חיישן מבוסס-Polyaniline של חומצות גרעין

Summary

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

Abstract

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Introduction

Conjugated polymers provide many options for molecular sensors. This includes fluorescence, electronic, and colorimetric responses¹. There have been many efforts to incorporate conjugated polymers in nucleic acid sensors. However, most systems require secondary detection, limiting sensing options². Recently, we reported a conjugated polymer-based sensor platform built on polyaniline (PANI) that exploits properties of this polymer, creating a label-free system³. PANI is an extensively conjugated electro-active polymer with properties such as fluorescence and resistance that are suitable for measuring biological systems⁴. The excitons within the structure are not localized leading to mobility of the positive charge between monomeric subunits. This provides a flexible scaffold of positive charges that can interact with the negatively charged backbone of DNA^5,6. Importantly, electrostatically attached DNA is orientated such that nitrogenous bases can participate in base pairing. Association with DNA alters the electronic properties of PANI, an effect that can be enhanced by UV irradiation (Figure 1)³. Using this system, oligonucleotides complementary to target nucleic acids can be immobilized on PANI. Multiple studies have demonstrated that upon hybridization electrostatically adsorbed oligonucleotides dissociate from PANI or other cationic matrices due to conformational changes caused by the switch to a double-stranded DNA structure^3,5,7.

In a sensor system where probe attachment modulates conjugated polymer properties, hybridization events can be transduced without labels or enzymatic modification of probes or target nucleic acids. Conjugated polymers offer great flexibility in detection methods, one of which is fluorescence. Through monitoring PANI fluorescence, concentrations of target nucleic acids as low as 10^-11 M (10 pM) can be detected³. Detection is rapid, occurring within 15 minutes of hybridization, and specific where a single mismatch in a target molecule can be differentiated³.

Fabrication of PANI-sensors is straightforward. High molecular weight PANI can be generated that is well-dispersed in water using standard synthesis procedures involving aniline monomer, surfactant, and controlled addition of an oxidant. Yield can be very high and unreacted oxidant removed by washing with water, ensuring no further PANI growth. PANI-probe association occurs spontaneously upon mixture, and complex formation is enhanced by mild UV exposure. Hybridization can be carried out immediately, and the changes in PANI fluorescence assayed following a short incubation. The simplicity of this technology makes it highly accessible to many laboratories.

Protocol

סינתזה 1. processable פאני

1. ממיסים אנילין (1 מ"ל, 11 מילימול) לחלוטין ב -60 מ"ל של כלורופורם בתוך 250 מ"ל בבקבוק מסביב לתחתית. מערבבים בסל"ד 600 במשך 5 דקות ומצננים עד 0-5 מעלות צלזיוס עם קרח. זה בדרך כלל לוקח 15-20 דקות (איור 2 א).
2. להוסיף sulphonate בנזן dodecyl נתרן (NaDBS) (7.44 גר ', 21 מילימול) לפתרון אנילין בבקבוק עגול תחתית תוך ערבוב ב 600 סל"ד.
3. ממסי אמוניום persulphate (APS) (3.072 גרם, 13.5 mmol) ב 20 מ"ל מים ולהוסיף את כל זה טיפה חכמה יותר מ -30 דקות כדי למנוע התחממות יתר התגובה.
4. לבצע את התגובה על C 0-5 מעלות למשך 24 שעות, ולאפשר לו להגיע לטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.
5. שים את תערובת התגובה בתחילה להלבין חלבי לאחר 15 דקות, ולאחר מכן חום כהה לאחר 2 שעות, ולבסוף לירוק כהה לאחר 24 שעות (איור 2 ב-F).
6. סנן הפתרון פאני-NaDBS עם משפך בוכנר. מערבבים עם כלורופורם 80 מ"ל ו -120 מ"ל מים כמומשפך eparation (איור 2G).
7. דגירת הפתרון למשך 24 שעות בטמפרטורת חדר לאסוף את פאני הירוק כהה מן ארובת ההפרדה, עוזב NaDBS ו APS unreacted ב supernatant המימי.

