多発性硬化症のマウスモデルで進行性の神経障害を測定します

要約

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

要約

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

概要

タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（TMEV）が持続的に、マウスの中枢神経系（CNS）に感染神経向性一本鎖RNAウイルスです。感受性マウスでは、TMEVによる感染はTMEV誘発性脱髄疾患（TMEV-IDD）として知られる免疫介在性、慢性進行性の脱髄疾患を引き起こします。マウスの実験的感染は、多発性硬化症（MS）の進行形で見られるものに似ている病気のコースを取ります。急性期と慢性期：TMEV-IDDは、2つの異なる相によって特徴付けられます。急性期は軽度、通常は不顕性脳炎^1,2です。第二、慢性期は、感染後約一ヶ月始め、脱髄、炎症、および軸索損傷の^1,2によって特徴づけゆっくりと進行する障害者で構成されています。マウスで観察された弱さは痙縮と、時折、重度の強直性痙攣に関連しています。

現在のところmedicatioはありませんので、NSは患者に進行性の障害を改善するために、研究者は、特に疾患の進行上の疾患修飾薬の影響を監視するための最適な動物モデルを表しTMEV-IDDによって引き付けられます。しかし、マウスならびにMS患者では、障害の進行のモニタリングは、長期間にわたって連続的に臨床的観察を必要とします。マウスでは、障害の進行の長期的な監視は、ロータロッド性能試験を用いて達成することができます。

ロータロッドの性能試験は、げっ歯類の調整、バランス、疲労などのモータ関連する機能を評価する標準的な行動試験です。マウスは、連続的な加速の下で回転している回転ロッド、上の彼らのバランスを維持する必要があります。このロッドから落ちるまでの時間待ち時間が記録されています。神経機能障害を有する動物は、対照限り、回転ロッド上に留まることができない、と回転速度を超えたとき、彼らは通常、ドロップオフ、それらモータ容量。動物が持っているより多くの神経学的障害は、すぐに彼らは棒から落ちる、と短い時間の待ち時間があります。

従来の視覚的スコアリングシステム上のロータロッド試験の利点は、それが目的を生成することである、測定可能な可変時間遅延の最終的療法および実験手順³の効果を定量化するために統計分析のために使用することができます。

ダートマスでの神経免疫学の研究所（LONI）では、マウスは^、それらは機械でそれらを理解し、それらの通常の「ベースライン」のバランス調整とモータ制御^4を評価するために、前TMEV感染にテストされ、適応プロトコルに供されています^5。ベースラインが確立され、マウスはTMEVに感染していると、それらは数ヶ月の期間にわたって一回又は週二回試験します。実際の試験プロトコルは、このように評価を可能にする、150日の平均持続します脱髄疾患の全体にわたってバランス、調整、およびモータ制御の衰退。

数百TMEV-IDDおよび偽処置マウスは、ダートマスで神経機能障害のために、これまでに試験されています。これらのマウスは、様々な免疫治療を受けていたが、何の薬理学的薬剤は、障害の進行^6,7を改善するのに有効であることが見出されていません。現在の記事と関連プロトコルがTMEV-IDDマウスで表示される進行性の神経障害を特徴づける方法について説明します。特に、プロトコルは、ロータロッド試験を用いてTMEV-IDDマウスにおける神経障害を研究するための一般的に適切であると考えられ、特定のテスト・パラメータの推奨を提供しています。この手順では、MSのような進行性の神経学的症状を治療することを目的とした治療法を試験するための進行型MSにこのマウスモデルの（1）関連性と（2）その有用性を評価するに対してベースラインを提供します。明らかに、ロータロッド性能試験と現在の最適化されたテスト・パラメータおよびプロトコルはTMEV-IDDマウスモデルにおいて進行性の神経障害を検出することだけでなく、有用であるが、他のウイルス誘導性および/または神経変性疾患の遺伝的マウスモデルで障害を暴くにも有用です。

プロトコル

全ての動物の作業はダートマスで医学のガイゼル学校で検討し、施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されたプロトコルを利用しています。

