Mess Progressive neurologische Behinderungen in einem Mausmodell der Multiplen Sklerose

Zusammenfassung

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

Zusammenfassung

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

Einleitung

Theiler des Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV) ist ein neurotropen einzelsträngige RNA-Virus, das das murine zentralen Nervensystems persistent infiziert (CNS). Bei anfälligen Mäusen eine Infektion mit TMEV verursacht eine immunvermittelte, chronische progressive demyelinisierende Krankheit, bekannt als TMEV-induzierte demyelinisierende Erkrankung (TMEV-IDD). Experimentelle Infektion von Mäusen nimmt einen Krankheitsverlauf, dass bei der progressiven Formen der Multiplen Sklerose (MS) gesehen ähnelt. der akuten Phase und der chronischen Phase: TMEV-IDD wird durch zwei unterschiedliche Phasen gekennzeichnet. Die akute Phase ist eine milde, in der Regel subklinischen Enzephalitis ^1,2. Der zweite, der chronischen Phase, etwa einen Monat nach der Infektion beginnt, besteht aus einer langsam fortschreitende Behinderung durch Demyelinisierung gekennzeichnet, Entzündung und axonalen Schädigung ^1,2. Die Schwäche in Mäusen beobachtet, die mit Spastik und gelegentlich schwere tonische Krämpfe.

Da es derzeit keine medications den progressiven Behinderung bei Patienten zu verbessern, sind die Forscher besonders angezogen von TMEV-IDD, die für die Überwachung der Auswirkungen von disease modifying Drogen auf den Krankheitsverlauf eines optimalen Tiermodell darstellt. bei Mäusen als auch bei MS-Patienten jedoch erfordert die Überwachung des Fortschreitens der Behinderung eine kontinuierliche klinische Beobachtung über längere Zeiträume. Bei Mäusen kann die Langzeitüberwachung für Behinderungsprogression mit dem Rotarod Leistungstest durchgeführt werden.

Die Rotarod Performance-Test ist ein Standard-Verhaltenstest, der Motor-assoziierten Funktionen wie Koordination, Gleichgewicht und Müdigkeit bei Nagern auswertet. Die Mäuse haben ihr Gleichgewicht auf einer Drehstange zu halten, die unter ständiger Beschleunigung dreht; die Zeit, die Latenz zu fallen aus dieser Stab aufgezeichnet wird. Tiere, die mit neurologischen Störungen sind nicht in der Lage auf dem rotierenden Stab solange Kontrollen zu bleiben, und sie normalerweise abfallen, wenn die Drehzahl übersteigt ihreMotorleistung. Je mehr neurologische Beeinträchtigung der Tiere haben, fallen je früher sie von der Stange, und je kürzer die Zeit Latenz ist.

Der Vorteil der Rotarod - Test gegenüber den traditionellen optische Bonitur Systemen ist , dass es ein Ziel erzeugt, messbare variabler die Zeit latenz die letztlich für statistische Analysen verwendet werden können , um die Auswirkungen von Therapien und experimentellen Verfahren ³ zu quantifizieren.

Im Labor für Neuroimmunologie (LONI) in Dartmouth, Mäuse zu einem Anpassungsprotokoll unterzogen werden, wo sie vor der TMEV Infektion, um sie mit der Maschine vertraut zu machen getestet und ihre normalen "Baseline" Balance Koordination und Motorsteuerung zu bewerten ^{4, 5.} Sobald der Basislinie festgelegt wird, und die Mäuse werden mit TMEV infiziert, werden sie einmal oder zweimal pro Woche über einen Zeitraum von mehreren Monaten getestet. Die eigentliche Testprotokoll dauert durchschnittlich 150 Tage, so dass eine Beurteilung ermöglichender Rückgang der Balance, Koordination und Motorsteuerung über den gesamten Verlauf der demyelinisierende Erkrankung.