ערבוב פאני-חללית 2. ו- UV הקרנה

1. לדלל פתרון פאני 10x עם כלורופורם-מים (1: 3 v / v) ומערבבים 200 μl של פאני מדולל 6.4 μmol של oligonucleotides DNA בדיקה על ידי נדנדה עדין במשך 15 דקות בתוך שפופרת microfuge.
2. מקרינים הפתרון פאני-DNA עם 1,200 μJ / ² ס"מ של UV בתוך crosslinker 2 דקות. זה קריטי, כי החשיפה ל- UV מוגבלת לסכום המצוין. חשיפה רבה UV פוגעת שינוי קרינת פאני, כנראה עקב פאני cross-linking של קוולנטיים ו- DNA.
3. מתחמי גלולה ידי צנטריפוגה ב 17,000 XG במשך 6 דקות, ולשטוף עם בופר פוספט (PBS). גלול שוב, מחדש להשעות ב PBS.

3. Hybridization של חללית פאני

1. הוסף 8 μl של 100 מיקרומטר oligonucleotides DNA משלימים או למקד חומצות גרעין 200 μl של מתחמי פאני-בדיקה.
2. בצע הכלאה ידי נדנדת תערובת פתרון במשך 15 דקות ב 40 מעלות צלזיוס.
3. גלולה מתחמי פאני על ידי צנטריפוגה ב 17,000 XG במשך 6 דקות. לשטוף עם PBS מחדש להשעות במים.

4. פליטה יציבה מדידת קרינת המדינה

1. להוסיף פאני מטיפולים שונים לתוך microplate 96 באר ולמדוד קרינת פליטה בטווח 270-850 ננומטר ידי עירור ב 250 ננומטר. שיא פליטה עבור פאני יש לשים לב סביב 500 ננומטר.

5. מדידה מיקרוסקופ פלואורסצנטי של הכלאה דופלקס

1. זרוק מעיל פאני על coverslip בורוסיליקט זכוכית ויבש ב 40 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
2. להוסיף בדיקה (8 μl של 100 מיקרומטר) על סרט פאני יבשים מכשיר אותו עם האור האולטרה סגול (1,200 μJ / ² ס"מ ) למשך 2 דקות.
3. שטפו את הסרט פאני-בדיקה עם PBS ויבש ב 40 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
4. בצע הכלאה במשך 15 דקות על ידי הוספת חומצות גרעין יעד. זה יכול להיות דגימה ביולוגית או oligonucleotide ליעד האיזון (8 μl של 100 מיקרומטר). עקוב עם לשטוף PBS.
5. להשיג את התמונות פלורסנט בהגדלה 40X, עם מסנן מסירה ארוכה 500 ננומטר.

תוצאות

איור 2 א לוכדת את התקנת התגובה בתחילת תהליך פילמור, כלומר, לפני כן APS. היווצרות micelle הוא השלב הראשוני התגובה תהליך-פאני סינתזה המתרחשת בבית הממשק micellar. איור 2B מראה פתרון חלבי לאחר 5 דקות. 30 דקות לאחר APS מתווסף התגובה פונה בצבע ח...

Discussion

חיישן מבוסס פאני של חומצות גרעין דורש solubilization של הפולימר במים כדי אינטראקציה עם DNA ו- RNA. פיזור פאני במים מושג באמצעות פעילי שטח, ויצר מיצלות כפי שדווח בעבר ^8. בנוסף NaDBS משמש כאן פעילי שטח anionic אחרים כמו אסתר dodecyl של חומצה 4-sulfophthalic, פעילי שטח nonionic כמו ethoxylate פנול nonyl, א?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aniline	Fisher Scientific	A7401-500	ACS, liquid, refrigerated
Ammonium peroxydisulfate	Fisher Scientific	A682-500	ACS, crystalline
Sodium dodecylbenzene sulfonate	Pfaltz & Bauer	D56340	95% solid
Chloroform	Fisher Scientific	MCX 10601	Liquid
DNA primers	MWG operon	n/a	custom DNA sequence ~20 bps
Microplate	USA Scientific	1402-9800	96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform
Microplate Adhesive Film	USA Scientific	2920-0000	Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-544-D	PANI coated on UV irradiated cover glass
UV crosslinker	UVP	HL-2000	Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min
Hybridization Oven	VWR	01014705 T	Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min
Glass Apparatus	Fisher Scientific		Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel
Microscope	Leica Microsystems	Leica IMC S80	Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6
Microplate Reader	Molecular Devices	89429-536