מדידת נכות נוירולוגית מתקדמת עכבר דגם של טרשת נפוצה

Summary

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

Abstract

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

Introduction

Murine Encephalomyelitis וירוס של Theiler (TMEV) הוא וירוס RNA חד-גדילי neurotropic כי מדביק את מערכת העצבים המרכזית murine בהתמדה (CNS). בעכברים רגישים, זיהום עם TMEV גורם מחלה demyelinating החיסונית בתיווך, כרונית-פרוגרסיבי, הידועה כמחלת demyelinating הנגרמת TMEV (TMEV-IDD). זיהום ניסיוני של עכברים לוקח מהלך מחלה דומה לזו שנצפתה בצורות מתקדמות של טרשת נפוצה (MS). TMEV-IDD מאופיין בשני שלבים: בשלב האקוטי בשלב הכרוני. בשלב החריף הוא ^1,2 דלקת מוח קל, בדרך כלל תת-קליני. השלב השני, כרונית, החל כחודש לאחר ההדבקה, מורכב נכות שהתקדמה לאטה מאופיין demyelination, דלקות, ^1,2 נזק axonal. החולשה שנצפתה בעכברים קשור עוויתות, מדי פעם, עוויתות טוניק חמורה.

מאחר שקיימים כרגע אין medications כדי לשפר הנכות מתקדמת בחולים, חוקרים נמשכים במיוחד על ידי TMEV-IDD, המייצג במודל חיה אופטימלית לניטור השפעת סמים שינוי מחלה על התקדמות המחלה. עם זאת, בעכברים כמו גם אצל חולי טרשת נפוצים, הפיקוח על התקדמות מוגבלת הצריך הסתכלות קלינית מתמשכת לאורך תקופות ממושכות של זמן. בעכברים, ניטור ארוך טווח התקדמות נכות יכול להיות מושלם עם מבחן ביצועים Rotarod.

מבחן ביצועי Rotarod הוא מבחן התנהגותי סטנדרטי מעריך פונקציות קשורות מנוע כגון קואורדינציה, שיווי משקל, עייף במכרסמים. העכברים יש לשמור על שיווי משקלם על מוט מחרטות, אשר מסתובב תחת אצה רציפה; חביון הזמן לרדת מ מוט זה נרשם. בעלי חיים עם חוסר תפקוד נוירולוגי אינם מסוגלים להישאר על מוט מסתובב כל עוד שולטת, והם בדרך כלל להשיל כאשר מהירות סיבוב עולה שלהםקיבולת מנוע. ירידת ערך הנוירולוגיות יותר החיות יש, כמה שיותר מהר הם נופלים שבקצה המוט ואת קצר חביון הזמן הוא.

היתרון של בדיקת Rotarod על מערכות בקיע החזותיות המסורתיות הוא שזה מייצר אובייקטיבי, מדיד משתנה הזמן חביון-אשר יכול בסופו של דבר לשמש עבור ניתוחים סטטיסטיים לכמת את ההשפעות של טיפולי פרוצדורות ^3.

במעבדה של Neuroimmunology (לוני) ב Dartmouth, עכברים כפופים פרוטוקול הסתגלות, שבו הם נבחנים לפני ההדבקה TMEV כדי לערוך להם היכרות עם המכונה ועל מנת להעריך את "הבסיס" ושליטה מוטורית תיאום האיזון הרגיל שלהם ^{4, 5.} לאחר הבסיס הוא הקים את עכברים נגועים עם TMEV, הם נבחנים פעם או פעמיים בשבוע במשך תקופה של מספר חודשים. פרוטוקול הבדיקה בפועל נמשך בממוצע 150 ימים, ובכך מאפשר הערכה שלהירידה של שיווי משקל, קואורדינציה, ושליטה מוטורית על כל מהלך מחל demyelinating.

