido do campo.

mouse modelos de pneumonia bacteriana descrita na literatura em geral invocada uma das quatro rotas técnicas de inoculação: i) aerosolization; ii) intrentrega anasal; iii) a entrega por via oral; e iv) a injecção intratraqueal cirúrgica (ou seja, traqueotomia) ^3. Todas as vias de infecção têm vantagens e desvantagens ^3. Em particular, a exposição, relativa das vias aéreas superiores, o potencial para a mistura da flora oronasal requisitos para anestesia geral, a variabilidade do inoculo entregue ao pulmão distai, distribuição lobar dos agentes patogénicos entregues, os requisitos de peritagem técnica, e morbidade processual variam amplamente entre estes abordagens.

Comumente técnicas de infecção por via oral usados incluem endotraqueal (translaríngea) canulação, quer através de uma abordagem "cega" (não visualizado), ou sob visualização direto da laringe ^3-5. Ambos os métodos, ao mesmo tempo robusta, requer treinamento substancial e também carregam risco de trauma na via aérea superior. No presente relatório, nós descrevemos um método tecnicamente não-intensivo, não-invasivo, barato e rápido da infecção por via oral, wdeclara bactérias Klebsiella pneumoniae (no exemplo apresentado) pipetada para a orofaringe de um rato anestesiado são entregues para os pulmões por meio de aspiração (isto é, por inalação). Nós e outros autores utilizaram a técnica de pneumonia aspirativa com êxito ^6-9. Este método de pulmão de entrega versátil e facilmente aprendido pode ser estendido para a entrega de muitos agentes não cáustico adicionais para os pulmões, incluindo citoquinas e outras proteínas, moléculas associadas a agentes patogénicos (por exemplo, lipopolissacarídeo), células (isto é, a transferência adoptiva), e toxinas (por exemplo, bleomicina). Além de discutir as considerações técnicas importantes, nós também descrevem uma abordagem integrada, quantitativa para avaliar a resposta do hospedeiro após a pneumonia, incluindo a medição a jusante da depuração bacteriana (ou seja, unidades formadoras de colônia [UFC] quantificação nos órgãos do pulmão e periféricos) e leucócitos acumulação no espaço aéreo.

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Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Animal Welfare Act e da Política de Serviços de Saúde Pública dos EUA na Humane Cuidado e Uso de Animais de Laboratório após revisão pelo Animal Care e Use Committee do NIEHS.

1. Preparação de K. Cultura pneumoniae

Cuidado: Executar todas as etapas de um 2 (BSL2) capô nível de segurança biológica ou outro BSL2 área designada e descartar resíduos por diretrizes BSL2 instituto.

1. Para uma suspensão de crescimento de K. pneumoniae, descongelar um stock de glicerol de bactérias e inocular uma cultura de trabalho, transferindo 1 ml de K. pneumoniae estoque para 50 ml de caldo de soja tríptica (TSB) em um balão de 500 ml ou maior.
2. Faça stocks de glicerol pela adição de 900 ul de fase log cultivadas K. pneumoniae de 100 ul de glicerol estéril e congelação a -20 ° C ou -80 ° C. Para armazenamento a longo prazo, a -80 ° C é recomendável.
3. cultura de bactérias de step 1,1 balão por agitação durante a noite (14-18 horas) a 37 ° C a 200-225 rpm.In fim de promover o crescimento de fase logarítmica, diluída 1-5 ml desta cultura durante a noite para um frasco contendo 50 ml de TSB e na manhã lugar de volta a 37 ° C com agitação durante ~ 2,5 horas.
4. Transferir 1 ml de K. cultura pneumoniae a partir do último passo para um tubo de 1,5 mL e centrifugação a 7500 xg durante 2 min. A pelota branca deve ser visível. Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento, suavemente ressuspender as bactérias com pipeta em 1 ml de soro fisiológico estéril, e roda de novo em 7500 xg durante 2 min.
   1. Executar este passo de lavagem 2x, elevando-se o sedimento final, lavadas em 1 ml de solução salina estéril.
5. Realizar diluições em série log-wise desta inóculo arrumado. Por exemplo, adicionar 400 uL do inoculo em 3,6 ml de solução salina estéril em série para fazer uma série de 10 ^-1 -10 ^-9 diluição.
6. Determinar a OD ₆₀₀ de K. lavada pneumoniae, colocando 1 ml de1:10 e 1: 100 diluições em cuvetes descartáveis e medindo a OD _600, limpando primeiro com solução salina estéril. Meça duplicados para garantir a precisão. Um OD ₆₀₀ de 1,0 é equivalente a 4-7 x 10 ⁸ UFC / ml. Note-se que a relação entre a OD e CFU / ml não podem ser lineares.
   1. Utilizar a DO ₆₀₀ das diluições para calcular a concentração de K. pneumoniae, aplicando-se a OD: conversão CFU / mL acima, e Levando em conta a diluição.
7. Use a K. concentração pneumoniae para preparar a dose de inoculo CFU desejado num
8. Plate, também 100 ul de 10 -10 ^{-9 -6} diluições e 100 ul de solução salina estéril em placas individuais de ágar de soja tríptico (TSA) à TA. Incubar a 37 ° C durante a noite e enumerar as colónias bacterianas, a fim de calcular a concentração exacta de que foi usada na experiência e para controlar a contaminação.
   NOTA: concentração bacteriana real de inóculo final pode ser ± 500 UFC / ml que o previsto pela absorção. Experimentadores devem, idealmente, confirmar a OD _600: UFC / ml relação em estudos-piloto antes do uso in vivo em ratinhos, empiricamente reajustar a OD _600: UFC / ml de conversão com base na sua experiência pessoal.