1.マウスモデル

1. TMEV誘導性脱髄性疾患の誘導
   1. 快適な作業スペースにラックから4〜6週齢の雌SJL / JHanマウスを含むケージを移動します。臨床および組織学的疾患の個々の評価を可能にするために（耳タグまたは耳パンチと、例えば ）マウスをマークします。
   2. 29ゲージのインスリン注射器と針にPBS中、TMEV感染株式（PFU 2×10 ⁶プラーク形成単位）の30μLを描画します。
   3. 麻酔ガスマシンを準備します。手順の期間中、酸素およびイソフルランの適切な量の存在を確実にするためにシステムをチェック。
   4. 1L /分に流量計の電源をオンにします。誘導室に動物を置き、上部を密封します。 VAをオンにします3.5％にporizerとリカンベントまで、動物を監視します。
   5. チャンバーから動物を削除し、適切な麻酔を確保するために、フットパッドをつまんでマウスをテストします。強いピンチへの応答の欠如は、十分な麻酔を示しています。
   6. 70％イソプロピルアルコールで注射部位をきれいにしてください。
   7. フリーハンド注射（ 図1）によって、右大脳半球にTMEV感染株式の30μLを注入します。注射部位は、ほぼ中間の目と耳のラインとの間に、ちょうど正中線から外れています。
   8. （ - 5分、通常3）警報や携帯一度完全にその保持ケージにマウスを返します。
   9. 疾患の発症の速さに応じて、3〜6ヵ月TMEV感染後放血または心臓灌流によってマウスを安楽死させます。

2.ロータロッド分析

1. ロータロッド装置
   1. 試験マウスでそれらを理解するためにTMEV感染する前にマシンとそれらの正常なベースラインのバランス調整とモータ制御を評価します。
   2. -5日に適応プロトコル感染後（; すなわち、5日TMEV感染前の解像度）を起動します。
   3. マウスは、それらが環境に適応することを可能にするために、少なくとも30分前にロータロッドのテストのために試験室に順応することを可能にします。
   4. ロータロッド装置とコンピュータの両方が接続され、（ 図2）相互に接続されていることを確認します。
   5. 表1に記載したように、-5解像度トレーニングプロトコルパラメータでロータロッドを予め設定。
   6. 日付と識別情報と作業ファイルを保存します。
   7. ロータロッドに隣接テーブルにラックから試験しようとする部隊を含むケージを移動します。マウスは、通常、4の分隊で試験します。
   8. 尾によってマウスをピックアップし、棒の上に置き、オペレータから離れて直面しています。第マウスを介して第2の手順を繰り返します。マウスFAL場合すべてのマウスが定位置になるまでのlsやジャンプ、ロータロッド上の車線に戻ってそれを置きます。任意のマウスは、オペレータに直面して好転させる場合は無視します。
   9. すべてのマウスをロードした後、実験を開始するには、「Enter」ボタンを押してください。タイマーが各レーンのために自動的に起動し、ディスプレイ上の毎分回転数（rpm）を観察。
      1. 各動物がロッドから落ちるように、動物がロッド上に残って落下時のロッドの速度だけでなく、時間の長さを記録。ロッドは、最後の動物がロッドアセンブリから低下するまで回転し続けるだろう。
   10. すべてのマウスが落ちた後、ロッドから任意の糞便丸薬および尿を除去するための組織を使用しています。尿および糞便物質の存在が把持するマウスロッドの能力に影響を及ぼし得ます。
       1. 3分間の休憩の後、マウスを三裁判後、第2とを与えます。単一の試行あたりの最大時間は240秒です。各試験日の間に3試験の合計を管理します。
   11. 彼らのホームケージにマウスを返し、バックラックにそれらを返します。実験セッションの最後に、マシンからすべての糞便を削除するには、石鹸と水でロータロッドをきれいに。
   12. エタノール70％できれいにベースプレートを拭いてください。消毒するために二酸化塩素でマシン全体を下にスプレーしてください。
   13. 4、 - - 3、 - 2、および-日に1パイ、 表1に記載されているように、適切な訓練プロトコルパラメータでロータロッドをあらかじめ設定し、繰り返しは2.1.12に2.1.2を繰り返します。
   14. ベースライン測定を得た後、TMEVをマウスに感染させます。 6日間のパイの回復期間を許可します。

プロトコル	テストデー	周波数	開始数（rpm）	マックス数（rpm）	加速度	トライアル	ITI
					（回転/秒）	（NのX秒）	（分）
トレーニング	- 5解像度	1日	1	12	1月3日	3x240秒	3
	- 4解像度	1日	1	13	1月3日	3x240秒	3
	- 3解像度	1日	1	14	1月3日	3x240秒	3
	- 2; - 1解像度	1日	5	40	1月3日	3x240秒	3
実験的	7から50解像度へ	2 /週	5	40	5月30日	3x240秒	3
	51から150 dpiのに	1週間	5	40	5月30日	3x240秒	3