כמה מאות TMEV-IDD ואת שטופלו דמה עכברים נבדקו עד כה עבור ליקוי נוירולוגי בדארטמות. עכברים אלו קיבלו טיפולים אימונו שונים, אבל לא תרופתי כבר נמצא יעיל בהפחתת התקדמות הנכות ^6,7. המאמר הנוכחי ואת הפרוטוקול הקשור מתארים כיצד לאפיין את ליקוי הנוירולוגים המתקדם שהפגין עכברי TMEV-IDD. במיוחד, הפרוטוקול מציע המלצות של פרמטרים לבדיקה ספציפיים ככל הנראה מתאים בדרך כלל לומד נכות נוירולוגית בעכברי TMEV-IDD באמצעות מבחן Rotarod. הליך זה מספק בסיס, שלעומתו ניתן להעריך (1) הרלוונטית של מודל העכבר הזה ל- MS המתקדמת (2) התועלת שלה לבדיקת טיפולים שמטרתם בטיפול במצבי נוירולוגית מתקדמות כגון MS. ברור,מבחן ביצועי Rotarod והפרוטוקול ופרמטרי בדיקות אופטימיזציה הנוכחי אינם יעילים רק באיתור נכות נוירולוגית הדרגתית במודל עכבר TMEV-IDD, אבל הם גם שימושיים בחשיפת ליקויים הנגרמת וירוס אחרים ו / או עכבר גנטי מודלים של מחלות ניווניות.

Protocol

כל עבודת החיה מנצלת פרוטוקולים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש (IACUC) בבית הספר Geisel לרפואה בדארטמות.

1. במודל עכבר

1. אינדוקציה של מחלות demyelinating TMEV-מושרה
   1. הזז את הכלובים המכילים 4- לעכברי SJL בת 6 שבועות בן / JHan מהמדף למרחב עבודה נוח. סמן את העכברים (למשל, עם תג אוזן או אגרוף באוזן), כדי לאפשר הערכה פרטנית של מחלה קלינית היסטולוגית.
   2. צייר 30 μl של המניה מדביק TMEV (2 x 10 ⁶ יחידות פלאק ויוצרים; PFU) ב- PBS לתוך מזרק אינסולין 29-מד המחט.
   3. הכן את מכונת גז הרדמה: לבדוק את המערכת כדי להבטיח את נוכחותם של כמויות מספיקות של חמצן isoflurane למשך ההליך.
   4. הפעל את מד הזרימה עד 1 ליטר / דקה. מניחים את החיה לתוך תא אינדוקציה ולסגור את הדף. הפעל את vaporizer ל -3.5% ולנטר את החיה עד שכיבה.
   5. הסר את החיה מן החדר ולבדוק את העכבר על ידי צובט את שודד הדרכים כדי להבטיח הרדמה נאותה. חוסר בתגובת קמצוץ חזק מצביע הרדמה נאותה.
   6. נקה את הזריקה עם אלכוהול איזופרופיל 70%.
   7. להזריק את 30 μl של המניה מדביק TMEV לתוך הימנית של המוח הגדול בזריקה ביד חופשית (איור 1). האתר של הזרקה הוא בערך באמצע הדרך בין קו העין ואוזן ואת ממש ליד קו האמצע.
   8. החזר את העכבר לכלוב החזקתה פעם ערנית לחלוטין וניידת (בדרך כלל 3 - 5 דקות).
   9. להרדים עכברים ידי exsanguination או זלוף לב 3 עד 6 חודשים לאחר הדבקת TMEV, תלוי במהירות של התפתחות המחלה.

