Multipl Skleroz Fare Modeli Progressive Nörolojik Engellilik Ölçümü

Özet

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

Özet

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

Giriş

Theiler ensefalomiyelit virüsü Sıçangil (TMEV) sürekli sıçangil merkezi sinir sistemi (CNS) enfekte eden bir nörotropik tek iplikli RNA virüsüdür. duyarlı farelerde, TMEV enfeksiyonu TMEV kaynaklı demiyelinizan hastalıkları (TMEV-IDD) olarak bilinen bir immün aracılı, kronik progresif demiyelinasyon hastalığı, neden olur. Farelerin Deneysel enfeksiyon, multipl skleroz (MS), progresif formları görülene benzeyen bir hastalık seyri alır. akut dönemde ve kronik fazda: TMEV-ATT iki farklı aşamadan ile karakterizedir. Akut faz hafif, genellikle subklinik ensefalit ^1,2 olduğunu. İkinci, kronik faz enfeksiyondan sonra yaklaşık bir ay başlayan, demiyelinizasyon, enflamasyon ve aksonal hasar ^1,2 ile karakterize yavaş ilerleyen sakatlık oluşmaktadır. farelerde gözlenen zayıflık spastisite ve bazen şiddetli tonik spazmlar ile ilişkilidir.

Şu anda medicatio olduğundanns hastalarda ilerici engeli iyileştirecek, araştırmacılar özellikle hastalığın ilerlemesi üzerinde hastalık modifiye ilaçların etkilerini izlemek için optimal bir hayvan modeli temsil TMEV-İER tarafından ilgi vardır. Bununla birlikte, farelerde ve MS hastalarında, sakatlık ilerlemesinin izlenmesi, uzun zaman süreleri boyunca sürekli klinik gözlem gerektirir. Farelerde, sakatlık ilerlemesi için uzun vadeli izleme rotarod performans testi ile yapılabilir.

Rotarod performans testi gibi kemirgenler koordinasyon, denge ve yorgunluk gibi motorlu ilişkili işlevleri değerlendiren bir standart davranış testtir. Fareler sürekli ivme altında dönen bir dönüm çubuk, kendi dengesini korumak için var; Bu çubuk kaydedilir arasındaki süre gecikme düşmesi. Nörolojik disfonksiyon Hayvanlar kontroller sürece dönen çubuk üzerinde duramayan ve dönme hızı aştığında normalde düşüyorlar onlarınMotor kapasitesi. hayvanlar var daha nörolojik bozukluk, er onlar çubuk düşmek ve kısa zaman gecikme olduğunu.

Geleneksel görsel skorlama sistemleri üzerinden rotarod testinin avantajı bir hedef oluşturur ki, ölçülebilir değişken zamanlı gecikme-sonuçta tedaviler ve deneysel prosedürler ³ etkilerini ölçmek için istatistiksel analizler için kullanılabilir.

Dartmouth Nöroimmünoloji (Loni) Laboratuvarı, fareler için makine ile onları tanımak için ve normal "taban" denge koordinasyon ve motor kontrolünü ⁴ değerlendirmek için onlar önce TMEV enfeksiyonuna test edilir bir adaptasyon protokolü, tabi ^{tutulur, 5.} temel kurulur ve fareler TMEV bulaşmış sonra, birkaç aylık bir süre boyunca bir veya iki kez bir hafta test edilir. Gerçek test protokolü dolayısıyla bir değerlendirmesini sağlayan, 150 gün ortalama sürerdemiyelinizan hastalık tüm kurs boyunca denge, koordinasyon ve motor kontrol düşüş.