表1：トレーニングと実験プロトコールでのロータロッドのパラメータ。

2. ロータロッド実験プロトコール
   1. 表1に記載されているように、適切な実験プロトコルのパラメータを持つ7 dpiの、予め設定されたロータロッドに。繰り返し2.1.2 2.1.10にステップ。
   2. トライアル＃3の終わりに、各マウスを計量し、データシートに体重をメモします。清潔でステップ2.1.11および2.1.12ごとにロータロッドを消毒。
   3. 前述したように、次の6週間、週2回のマウスをテストします。 （マウスはそうプラトー期に達しているに）6週^8,9の後、同じエクスペリで週に一度マウスをテストしますリットルプロトコル。実際の試験プロトコルは、特定の疾患の経過に応じて、150日間の平均を持続します。
3. 神経学的機能インデックス
   1. スプレッドシートファイルに生データをエクスポートし、結果を分析。
   2. 走行時間（ 図3A）のようなエクスプレスデータ：これは通常の実行時間を加えた受動回転時間マイナス回転遅延時間（ 表^2）10です。一日あたり3回の試験の平均実行時間を計算します。
   3. 神経学的機能指数（; 図3B NFI）などのデータを表現します。
      1. 各個々のマウスのベースラインパフォーマンスのしきい値を計算します。ベースライン性能閾値は+ 15 + ^45π6,7日目から実行中のすべての時間の平均値として決定されます。
      2. その特定のマウス^6,7のベースラインパフォーマンスのしきい値で割った最新の3つの平均実行時間の平均としてNFIを計算します^</ SUP>。
         注：そのマウスのために、日+ 72上でのマウスのための試験を実行している回場合は+ 76、および+ 79 piが55秒、45秒、50秒であり、同じマウスのベースライン時間は135秒であった、NFI 79 dpiの上に[（45 + 50 + 55）/ 3] / 135または0.37になります。
   4. 調整後のNFI（adjNFI; 図3C）などのデータを表現する：単一の実験のための人口値によってNFIデータを調整します。
      1. その特定の日に偽処置グループによって得られた平均NFIによってNFI値を割ることによりadjNFIを計算します。

期間	定義
通常走行時	マウスが積極的に回転棒上で実行されているに費やす合計時間は、 すなわち 、待ち時間が落下します。
受動回転時間	Aマウスは受動回転モードでロッド上に留まっている時間をマウントします。
回転遅延時間	マウスは受動回転モード時にロッド上に残っている時間の量
受動回転モード	マウスは、ロッドをつかみ、歩行することなく回転すると。
総セッション時間	マウスは、セッション中に回転棒上に残っている時間の合計。
ベースライン性能	プリダメージモータの性能は最低性能閾値を決定するために評価します。
神経機能指数（NFI）	各マウスの運動性能を比較した臨床指標、 すなわち、そのピーク性能にいつでも、時間を実行しています。
調整後神経機能指数（adjNFI）	正規化処理は、母集団の値によってNFIデータを調整するために適用される場合単一の実験。
母集団値	特定の日で、偽処置群によって得られた平均NFI値。

表2：神経学的障害を定量化するために採用したロータロッドパラメータの定義。

結果

この代表的な実験の目的は、ダニエルズ（DA）株およびTMEVの豆株によって誘発される神経学的障害を比較することでした。本研究の目的のために、32雌SJLマウスの群（n = 16）、TMEVと頭蓋内DA株（N = 16）、またはマメ株のいずれかを感染させ、それらの臨床的徴候は、経時的にモニターしました。 20匹のマウスのさらなる群は、偽は、処理された（ すなわち、生?...

ディスカッション

いくつかの制限があるにもかかわらず、ロータロッド性能試験は、運動機能および機能不全TMEV-IDD中だけでなく、マウスでの障害進行に対する薬理学的介入の効果を評価するための重要なツールを表します。

ロータロッド試験は、最初にげっ歯類¹¹で神経学的欠損を測定するためのツールとして、1957年に記載されました。げっ歯類は、回転速度の増加に伴って、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice SJL/JCrHsd 4 to 6 weeks old	Envigo	#052
TMEV virus stock
Isoflurane vaporizer	Harvard Apparatus	#340471
Insulin Syringes U- 100 29 g x 0.5 cc	BD	#328203
Rotamex-5 4 Lane Rota-Rod for Mice with RS-232 and Software	Columbus Instruments	#0890M