Полианилиновой на основе датчика нуклеиновых кислот

Резюме

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

Аннотация

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Введение

Conjugated polymers provide many options for molecular sensors. This includes fluorescence, electronic, and colorimetric responses¹. There have been many efforts to incorporate conjugated polymers in nucleic acid sensors. However, most systems require secondary detection, limiting sensing options². Recently, we reported a conjugated polymer-based sensor platform built on polyaniline (PANI) that exploits properties of this polymer, creating a label-free system³. PANI is an extensively conjugated electro-active polymer with properties such as fluorescence and resistance that are suitable for measuring biological systems⁴. The excitons within the structure are not localized leading to mobility of the positive charge between monomeric subunits. This provides a flexible scaffold of positive charges that can interact with the negatively charged backbone of DNA^5,6. Importantly, electrostatically attached DNA is orientated such that nitrogenous bases can participate in base pairing. Association with DNA alters the electronic properties of PANI, an effect that can be enhanced by UV irradiation (Figure 1)³. Using this system, oligonucleotides complementary to target nucleic acids can be immobilized on PANI. Multiple studies have demonstrated that upon hybridization electrostatically adsorbed oligonucleotides dissociate from PANI or other cationic matrices due to conformational changes caused by the switch to a double-stranded DNA structure^3,5,7.

In a sensor system where probe attachment modulates conjugated polymer properties, hybridization events can be transduced without labels or enzymatic modification of probes or target nucleic acids. Conjugated polymers offer great flexibility in detection methods, one of which is fluorescence. Through monitoring PANI fluorescence, concentrations of target nucleic acids as low as 10^-11 M (10 pM) can be detected³. Detection is rapid, occurring within 15 minutes of hybridization, and specific where a single mismatch in a target molecule can be differentiated³.

Fabrication of PANI-sensors is straightforward. High molecular weight PANI can be generated that is well-dispersed in water using standard synthesis procedures involving aniline monomer, surfactant, and controlled addition of an oxidant. Yield can be very high and unreacted oxidant removed by washing with water, ensuring no further PANI growth. PANI-probe association occurs spontaneously upon mixture, and complex formation is enhanced by mild UV exposure. Hybridization can be carried out immediately, and the changes in PANI fluorescence assayed following a short incubation. The simplicity of this technology makes it highly accessible to many laboratories.

протокол

1. Обрабатываемая ПАНИ Синтез

1. Растворите анилин (1 мл, 11 ммоль), полностью в 60 мл хлороформа в 250 мл круглодонную колбу,. Смесь перемешивают при 600 оборотах в минуту в течение 5 мин и охлаждают до температуры 0-5 ° С со льдом. Это обычно занимает 15-20 мин (рис 2A).
2. Добавить додецил бензолсульфонат натрия (NaDBS) (7,44 г, 21 ммоль) к раствору анилина в круглодонную колбу при перемешивании при 600 оборотах в минуту.
3. Растворите персульфата аммония (APS) (3,072 г, 13,5 ммоль) в 20 мл воды и добавить все это по каплям в течение 30 минут, чтобы избежать перегрева реакции.
4. Проводят реакцию при температуре 0-5 ° С в течение 24 ч, и позволяют ему достичь комнатной температуры в течение еще 24 ч.
5. Отметим , реакционную смесь сначала повернуть молокообразного через 15 мин, а затем темно - коричневого цвета после 2 часов, и , наконец , до темно - зеленого через 24 часа (рис 2B-F).
6. Фильтр решение ПАНИ-NaDBS с воронке Бюхнера. Смешайте 80 мл хлороформа и 120 мл воды в качествеeparation воронка (рис 2G).
7. Выдержите раствор в течение 24 ч при комнатной температуре и собирают темно-зеленую полианилина делительной воронке, в результате чего не вступившие в реакцию NaDBS и APS в водной супернатанта.