yüzlerce TMEV-IDD ve plasebo ile tedavi edilen fareler, Dartmouth nörolojik fonksiyon bozukluğu için şu ana kadar test edilmiştir. Bu fareler, çeşitli bağışıklık tedavileri almış, ancak hiçbir farmakolojik madde sekel progresyonu ^6,7 iyileştirmede etkili olduğu tespit edilmiştir. Bu makale ve ilgili protokol TMEV-IDD fareler tarafından görüntülenen ilerleyici nörolojik bozukluğu karakterize açıklanmıştır. Özel olarak, iletişim kuralı rotarod testi kullanılarak TMEV-IDD farelerde nörolojik engeli çalışmak için genellikle uygun olduğuna inanılan özel test parametrelerinin öneriler vardır. Bu prosedür değerlendirmek için bir temel (1) MS gibi ilerleyici nörolojik durumların tedavisinde amaçlayan tedaviler test etmek için progresif MS ve (2) yararlılığını bu fare modelinde alaka sağlar. Açıktır ki,Rotarod testi ve mevcut optimize test parametreleri ve protokol TMEV-IDD fare modelinde ilerleyici nörolojik engeli tespit sadece yararlı değildir, ama aynı zamanda, nörodejeneratif hastalıkların ve diğer virüs kaynaklı ve / veya genetik fare modellerinde bozuklukları ortaya çıkarılmasında yararlıdırlar.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları Dartmouth Tıp Geisel Okulu'nda Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelenen ve onaylanan protokoller kullanır.

1. Fare Modeli

1. TMEV Bağlı Demyelinizan Hastalığının indüksiyon
   1. rahat bir çalışma alanı için raftan 4- 6 haftalık dişi SJL / jhan fareler içeren kafesleri taşıyın. Klinik ve histolojik hastalığın bireysel değerlendirilmesi için izin vermek için (bir kulak etiketi veya kulak yumruk gibi) fareler işaretleyin.
   2. 29-gauge insülin şırınga ve iğne içine PBS; TMEV enfekte stok (PFU 2 x 10 ⁶ plak oluşturucu birim) 30 ul çizin.
   3. Anestezi gazı makinesini hazırlayın: prosedürün süresince oksijen ve izofluran yeterli miktarda varlığını sağlamak için sistemi kontrol ediniz.
   4. 1 l / dk akış ölçer açın. indüksiyon odasına hayvan koyun ve üst mühür. va açma% 3,5 porizer ve yatarak kadar hayvan izleyin.
   5. odasından gelen hayvan çıkarın ve yeterli anestezi sağlamak için Kapkaççı kısma fare test edin. Güçlü bir tutam yanıt eksikliği yeterli anestezi gösterir.
   6. % 70 izopropil alkol ile enjeksiyon bölgesini temizleyin.
   7. Serbest enjeksiyon (Şekil 1) sağ serebral hemisferde içine TMEV bulaşmasını stokunun 30 ul enjekte edilir. Enjeksiyon yeri yaklaşık yarım göz ve kulak hattı arasında sadece orta hat kapalı.
   8. (- 5 dk genellikle 3) holding kafes kez tamamen uyanık ve hareketli fare dönün.
   9. Hastalığın gelişme bir hızla bağlı olarak, 3 ila 6 ay TMEV enfeksiyonundan sonra kan kaybından ya da kardiyak perfüzyon fareler öldürülür.