2. ניתוח Rotarod

1. מנגנון Rotarod
   1. עכברי מבחן לפני הדבקת TMEV לערוך להם היכרות עםמכונת להעריך מלאת בסיס איזון תיאום מנוע הרגילה שלהם.
   2. הפעל את פרוטוקול הסתגלות על -5 ימים לאחר ההדבקה (dpi; כלומר, 5 ימים לפני ההדבקה TMEV).
   3. אפשר העכברים להסתגל לחדר הבדיקה טרם תחילת 30 דקות לפחות בדיקות כדי Rotarod, על מנת לאפשר להם להסתגל לסביבה.
   4. ודא כי הן יחידת Rotarod והמחשב מופעלים ומחוברים זה לזה (איור 2).
   5. טרום להגדיר את Rotarod עם פרמטרי פרוטוקול אימון dpi -5, כמתואר בטבלה 1.
   6. שמור את קובץ העבודה עם המידע עדכני והזדהות.
   7. הזז את הכלוב ובו הכיתה להיבדק מהמדף אל שולחן סמוך Rotarod. עכברים בדרך כלל נבדקים חוליות 4.
   8. תרים עכבר בזנב ולמקם אותו על המוט, עם גב מהמפעיל. חזור על השני באמצעות העכבר הרביעי. אם FAL עכברls או קופץ, ומכניס אותו מנתיבה על Rotarod עד שכל העכברים נמצאים בעמדה. התעלם אם בכלל עכברים להסתובב להתמודד עם המפעיל.
   9. לאחר טעינת כל העכברים, ולחץ על כפתור "Enter" כדי להתחיל את הניסוי. שימו לב טיימרים להתחיל באופן אוטומטי ואת הסיבובים לדקה (סל"ד) על תצוגה עבור כל שביל.
      1. כמו כל חיה נופלת מן המוט, להקליט את המהירות של המוט בעת הנפילה, כמו גם את משך הזמן שבו החיה נשארת על המוט. המוט ימשיך לסובב עד שהחיה האחרונה נפלה ממכלול המוט.
   10. אחרי כל העכברים נפלו, השתמש במטלית כדי להסיר כל boli ושתן צואה מן המוט. הנוכחות של שתן חומר צואתי יכולה להשפיע על היכולת של עכברים כדי לאחוז את המוט.
       1. לאחר מנוחה של 3 דקות, לתת העכברים שניים ולאחר מכן לערוך מחקר שלישי. הזמן המקסימאלי לכל ניסוי יחיד הוא 240 שניות. נהל סך של 3 ניסויים במהלך כל היום בדיקות.
   11. החזר את העכברים לכלוב ביתם ולהחזיר אותם בחזרה אל המדף. בסוף פגישת הניסוי, לנקות את Rotarod עם מים וסבון כדי להסיר את כל הצואה את המכונה.
   12. נקה את baseplate עם 70% אתנול. תרסיס את המכונה כולה עם דו תחמוצת כלור לחיטוי.
   13. בימים - 4, - 3, - 2, ו - 1 pi, מראש להגדיר את Rotarod עם פרמטרים פרוטוקול הכשרה מתאימה, כפי שמתואר בטבלה 1, וחזור על שלבים 2.1.2 עד 2.1.12.
   14. לאחר קבלת אמצעי הבסיס, להדביק את העכברים עם TMEV. אפשר תקופת החלמה pi ל- 6 ימים.

פרוטוקול	יום הבדיקה	תדירות	מהירות ההתחלה (סל"ד)	מקסמהירות (סל"ד)	תְאוּצָה	ניסויים	ITI
					(סל"ד / sec)	(N x שניות)	(דקות)
הַדְרָכָה	- 5 dpi	יום 1	1	12	03/01	3x240 שניות	3
	- 4 dpi	יום 1	1	13	03/01	3x240 שניות	3
	- 3 dpi	יום 1	1	14	03/01	3x240 שניות	3
	- 2; - 1 dpi	יום 1	5	40	03/01	3x240 שניות	3
נִסיוֹנִי	מ +7 כדי +50 dpi	2 / שבוע	5	40	30/05	3x240 שניות	3
	מ 51-150 dpi	שבוע 1	5	40	30/05	3x240 שניות	3

טבלה 1: Rotarod פרמטרים באימוני פרוטוקולי ניסוי.

