Un sensore polianilina a base di acidi nucleici

Riepilogo

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

Abstract

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Introduzione

Conjugated polymers provide many options for molecular sensors. This includes fluorescence, electronic, and colorimetric responses¹. There have been many efforts to incorporate conjugated polymers in nucleic acid sensors. However, most systems require secondary detection, limiting sensing options². Recently, we reported a conjugated polymer-based sensor platform built on polyaniline (PANI) that exploits properties of this polymer, creating a label-free system³. PANI is an extensively conjugated electro-active polymer with properties such as fluorescence and resistance that are suitable for measuring biological systems⁴. The excitons within the structure are not localized leading to mobility of the positive charge between monomeric subunits. This provides a flexible scaffold of positive charges that can interact with the negatively charged backbone of DNA^5,6. Importantly, electrostatically attached DNA is orientated such that nitrogenous bases can participate in base pairing. Association with DNA alters the electronic properties of PANI, an effect that can be enhanced by UV irradiation (Figure 1)³. Using this system, oligonucleotides complementary to target nucleic acids can be immobilized on PANI. Multiple studies have demonstrated that upon hybridization electrostatically adsorbed oligonucleotides dissociate from PANI or other cationic matrices due to conformational changes caused by the switch to a double-stranded DNA structure^3,5,7.

In a sensor system where probe attachment modulates conjugated polymer properties, hybridization events can be transduced without labels or enzymatic modification of probes or target nucleic acids. Conjugated polymers offer great flexibility in detection methods, one of which is fluorescence. Through monitoring PANI fluorescence, concentrations of target nucleic acids as low as 10^-11 M (10 pM) can be detected³. Detection is rapid, occurring within 15 minutes of hybridization, and specific where a single mismatch in a target molecule can be differentiated³.

Fabrication of PANI-sensors is straightforward. High molecular weight PANI can be generated that is well-dispersed in water using standard synthesis procedures involving aniline monomer, surfactant, and controlled addition of an oxidant. Yield can be very high and unreacted oxidant removed by washing with water, ensuring no further PANI growth. PANI-probe association occurs spontaneously upon mixture, and complex formation is enhanced by mild UV exposure. Hybridization can be carried out immediately, and the changes in PANI fluorescence assayed following a short incubation. The simplicity of this technology makes it highly accessible to many laboratories.

Protocollo

1. Processabile PANI Sintesi

1. Sciogliere anilina (1 ml, 11 mmol) completamente in 60 ml di cloroformio in 250 ml pallone a fondo rotondo. Mescolare a 600 rpm per 5 minuti e raffreddare a 0-5 ° C con ghiaccio. Questo richiede di solito 15-20 minuti (Figura 2A).
2. Aggiungere sodio dodecil benzene solfonato (NaDBS) (7,44 g, 21 mmoli) alla soluzione di anilina in un pallone a fondo rotondo sotto agitazione a 600 rpm.
3. Sciogliere ammonio persolfato (APS) (3.072 g, 13,5 mmol) in 20 ml di acqua e aggiungere tutto questo goccia a goccia nel corso di 30 minuti per evitare il surriscaldamento della reazione.
4. Effettuare la reazione a 0-5 ° C per 24 ore, e lasciare che raggiunga la temperatura ambiente per un altro 24 ore.
5. Osservare la miscela di reazione inizialmente girare bianco latte dopo 15 min, marrone scuro poi, dopo 2 ore, e, infine, al verde scuro dopo 24 ore (Figura 2B-F).
6. Filtrare la soluzione PANI-NaDBS con un imbuto di Buchner. Mescolare con 80 ml di cloroformio e 120 ml di acqua comeeparation imbuto (Figura 2G).
7. Incubare la soluzione per 24 ore a temperatura ambiente e raccogliere il PANI verde scuro dalla imbuto separatore, lasciando NaDBS reagiti e APS nel surnatante acquoso.