2. rotarod Analizi

1. rotarod Aparatı
   1. önce TMEV enfeksiyon deney fareleri onları tanımak içinMakine ve normal bazal denge koordinasyon ve motor kontrolünü değerlendirmek için.
   2. -5 Günlerde adaptasyon protokolü sonrası enfeksiyon (; yani, 5 gün TMEV enfeksiyondan önce dpi) başlatın.
   3. fareler onları ortama uyum sağlamak amacıyla, en az 30 dakika önce rotarod için test için test odasına gelmesini bekleyin.
   4. Rotarod ünitesi ve bilgisayar hem de takılı ve birbirlerine (Şekil 2) bağlı olduğundan emin olun.
   5. Tablo 1 'de tarif edildiği gibi, -5 dpi eğitim protokolü parametrelerle rotarod önceden ayarlanmıştır.
   6. tarih ve kimlik bilgileri ile çalışma dosyasını kaydedin.
   7. Rotarod bitişik bir tabloya raftan test edilecek kadro içeren kafesi hareket ettirin. Fareler genellikle 4 mangaları test edilmektedir.
   8. operatörden uzak bakan, kuyruk tarafından fare Pick up ve çubuk üzerine yerleştirin. Dördüncü fare aracılığıyla saniye tekrarlayın. Fare fal halindetüm fareler konumuna gelene kadar ls veya atlar, rotarod üzerindeki şeritte geri yerleştirin. Herhangi fareler operatörü yüz etrafında dönerse görmezden.
   9. Bütün fareler yükledikten sonra, denemeyi başlatmak için "Enter" tuşuna basın. sayaçlarını otomatik olarak başlayacak gözlemlemek ve her kulvar için ekranda dakika (rpm) dönmeler.
      1. Her bir hayvan, çubuk düştükçe, hayvan çubuk üzerinde kalan düşme zaman çubuğun hızı, hem de süreyi kaydedin. çubuk geçen hayvan çubuk montaj düştü kadar dönmeye devam edecektir.
   10. Tüm fareler düşmüş sonra, çubuk herhangi bir dışkı boli ve idrar çıkarmak için bir doku kullanın. İdrar ve dışkı maddesinin bulunması, kavrama farelerin çubuğu yeteneğini etkileyebilir.
       1. 3 dakikalık bir dinlenmeden sonra, farelere üçüncü deneme sonra ikinci ve vermek. Tek deneme başına maksimum zaman 240 saniyedir. Her test gündüz 3 çalışmaların toplam yönetme.
   11. evlerine kafesine fareler dönün ve tekrar rafa onları geri. Deneysel oturumun sonunda, makinenin kapalı tüm dışkı çıkarmak için sabun ve su ile rotarod temizleyin.
   12. etanol% 70 ile temiz taban plakasını silin. dezenfekte etmek için klor dioksit ile tüm makineyi aşağı püskürtün.
   13. 4 -, - 3, 2 - ve - günlerde 1 PI, Tablo 1 'de tarif edildiği gibi, uygun bir eğitim protokolü parametrelerle rotarod önceden ayarlanmış ve tekrar 2.1.12 2.1.2 adımları tekrarlayın.
   14. Bazal önlemleri alındıktan sonra, TMEV ile fareleri enfekte. 6 gün pi iyileşme süresini bekleyin.

Protokol	Test günü	Sıklık	Başlangıç hızı (rpm)	maksimumHızı (rpm)	Hızlanma	denemeler	ITI
					(rpm / sn)	(N x sn)	(dakika)
Eğitim	- 5 dpi	1 gün	1	12	01/03	3x240 sn	3
	- 4 dpi	1 gün	1	13	01/03	3x240 sn	3
	- 3 dpi	1 gün	1	14	01/03	3x240 sn	3
	- 2; - 1 dpi	1 gün	5	40	01/03	3x240 sn	3
Deneysel	+7 Itibaren 50 dpi	2 hafta	5	40	30/05	3x240 sn	3
	+51 Itibaren 150 dpi	1 hafta	5	40	30/05	3x240 sn	3

Tablo 1: Eğitim ve Deneysel Protokolleri rotarod Parametreleri.

2. Rotarod Deneysel Protokol
   1. Tablo açıklandığı gibi 7 dpi üzerinde, uygun deneysel protokol parametreleri ile rotarod önceden ayarlanmış 1. Tekrarlayın 2.1.10 için 2.1.2 adımları.
   2. Deneme içerisinde 3. sonunda, her fare tartmak ve bilgi formunda vücut ağırlığının not edin. Temiz ve adımlar 2.1.11 ve 2.1.12 göre rotarod dezenfekte.
   3. yukarıda tarif edildiği gibi, 6 hafta boyunca haftada iki defa fareler test edin. Aynı experimenta ile haftada bir kez fareler, ^8,9 (fareler büyük olasılıkla bir plato safhasına ulaşan aldığınız) testi 6 hafta sonral protokolü. Gerçek test protokolü belirli bir hastalık seyrine bağlı olarak, 150 gün ortalama sürer.
3. Nörolojik Fonksiyonel İndeksi
   1. Bir tablo dosyasına ham veri ihracat ve sonuçları analiz eder.
   2. Çalışma süresi (Şekil 3A) olarak Ekspres veriler: bu normal çalışma süresi artı pasif rotasyon süresi eksi dönme gecikme süresi (Tablo 2) ^10. Günde üç çalışmanın ortalama çalışma süresini hesaplayın.
   3. Nörolojik fonksiyonel indeksi (Şekil 3B NFI) gibi verileri ifade eder.
      1. Her bir fare temel performans eşiğini hesaplayabilir. Bazal performans eşiği + 15 + 45 pi ^6,7 güne çalışan tüm zamanların ortalaması olarak belirlenmiştir.
      2. Belirli bir fare ^6,7 bazal performansı eşik bölü üç en son ortalama çalışma süreleri ortalaması olarak UOE hesaplayın ^</ Sup>.
         NOT: 135 sn, o fare için NFI olarak günün + 72 fare, + 76 için çalışan kez test ve + 79 pi 55 sn, 45 sn ve 50 sn ve aynı fare için temel zaman ise 79 dpi üzerinde [(45 + 50 + 55) / 3] / 135 veya 0.37 olacak.
   4. Tek bir deney için bir nüfus değerine göre NFI verileri ayarlayın: (Şekil 3C adjNFI) ayarlanmış bir NFI gibi veri ifade eder.
      1. Bu belirli bir günde plasebo ile tedavi edilen grup ile elde edilen ortalama NFI göre NFI değerine bölünmesiyle adjNFI hesaplayın.