2. פרוטוקול הניסוי Rotarod
   1. ביום +7 dpi, מראש להגדיר את Rotarod עם פרמטרים פרוטוקול הניסוי המתאים, כפי שמתואר בטבלה 1. חזור על שלבים 2.1.2 עד 2.1.10.
   2. בסוף הניסוי # 3, שוקל כל עכבר ולעשות לעצמך את משקל הגוף על גליון הנתונים. לנקות ולחטא את Rotarod לפי השלבים 2.1.11 ו 2.1.12.
   3. בדוק את העכברים פעמים בשבוע במשך 6 השבועות הבאים, כפי שתואר לעיל. לאחר 6 שבועות (שבו העכברים הגיעו סביר בשלב מפנה) ^8,9, לבדוק את העכברים פעם בשבוע עם אותה experimentaפרוטוקול l. פרוטוקול הבדיקה בפועל נמשך בממוצע 150 ימים, תלוי כמובן המחלה הספציפית.
3. אינדקס נוירולוגיות פונקציונלי
   1. לייצא את הנתונים הגולמיים לתוך קובץ גיליון אלקטרוני לנתח את התוצאות.
   2. נתונים אקספרסים ככל שהזמן פועלים (איור 3 א): זוהי הפעם ריצה הרגילה בתוספת זמן הסיבוב הפסיבי פחות זמן עיכוב סיבוב (טבלה 2) ^10. חשב את זמן הריצה הממוצע של שלושה ניסויים ליום.
   3. אין מהיר הנתונים כמדד פונקציונלי נוירולוגיות (NFI; איור 3).
      1. חשבתי את סף ביצועי הבסיס של כל עכבר בודד. סף ביצועי בסיס נקבע כממוצע של כל זמנים פועלים מהיום + 15 עד + 45 pi ^6,7.
      2. חשבתי את NFI כממוצע של שלוש רצות הממוצע האחרונות מחולק סף ביצועי בסיס של זה ^6,7 עכבר ספציפי ^</ Sup>.
         הערה: אם נבדק פעמים רצופות עבור עכבר ביום + 72, + 76, ו + 79 pi הם 55 שניות, 45 שניות, ו -50 שניות, ובפעם הבסיס לאותה העכבר היה 135 שניות, את NFI בשביל זה עכבר על 79 dpi יהיה [(45 + 50 + 55) / 3] / 135 או 0.37.
   4. לבטא את הנתונים כקובץ NFI מתואם (adjNFI; איור 3 ג): להתאים את נתוני NFI לפי ערך אוכלוסייה עבור הניסוי הבודד.
      1. חשב את adjNFI על ידי חלוקת שווי NFI ידי הממוצע NFI שהשיגו בקבוצה שטופלה-דמה באותו יום ספציפי.

טווח	הַגדָרָה
זמן ריצה רגיל	הזמן הכולל העכבר מבלה פועל באופן פעיל על מוט מסתובב, כלומר, חביון ליפול.
זמן סיבוב פסיבי	אהר של זמן העכבר נשאר על המוט במצב הסיבוב הפסיבי.
זמן השהיה סיבוב	משך זמן העכבר נשאר על המוט במהלך מצב הסיבוב הפסיבי
מצב סיבוב פסיבי	כאשר העכבר תופס את המוט מסתובב מבלי ambulate.
זמן הפעלה סה"כ	הסכום הכולל של זמן העכבר נשאר על מוט מסתובב במהלך הפגישה.
ביצועי Baseline	ביצועי המנוע טרום נזק העריכו לקבוע סף הביצועים מינימום.
מדד תפקוד נוירולוגי (NFI)	מדד קליני, אשר משווה כל ביצועי מנוע עכבר, כלומר, זמן ריצה, בכל עת כדי ביצועי השיא שלה.
מדד תפקוד נוירולוגים מתואם (adjNFI)	כאשר תהליך נורמליזציה מוחל להתאים נתוני NFI לפי ערך אוכלוסייההניסוי היחיד.
ערך האוכלוסין	ממוצע ערך NFI מתקבל על ידי הקבוצה שטופל מדומה ליום מסוים.

טבלה 2: הגדרות של Rotarod פרמטרים שאומצו לכמת נוירולוגיות ירידת ערך.

תוצאות

מטרת הניסוי נציג זו הייתה להשוות את נכות נוירולוגית הנגרמת על ידי זן דניאלס (DA) ומתח שעועית של TMEV. למטרות המחקר הנוכחי, קבוצה של 32 נקבות עכברים SJL נדבקו intracranially עם TMEV, או זן DA (n = 16) או זן שעועית (n = 16), וסימנים קליניים שלהם נוטרו לאורך זמן. קבוצה נוספת של 20 ...

Discussion

למרות מספר מגבלות, מבחן ביצועי Rotarod מייצג כלי חשוב להערכת תפקוד מוטורי ועל תפקוד TMEV-IDD וכן את ההשפעה של התערבויות פרמקולוגיות על התקדמות מוגבלת בעכברים.

מבחן Rotarod תואר לראשונה בשנת 1957 ככולים למדידת גירעונות נוירולוגיות במכרסמים

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice SJL/JCrHsd 4 to 6 weeks old	Envigo	#052
TMEV virus stock
Isoflurane vaporizer	Harvard Apparatus	#340471
Insulin Syringes U- 100 29 g x 0.5 cc	BD	#328203
Rotamex-5 4 Lane Rota-Rod for Mice with RS-232 and Software	Columbus Instruments	#0890M