Mehrere hundert TMEV-IDD und scheinbehandelten Mäuse wurden bisher für neurologische Dysfunktion bei Dartmouth getestet. Diese Mäuse hatten verschiedene immunmodulatorische Behandlungen erhielten, aber keine pharmakologischen Wirkstoff gefunden wurde in Lindern Behinderungsprogression ^6,7 wirksam zu sein. Der vorliegende Artikel und die damit verbundene Protokoll beschreibt, wie die schrittweise von TMEV-IDD Mäuse zeigten neurologische Beeinträchtigung zu charakterisieren. Insbesondere auf das Protokoll bietet Empfehlungen spezifischer Testparameter glaubte für die Untersuchung neurologische Behinderungen bei TMEV-IDD-Mäuse im Allgemeinen geeignet sein, die Rotarod-Test. Dieses Verfahren stellt eine Basislinie, gegen die zur Beurteilung (1) die Relevanz dieses Mausmodell progressive MS und (2) ihre Nützlichkeit für Therapien bei der Behandlung von progressiven neurologischen Erkrankungen wie MS Ziel zu testen. Offensichtlich ist dieRotarod Leistungsprüfung und die aktuelle optimierte Testparameter und das Protokoll sind nicht nur nützlich bei progressive neurologische Behinderungen bei der TMEV-IDD-Maus-Modell zu erfassen, sondern sind auch nützlich bei der Beeinträchtigungen in anderen Virus-induzierten und / oder genetischen Mausmodellen von neurodegenerativen Erkrankungen aufzudecken.

Protokoll

Alle tierischen Arbeit nutzt Protokolle, die von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) bei Geisel School of Medicine an der Dartmouth überprüft und genehmigt.

1. Die Maus-Modell

1. Die Induktion von TMEV-induzierte demyelinisierende Erkrankung
   1. Verschieben Sie die Käfige 4- bis 6-Wochen alte weibliche SJL / Jhan Mäuse aus dem Rack zu einem komfortablen Arbeitsraum enthält. Markieren die Mäuse (zB mit einer Ohrmarke oder Ohr punch) für individuelle Bewertung der klinischen und histologischen Krankheits zu ermöglichen.
   2. Zeichnen Sie 30 ul TMEV infizieren Lager (2 × 10 ⁶ Plaque - bildende Einheiten; PFU) in PBS in eine 29-Gauge - Insulin - Spritze und Nadel.
   3. Bereiten Sie die Anästhesiegas-Maschine: das System überprüfen das Vorhandensein von ausreichenden Mengen an Sauerstoff und Isofluran für die Dauer des Verfahrens zu gewährleisten.
   4. Schalten Sie den Durchflussmesser auf 1 L / min. Legen Sie das Tier in die Induktionskammer und versiegeln die Spitze. Schalten Sie die vaporizer auf 3,5% und das Tier bis zur Liege überwachen.
   5. Nehmen Sie das Tier aus der Kammer und testen Sie die Maus durch die Fußballen Kneifen ausreichende Anästhesie zu gewährleisten. Der Mangel an Reaktion auf eine starke Prise zeigt eine ausreichende Anästhesie.
   6. Reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70% Isopropylalkohol.
   7. Injizieren Sie den 30 ul TMEV infizieren Lager in die rechte Gehirnhälfte durch freihändig Injektion (Abbildung 1). Die Injektionsstelle ist etwa auf halbem Weg zwischen dem Auge und Ohr Linie und in unmittelbarer Nähe der Mittellinie.
   8. Bringen Sie die Maus an seinen Haltekäfig einmal voll wach und mobil (in der Regel 3 bis 5 min).
   9. Euthanize Mäusen durch Ausbluten oder Herzperfusion 3 bis 6 Monate nach TMEV-Infektion, je nach der Schnelligkeit, mit der Entwicklung der Krankheit.