2. ПАНИ-зонд Смешение и УФ-облучения

1. Развести нилина раствор 10х смесью хлороформ-вода (1: 3 об / об) и перемешивают 200 мкл разведенной полиани- 6,4 мкмоль олигонуклеотиды ДНК-зонд, путем осторожного качания в течение 15 мин в микроцентрифуге трубки.
2. Облучать раствор ПАНИ-ДНК с 1200 мкДж / см ² УФ в сшивателя в течение 2 мин. Очень важно, что УФ-облучение ограничивается указанным количеством. Длительное воздействие УФ компрометирует изменения флуоресценции в PANI, вероятно из-за ковалентной сшивки полианилина и ДНК.
3. Гранул комплексы центрифугированием при 17000 х г в течение 6 мин и промывают фосфатным буферным солевым раствором (PBS). Гранул снова, и повторно приостанавливать в PBS.

3. Hybridization ПАНИ-зонда

1. Добавить 8 мкл 100 мкМ олигонуклеотидов, комплементарных ДНК или нуклеиновых кислот-мишеней к 200 мкл полианили--зондовых комплексов.
2. Выполните гибридизацию покачиванием смесь раствора в течение 15 мин при температуре 40 ° С.
3. Гранул ПАНИ комплексы путем центрифугирования при 17000 мкг в течение 6 мин. Мытье с PBS и повторно приостанавливать в воде.

4. Излучение Устойчивая Измерение флуоресцентного состояния

1. Добавить Пани из разных процедур в микропланшет 96 скважины и измерения флуоресценции излучения в диапазоне 270-850 нм при возбуждении при 250 нм. Пик излучения для ПАНИ должны наблюдаться около 500 нм.

5. флуоресцентной микроскопией Измерение гибридизовали Duplex

1. Капельный слой полианилина на боросиликатное стекло покровное и высушивают при 40 ° C в течение 48 часов.
2. Добавить зонд (8 мкл 100 мкМ) в сухом PANI пленке и облучать его с УФ - светом (1200 мкДж / см ² ) в течение 2 мин.
3. Промыть ПАНИ-Probe пленку с PBS и сушат при 40 ° C в течение 48 часов.
4. Выполните гибридизацию в течение 15 мин путем добавления нуклеиновых кислот-мишеней. Это может быть биологический образец или мишень управления олигонуклеотид (8 мкл 100 мкМ). Следуйте с промывкой PBS.
5. Получить флуоресцентные изображения при 40-кратном увеличении, с фильтром длиной пропускания 500 нм.

Результаты

Фигура 2А захватывает установку реакции в начале процесса полимеризации, то есть до того APS. Образование мицелл является первым шагом в реакции синтеза происходит процесс-ПАНИ в мицеллярной интерфейсе. Рисунок 2B показывает молочного цвета раст?...

Обсуждение

Датчик нуклеиновых кислот на основе полианилина требует солюбилизации полимера в воде, с тем, чтобы взаимодействовать с ДНК и РНК. Дисперсия полианилина в воде осуществляется с использованием поверхностно -активных веществ, образующих мицеллы , как сообщалось ранее ^8. В дополнен?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aniline	Fisher Scientific	A7401-500	ACS, liquid, refrigerated
Ammonium peroxydisulfate	Fisher Scientific	A682-500	ACS, crystalline
Sodium dodecylbenzene sulfonate	Pfaltz & Bauer	D56340	95% solid
Chloroform	Fisher Scientific	MCX 10601	Liquid
DNA primers	MWG operon	n/a	custom DNA sequence ~20 bps
Microplate	USA Scientific	1402-9800	96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform
Microplate Adhesive Film	USA Scientific	2920-0000	Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-544-D	PANI coated on UV irradiated cover glass
UV crosslinker	UVP	HL-2000	Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min
Hybridization Oven	VWR	01014705 T	Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min
Glass Apparatus	Fisher Scientific		Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel
Microscope	Leica Microsystems	Leica IMC S80	Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6
Microplate Reader	Molecular Devices	89429-536