2. Murino intratraqueal (IT) Aspiração de K. pneumoniae da orofaringe

1. Certifique-se de que os ratos são identificados exclusivamente pela marca de cauda, ​​tatuagem, ou outro identificador aprovado.
2. Elaborar dosagem de inóculo de bactérias usando pipeta P200 antes de remover os ratos de isoflurano a fim de acelerar procedimento. Para obter os melhores resultados com ele aspiração, utilizar um volume de <100 ul para evitar transbordamento. Nisto, usar 2000 CFU / 50 ul de K. pneumoniae.
3. Anestesiar ratos numa câmara clara com gás isoflurano (por exemplo, 2% de isoflurano a um caudal de 1 L / min) ou como por Institorientações utional. O número de ratos para anestesiar conjunto é determinado pelo nível de conforto do experimentador, tipicamente 1-2 de cada vez. Observe a respiração e confirme nível de anestesia, uma vez respirações profundas são visíveis e 2-3 seg pode ser contado entre as respirações.
   NOTA: Se não houver preocupação com possíveis efeitos de confusão de anestésicos voláteis (inalados), a anestesia pode ser alcançado vez com injeção intraperitoneal de cetamina / xilazina. Com o método descrito acima, anestesia profunda, dura apenas alguns minutos. Se a anestesia é induzida mais prolongada, unguento para os olhos deve ser utilizado para prevenir a dessecação ocular.
4. Uma vez que o mouse é anestesiado, posicioná-lo em uma posição supina semirecumbent, suspenso pelos incisivos superiores de um elástico esticado entre pinos em uma placa de Plexiglas inclinado (Figura 1).
5. Com cuidado, puxe a língua mouse para o lado com um par de fórceps não sulcadas sem corte e dosagem de depósito na cavidade oral com uma pipeta P200e. Exercer grande cuidado para evitar induzir trauma, quer da língua ou da orofaringe.
6. Mantendo a língua retraída, gentilmente ocluir o nariz com um dedo de luva até que o mouse inala. Continue-se a cobrir o nariz até o rato tenha tomado duas ou mais inalações, e o líquido não é visível na cavidade oral. Cobrindo o nariz ajuda a garantir que o mouse vai inalar as bactérias nos pulmões, como os ratos são respiradores nasais obrigatórios.
7. Remover o rato da placa de inoculação e voltar para sua gaiola, colocando o mouse sobre as suas costas para evitar a cama ou detritos de bloquear as narinas, enquanto o rato está a recuperar da anestesia.
8. Uma vez que todos os ratos foram dosados e acordaram da anestesia, Casa de ratos em um cubículo / sala contendo apenas os ratos que foram doseados com K. pneumoniae. Monitorar os ratos diariamente, incluindo pesos corporais se ir além de 48 horas após a infecção.
9. Use puré diária e / ou calor suplementar, se permitindo que os ratos ir além de 48h.