2. miscelazione PANI-sonda e irradiazione UV

1. Diluire soluzione PANI 10x con cloroformio-acqua (1: 3 v / v) e miscelare 200 ml di PANI diluito con 6,4 micromol di sonde oligonucleotidi di DNA mediante dolce dondolio per 15 minuti in una provetta per microcentrifuga.
2. Irradiare la soluzione PANI-DNA con 1.200 μJ / cm ² di UV in un reticolante per 2 min. È fondamentale che l'esposizione UV è limitata all'importo indicato. L'esposizione prolungata ai raggi UV compromette la variazione di fluorescenza in PANI, probabilmente a causa di cross-linking covalente di Pani e il DNA.
3. complessi di pellet per centrifugazione a 17.000 xg per 6 minuti, e lavare con tampone fosfato (PBS). Pellet di nuovo, e risospendere in PBS.

3. Hybridization di PANI-probe

1. Aggiungere 8 ml di 100 micron oligonucleotidi di DNA complementare o indirizzare gli acidi nucleici per 200 ml di complessi PANI-sonda.
2. Eseguire ibridazione dondolo miscela soluzione per 15 min a 40 ° C.
3. Pellet i complessi PANI per centrifugazione a 17.000 xg per 6 min. Lavare con PBS e risospendere in acqua.

4. Emissione costante di misura Stato fluorescenza

1. Aggiungere PANI da diversi trattamenti in una micropiastra a 96 pozzetti e misurare la fluorescenza emissione nel campo 270-850 nm per eccitazione a 250 nm. Un picco di emissione per PANI deve osservare circa 500 nm.

5. microscopia a fluorescenza Misura della ibridato Duplex

1. Goccia cappotto PANI su un vetrino di vetro borosilicato e asciutto a 40 ° C per 48 ore.
2. Aggiungere sonda (8 ml di 100 mM) su un film PANI essiccato e irradiare con luce UV (1.200 μJ / cm ² ) per 2 min.
3. Lavare il film PANI-sonda con PBS e asciugare a 40 ° C per 48 ore.
4. Eseguire ibridazione per 15 minuti con l'aggiunta di acidi nucleici bersaglio. Questo potrebbe essere un campione biologico o un oligonucleotide destinazione di controllo (8 ml di 100 mM). Seguire con un lavaggio PBS.
5. Ottenere le immagini fluorescenti a 40X di ingrandimento, con un filtro passaggio lungo 500 nm.

Risultati

Figura 2A cattura la configurazione reazione all'inizio del processo di polimerizzazione, cioè prima APS aggiunta. Formazione di micelle è il primo passo nella reazione di sintesi avviene processo PANI all'interfaccia micellare. La Figura 2B mostra una soluzione lattescente dopo 5 min. 30 min dopo APS è aggiunta la reazione si rivolge ad un colore leggermente marrone. Figura 2C mostra il cambiamento di colore associat...

Discussione

Un sensore PANI basata su acidi nucleici richiede la solubilizzazione del polimero in acqua per interagire con il DNA e RNA. La dispersione di PANI in acqua è realizzato utilizzando tensioattivi, formando micelle come precedentemente riportato ^8. Oltre alle NaDBS qui utilizzati altri tensioattivi anionici come dodecil estere dell'acido 4-sulfophthalic, tensioattivi non ionici come nonilfenolo etossilato, o tensioattivi cationici come bromuro di ammonio cetyltrimethyl potrebbero anche essere utilizzati pe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aniline	Fisher Scientific	A7401-500	ACS, liquid, refrigerated
Ammonium peroxydisulfate	Fisher Scientific	A682-500	ACS, crystalline
Sodium dodecylbenzene sulfonate	Pfaltz & Bauer	D56340	95% solid
Chloroform	Fisher Scientific	MCX 10601	Liquid
DNA primers	MWG operon	n/a	custom DNA sequence ~20 bps
Microplate	USA Scientific	1402-9800	96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform
Microplate Adhesive Film	USA Scientific	2920-0000	Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-544-D	PANI coated on UV irradiated cover glass
UV crosslinker	UVP	HL-2000	Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min
Hybridization Oven	VWR	01014705 T	Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min
Glass Apparatus	Fisher Scientific		Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel
Microscope	Leica Microsystems	Leica IMC S80	Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6
Microplate Reader	Molecular Devices	89429-536