dönem	Tanım
Normal çalışma süresi	Fare aktif dönen çubuk üzerinde çalışan harcadığını toplam süre, yani gecikme düşmeye.
Pasif rotasyon zamanı	birmontaj zaman fare pasif rotasyon modunda çubuk üzerinde kalmıştır.
Rotasyon gecikme süresi	Fare pasif rotasyon modu sırasında çubuk üzerinde kalan süre
Pasif dönüş modu	Fare çubuk kapmak ve ambulate zorunda kalmadan döndüğünde.
Toplam oturum süresi	toplam süre fare oturumu sırasında dönen çubuk üzerinde kalır.
Baseline performans	Ön hasar motoru performansı asgari performans eşiğini belirlemek için değerlendirilir.
Nörolojik fonksiyon indeksi (NFI)	Her fare motor performansı karşılaştırır klinik endeksi, yani kendi performansını en üst için herhangi bir zamanda, çalışma süresi.
Düzeltilmiş nörolojik fonksiyon indeksi (adjNFI)	Bir normalizasyon işlemi bir nüfus değeriyle NFI verileri değiştirmek uygulandığındaTek deney.
Nüfus değeri	Belirli bir günde sahte tedavi edilen grupta elde edilen ortalama NFI değeri.

Tablo 2: Nörolojik Değer Düşüklüğü belirlememize Benimsenen rotarod Parametrelerinin Tanımları.

Sonuçlar

Bu temsili deneyin amacı Daniels (DA) zorlanma ve TMEV Bean suşu tarafından uyarılan nörolojik özürlülük karşılaştırmaktır. Bu çalışmanın amaçları doğrultusunda, 32 kadın SJL farelerinin bir grup (n = 16), TMEV ile intrakranial DA suşu (n = 16) veya fasulye suşu da enfekte edildi ve klinik bulgular, zaman içinde izlenmiştir. 20 farelerin ek bir grup sahte muamele edilmiştir (yani, tuzlu su çözeltisi enjekte edilmiştir intrakranial) ve sağlıklı ko...

Tartışmalar

Bazı kısıtlamalara rağmen, rotarod performans testi, motor fonksiyon ve disfonksiyonu TMEV-İER yanı sıra farelerde sakatlık ilerlemesi üzerine farmakolojik müdahalelerin etkisini değerlendirmek için önemli bir araç temsil eder.

Rotarod testi ilk kemirgenler ¹¹ nörolojik defisit ölçmek için bir araç olarak 1957 yılında tanımlanmıştır. Kemirgenler dönen hızını artırma ile dönen bir çubuk üzerinde yürümek ve yere düşmesini önlemek için denemek z...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice SJL/JCrHsd 4 to 6 weeks old	Envigo	#052
TMEV virus stock
Isoflurane vaporizer	Harvard Apparatus	#340471
Insulin Syringes U- 100 29 g x 0.5 cc	BD	#328203
Rotamex-5 4 Lane Rota-Rod for Mice with RS-232 and Software	Columbus Instruments	#0890M