3. Lavagem Broncoalveolar Fluid (LBA) Recolha e Análise

1. Euthanize camundongos acordo com as diretrizes institucionais. Aqui, utilizar uma injecção letal de 150 mg / Kg de pentobarbital de sódio ou dose equivalente de solução comercial a eutanásia por exsanguinação seguida, como este evita complicações possíveis para os pulmões associadas com inalação de _CO2 e deslocamento cervical.
2. rato posição nas costas e esterilizar rato por pulverização de pele com 70% de etanol em particular sobre a área do peito e pescoço.
3. Faça um corte longitudinal logo abaixo do esterno, em seguida, segurando o esterno com uma pinça, entalhe do diafragma, permitindo que o pulmão a cair de volta para a cavidade torácica. Corta-se através da cavidade torácica em ambos os lados da vasculatura e, em seguida, para cima através do pescoço, expondo a traqueia.
4. À medida que a traqueia é rodeada pelos músculos longitudinais em ambos os lados, cuidadosamente cortados pelo meio e empurrar o tecido para os lados, conformeisto evita o corte da vasculatura circundante, a qual pode introduzir sangue na traqueia. Se a vasculatura é cortado, limpe a área circundante com gaze antes de acessar a luz traqueal.
5. Use tesouras cirúrgicas ou para uma agulha de nick da traqueia cerca de ¼ do caminho para baixo a partir da cabeça e inserir uma cânula ligada a uma seringa de 1 ml de pré-carregado com 1 ml de solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) caudalmente para a traqueia. Se utilizando murganhos <8 semanas de idade ou fêmeas, reduzir o volume lavaging de 600-800 ul.
6. Empurre o volume para o pulmão lentamente, permitindo que todos os lobos para inflar e puxe o volume de volta para fora com a seringa, repetindo 3x. Se PBS está saindo das narinas a cânula não foi empurrada para dentro da traqueia ou a inflação está ocorrendo muito rapidamente. Em alternativa, se os pulmões não são bem inflar, a cânula foi empurrado demasiado para dentro, de modo retirar ligeiramente.
7. Recolha lavagens reunidas em um tubo de 15 ml em gelo.
8. Giraro espaço aéreo de fluido de lavagem a 1.200 xg durante 5 minutos, recolher o sobrenadante para um tubo de 1,5 mL e congelar a -80 ° C. Subsequentemente, utilizar-se o sobrenadante (isto é, BALF) para a medição de proteínas, citoquinas, e para vários outros ensaios bioquímicos. O sedimento de células representa o espaço de broncoalveolar.
9. Se as células vermelhas do sangue (RBCs) são evidentes na pelete de células com base na cor, lise com 1 ml de tampão de lise ACK durante 1 min, seguido por adição de 5 ml de 1x PBS para parar a reacção e diluir a lise tampão. Manusear todas as amostras de forma idêntica, seja tratada ou não com tampão de lise ACK.
10. células giram a 1200 xg durante 5 minutos, decanta-se o sobrenadante, e trazem-se as células em 1 ml de PBS 1x.
11. células Vortex e contar com um hemocitômetro para contagem de células totais do espaço aéreo.
12. Com base na densidade de células adicionar cerca de 80-150 ul (~ 80 mL de um rato infectado e ~ 150 para um rato ingênuo) para uma câmara de slides em uma centrífuga Cytospin. célula de trefilagems em lâminas de microscópio para a coloração subsequente para determinar as populações de células diferenciais.
13. Permitir que as células secar durante a noite em lâminas. Células mancha com tri-mancha (por exemplo, Hema 3 [ver tabela]) mergulhando as lâminas 7 vezes em fixador, 9 vezes em mancha de 1 e 7 vezes em mancha 2 (sem lavagens entre manchas), e deixe secar. Após mancha secou, ​​lâminas lamela e manualmente contar diferenciais por microscópio. Geralmente, neutrófilos e monócitos / macrófagos são facilmente distinguidos pelo seu tamanho e morfologia nuclear.