2. Rotarod Analyse

1. Der Rotarod Vorrichtung
   1. Test-Mäuse vor TMEV Infektion sie mit dem vertraut zu machenMaschine und ihre normalen Ausgangs Balance Koordination und Motorsteuerung zu beurteilen.
   2. Starten Sie das Anpassungsprotokoll auf -5 Tage nach der Infektion (dpi, dh 5 Tage vor TMEV Infektion).
   3. Erlauben die Mäuse für mindestens 30 min vor dem Rotarod-Tests, um den Testraum zu akklimatisieren, damit sie an die Umgebung anzupassen.
   4. Stellen Sie sicher , dass sowohl die Rotarod - Einheit und der Computer eingesteckt sind und die miteinander verbunden sind (Figur 2).
   5. Die Rotarod mit den -5 dpi Trainingsprotokollparameter voreingestellt, wie in Tabelle 1 beschrieben.
   6. Speichern Sie die Arbeitsdatei mit dem Datum und Identifikationsinformationen.
   7. Bewegen Sie den Käfig der Kader enthält neben dem Rotarod aus dem Rack an einem Tisch getestet werden. Die Mäuse werden in der Regel in Trupps von 4 getestet.
   8. Pick-up eine Maus am Schwanz und legen Sie es auf der Stange, mit Blick weg vom Bediener. Wiederholen Sie dies für den zweiten bis vierten Maus. Wenn eine Maus falls oder springt, legen Sie sie in der Spur auf dem Rotarod zurück, bis alle Mäuse in der Lage sind. Ignorieren, wenn irgendwelche Mäuse herum drehen den Bediener zu stellen.
   9. Nach dem Laden alle Mäuse, drücken Sie die "Enter" Taste, um das Experiment zu starten. Beachten Sie die Timer automatisch und die Umdrehungen pro Minute (rpm) auf dem Display für jede Spur beginnen.
      1. Da jedes Tier von der Stange fällt, die Geschwindigkeit der Stange aufzunehmen, sowie auch die Dauer der Zeit, zu der Zeit des Falls, das Tier auf der Stange geblieben. Der Stab wird weiter drehen, bis das letzte Tier aus dem Gestänge gefallen ist.
   10. Nachdem alle Mäuse gefallen sind, ein Gewebe verwenden, jede fäkale Boli und Urin von der Stange zu entfernen. Das Vorhandensein von Urin und Fäkalien können die Fähigkeit der Mäuse zu greifen beeinflussen die Stange.
       1. Nach einer 3-min Ruhe, geben die Mäuse eine zweite und dann eine dritte Versuch. Die maximale Zeit pro Einzel Studie beträgt 240 sec. Verwalten insgesamt 3 Versuche bei jedem Testtag.
   11. Bringen Sie die Mäuse in ihre Heimat Käfig und bringt sie auf die Zahnstange zurück. Am Ende der experimentellen Sitzung, reinigen Sie die Rotarod mit Seife und Wasser alle Fäkalien aus der Maschine zu entfernen.
   12. Wischen Sie die Grundplatte mit Ethanol 70%. Sprühen Sie die gesamte Maschine mit Chlordioxid nach unten zu desinfizieren.
   13. An den Tagen , - 4, - 3, - 2 und - 1 pi, die Rotarod mit den entsprechenden Trainingsprotokollparameter voreingestellt, wie in Tabelle 1 beschrieben, und wiederholen Sie die Schritte 2.1.2 bis 2.1.12.
   14. Nachdem die Basismaßnahmen zu erhalten, infizieren die Mäuse mit TMEV. Lassen Sie einen 6-Tage pi Erholungsphase.

Protokoll	Testing Day	Frequenz	Startgeschwindigkeit (rpm)	MaxSpeed ​​(rpm)	Beschleunigung	Versuche	ES I
					(rpm / sec)	(N x sec)	(min)
Ausbildung	- 5 dpi	1 Tag	1	12	01/03	3x240 sec	3
	- 4 dpi	1 Tag	1	13	01/03	3x240 sec	3
	- 3 dpi	1 Tag	1	14	01/03	3x240 sec	3
	- 2; - 1 dpi	1 Tag	5	40	01/03	3x240 sec	3
Experimental	Von 7 bis 50 dpi	2 Wochen	5	40	30.05	3x240 sec	3
	Von 51 bis 150 dpi	1 Woche	5	40	30.05	3x240 sec	3

Tabelle 1: Rotarod Parameter im Training und experimentelle Protokolle.