4. Determinar a carga bacteriana no pulmão e nos tecidos periféricos

1. Antes de começar: preparar tubos de diluição com 900 mL de 1x PBS para pulmão e baço e 90 ul de 1x PBS para sangue. placas de etiqueta para a cultura de bactérias e definir a temperatura ambiente; Portanto, o tempo uma vez que o tecido tenha sido recolhida vai ser minimizado entre homogeneização e plaqueamento para crescimento bacteriano.
   Nota: Devido à deposi heterogêneoção de bactérias nos pulmões que podem ocorrer com aspiração, recomenda-se que os ratos individuais ser utilizado para análise de qualquer celularidade total das vias respiratórias ou de carga total (bilateral) pulmonar bacteriana.
2. Euthanize o mouse como por passo 3.1 e recolher posteriormente sangue do ventrículo esquerdo, colocando em um tubo heparinizado para evitar a coagulação. Remove todos os lobos pulmonares e lugar em um tubo de 15 ml contendo 5 ml de PBS 1x, seguido por remoção do baço e colocação em 2 ml de PBS 1x. Coloque os tubos em gelo. Tome cuidado para limpar instrumentos com etanol entre cada tecido / mouse.
3. Homogeneizar o tecido em gelo, de preferência com homogeneizadores descartáveis ​​que podem ser alterados entre cada amostra. dicas homogeneizador descartáveis ​​podem ser autoclavados para reutilização entre os experimentos.
4. Uma vez que o tecido foi homogeneizado, realizar diluições em série e placa. Amostras de placa de um tecido dada / diluição em duplicado em uma única placa de TSA por traçar uma linha divisória no plástico. Chapeamento e dilução sugestões são mostrados abaixo (em todos os casos, 10 ul de amostra é espalhada sobre placa) e baseiam-se numa 24 h pós-infecção necropsia. Se analisando amostras 48-72 hr, um maior número de diluições podem precisar de ser banhado devido ao aumento da carga bacteriana em pontos de tempo posteriores.
   1. Para Sangue - diluir 1:10 por adição de 10 ul de sangue em 90 ul de PBS estéril 1x. Placa limpo e 1:10 amostras diluídas em duplicado. Uma vez que o sangue foi banhado, girar o sangue residual a 9300 xg durante 10 minutos para extrair o plasma para a medição de citoquinas e quimioquinas.
   2. Para Pulmão - diluir 1:10 - 1: 100 por adição de 100 ul de homogeneizado de pulmão em 900 ul de PBS estéril 1x em série. Placa puro homogeneizado e todas as diluições em duplicado.
   3. Para Baço - dilua 1: 10-1: 100 por adição de 100 ul de baço homogeneizado em 900 pi de PBS estéril 1x em série. Placa puro homogeneizado e ambas as diluições em duplicado.
5. Deixar as amostras de propagação para secar brevemente.
6. Inverta placas de TSA e coloque em uma estática de 37 ° C incubadora durante a noite.
7. Determinar o número de bactérias que colonizam a média das colónias de bactérias a partir de ambos os lados da placa e a partir de cada diluição. Fator nas diluições iniciais de 5 ml de pulmão e 2 ml de baço para determinar UFC tecido totais.

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Resultados

Ratinhos C57BL / 6 foram infectados com 2,000 CFU de K. pneumoniae 43816 (serótipo 2) por meio de aspiração da orofaringe para dentro dos pulmões. Nesta dose, os ratos normalmente começam a mostrar sintomas clínicos 12-24 h pós-infecção, incluindo letargia, pele enrugadas, e perda de peso de 5-10% (Figura 2A). Dentro de 48-72 horas após a infecção, muitos dos murganhos apresentam sintomas de doença e de morbilidade que é tipicamente precedido por u...

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Discussão

Modelos murinos de pneumonia bacteriana, em parceria com o gene alvo e nas intervenções biológicas e farmacológicas in vivo, têm fornecido insights críticos sobre a resposta de defesa do hospedeiro pulmonar. Grandes avanços foram feitos, em particular, no nosso entendimento das quimiocinas e moléculas de adesão que regulam o recrutamento de neutrófilos para o espaço aéreo infectada ^10,11. Modelos in vivo de pneumonia, ao contrário de abordagens baseadas em células ou a...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Klebsiella pneumoniae, serotype 2	ATCC	43816
Tryptic soy broth	Becton Dickenson	211825
Excel Safelet IV Catheters, 18 G x 1 1/4"	Claflin Medical Equipment	MEDC-031122
Hema 3 Solution 1	Fisher	23-122-937
Hema 3 Solution 2	Fisher	23-122-952
Hema 3 Fixative	Fisher	23-122-929
27½ gauge tuberculin syringes	Fisher	14-826-87
Lithium heparin plasma collectors	Fisher	2675187
L-shaped disposable spreaders	Lab Scientific	DSC
1x PBS, pH 7.4	prepared in-house	n/a	Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g)
ACK lysis buffer	prepared in-house	n/a	NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4