2. Die Rotarod experimentelles Protokoll
   1. Auf +7 dpi, die Rotarod mit den entsprechenden experimentellen Protokollparameter voreingestellt, wie in Tabelle 1 beschrieben. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.2 bis 2.1.10.
   2. Am Ende der Studie # 3, jede Maus wiegen und eine Notiz des Körpergewichts auf dem Datenblatt zu machen. Reinigen und desinfizieren Sie die Rotarod gemäß Schritt 2.1.11 und 2.1.12.
   3. Testen der Mäuse zweimal pro Woche für die folgenden 6 Wochen, wie oben beschrieben. Nach 6 Wochen (in denen die Mäuse wahrscheinlich eine Plateauphase erreicht haben) ^8,9, testen Sie die Mäuse einmal pro Woche mit der gleichen Experimental-Protokoll. Die tatsächliche Testprotokoll dauert im Durchschnitt 150 Tage, abhängig von dem spezifischen Krankheitsverlauf.
3. Neurologische Funktions Index
   1. Exportieren Sie die Rohdaten in ein Tabellenkalkulationsdatei und die Ergebnisse zu analysieren.
   2. Express - Daten als Laufzeit (3A): Dies ist die normale Laufzeit plus die passive Rotationszeit minus der Drehverzögerungszeit (Tabelle 2) ^10. Berechnen Sie die mittlere Zeit der drei Versuche pro Tag ausgeführt wird.
   3. Express die Daten als neurologische Funktions Index (NFI, 3B).
      1. Berechnen Sie die Basisleistung Schwelle jeder einzelnen Maus. Die Baseline - Performance - Grenzwert wird als Mittelwert aller Laufzeiten von Tag + 15 bis + 45 pi ^6,7 bestimmt.
      2. Berechnen Sie die NFI als Mittelwert der drei letzten Mal durchschnittliche Lauf dividiert durch die Basisleistungsschwelle dieser spezifischen Maus ^{6,7 <}/ Sup>.
         HINWEIS: Wenn die Laufzeiten für eine Maus am Tag getestet + 72, + 76 und + 79 pi sind 55 sec, 45 sec und 50 sec, und der Basiszeit für die gleiche Maus betrug 135 sec, die NFI für die Maus auf +79 dpi wird [(45 + 50 + 55) / 3] / 135 oder 0,37.
   4. Express die Daten als ein bereinigtes NFI (adjNFI; 3C): die LFI - Daten von einer Bevölkerung Wert für den einzigen Experiment einzustellen.
      1. Berechnen Sie die adjNFI durch die NFI-Wert durch die durchschnittliche NFI von der scheinbehandelten Gruppe an diesem bestimmten Tag erhalten zu teilen.

Begriff	Definition
Normale Laufzeit	Die Gesamtzeit , die Maus auf dem rotierenden Stab aktiv ausgeführt damit verbringt, das heißt, die Latenz zu fallen.
Passive Drehzeit	die aBerg der Zeit hat sich die Maus auf dem Stab in der passiven Rotationsmodus geblieben.
Rotation Verzögerungszeit	Die Menge an Zeit, die Maus auf der Stange während der passiven Rotationsmodus bleibt
Passive Rotationsmodus	Wenn packt die Maus, um die Stange und dreht sich ohne ambulate zu müssen.
Gesamtsitzungszeit	Gesamtzeit bleibt die Maus auf dem rotierenden Stab während der Sitzung.
Basisleistung	Anschädigung Motorleistung die minimale Leistungsschwelle zu bestimmen, beurteilt.
Neurologische Funktionsindex (NFI)	Klinischer Index, der jede Maus Motorleistung vergleicht, das heißt, Laufzeit, zu jeder Zeit auf seine Höchstleistung.
Das bereinigte neurologische Funktionsindex (adjNFI)	Wenn ein Normalisierungsprozess angewendet LFI-Daten von einer Bevölkerung Wert einzustellen fürdie einzigen Experiment.
Bevölkerung Wert	Durchschnittliche NFI Wert durch die scheinbehandelte Gruppe an einem bestimmten Tag erhalten.

Tabelle 2: Definitionen der Rotarod Parameter Angenommen neurologische Beeinträchtigung zu beziffern.

Ergebnisse

Das Ziel dieser repräsentativen Experiment war die neurologische Behinderung durch die Daniels (DA) Stamm und BEAN Stamm von TMEV induziert zu vergleichen. Für die Zwecke der vorliegenden Studie wurde eine Gruppe von 32 weiblichen SJL-Mäuse wurden infiziert intracranial mit TMEV, entweder die DA-Stamm (n = 16) oder die BEAN-Stamm (n = 16), und ihre klinischen Symptome wurden im Laufe der Zeit überwacht. Eine weitere Gruppe von 20 Mäusen wurde Schein behandelt (dh wurde Koch...

Diskussion

Trotz einiger Einschränkungen stellt die Rotarod Performance-Test ein wichtiges Instrument der motorischen Funktion und Dysfunktion in TMEV-IDD sowie die Wirkung von pharmakologischen Interventionen auf Behinderungsprogression bei Mäusen für die Beurteilung.

Der Rotarod Test wurde zum ersten Mal für die Messung neurologische Defizite bei Nagern ¹¹ im Jahr 1957 als ein Werkzeug beschrieben. Nagetiere haben auf einem rotierenden Stab zu gehen, mit Drehgeschwindigkeit zu erhöhen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice SJL/JCrHsd 4 to 6 weeks old	Envigo	#052
TMEV virus stock
Isoflurane vaporizer	Harvard Apparatus	#340471
Insulin Syringes U- 100 29 g x 0.5 cc	BD	#328203
Rotamex-5 4 Lane Rota-Rod for Mice with RS-232 and Software	Columbus Instruments	#0890M