Assay CFSE המבוסס לחקר נדידת תאי דנדריטים עור Murine לתוך ניקוז בלוטות הלימפה במהלך זיהום<em&gt; Mycobacterium בוביס</em&gt; Bacille Calmette-גרן

Summary

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Guérin.

Abstract

תאים דנדריטים (DCS) חשובים ליזום התגובה החיסונית, בין היתר, באמצעות היכולת שלהם לרכוש אנטיגן הסעות אל הצומת לימפה ניקוז (DLN). ההתגייסות של DCs אל DLN מורכבת ונשאר הובהר באופן מלא במהלך ההדבקה. בזאת הוא תיאר את השימוש של assay חדשנית, פשוטה הנשענת על fluorochrome 5 ו 6-carboxyfluorescein אסתר diacetate succinimidyl (CFSE) כדי לעקוב אחר נדידת DCs במהלך ההדבקה שודד עם Mycobacterium בוביס Bacille Calmette-גרן (BCG) ב C57BL / 6 עכברים. assay זה מאפשר אפיון של תת-אוכלוסיות העור DC העוברים באופן פעיל ניקוז, LN popliteal בתגובה BCG. פרוטוקול זה מקורו מודל BCG שבו DCs עור הנודד זוהה על ידי cytometry זרימה. Assay הוא חביב ללימוד וזיהוי DCs או תאים אחרים ביתם של LN popliteal לאחר החיסון של חיידקים, מטבוליטים שלהם או אחרים דלקתייםלגירויים ב שודד דרכים, וכתוצאה מכך ללמוד הגורמים המווסתים את הנדידה של תאים אלה.

Introduction

DCs מקומי משטחי גוף לחוש חיידקים או למוצרים שלהן, ותוך כדי כך לגייס באמצעות כלי הלימפה אל LN ניקוז (DLN) ^1,2. רילוקיישן זה נחוץ לעברת אנטיגן חיידקים אל DLN ואת תחול הסוגר של התגובה החיסונית כדי החיידק הפולש. ואכן, מצור או כישלון של DCs להגר מן הרקמה הנגועה אל DLN משתיק את התגובה תא T ^3-5. בהתאם לכך, מבחנים שנועדו לעקוב אחר נדידה ברמה-התא בודד הם שימושיים שיעזרו מייחסי פונקציה נודדת לקבוצת משנת DC נתונה.

ישנו גוף גדול של נתונים על הגיוס של DCs עור אל DLN. החשבונות האחרונים עבור הרבה הידיעה על גירת DC מאתרים מוסתים או נגוע ^2. הדבר אינו מפתיע שכן עור בתי אוכלוסייה גדולה של DCS ו הוא משטח רמת נגישות גבוהה לניסויים של עכבר המעבדה. כמה טכניקות ובכך פותחו כדי להעריךנדידת DCs murine מהעור אל DLN ^2. ציור עור FITC הוא ללא ספק הגישה הנפוצה ביותר. ב assay זה והעמסת-5-isothiocyanate fluorochrome (FITC) מוכן בתערובת עם אצטון גורם האלרגיה. קוקטייל זה מוחל על העור מקולף או מגולח הצטברות של תאים שכותרתו FITC הוא בתורו ניתוחן DLN. הגירה יכול גם להיחקר על ידי הזרקת העור עם ננו fluorochrome מתויג או microparticles, המאפשרת מעקב של תאים phagocytic כי הפנימו חלקיקים פלורסנט בעור. כלי הלימפה ניתן cannulated גם לחלץ DCs נודדות ישירות הלימפה. זהו אולם מאתגר מבחינה טכנית, במיוחד אצל עכברים. מספר DCs השיג לניתוח שלאחר מכן הוא גם גורם מגביל.

למרות מחקרים קודמים רבים על גירת עור DC, נותר חוסר במידע לגבי ניוד עור DC כדי vacci הבא DLNאומה עם Bacille Calmette-גרן (BCG), זן חי ומוחלש של Mycobacterium בוביס בשימוש לחסן נגד M. שחפת. BCG הוא מחוסן בעור, גרימת זיהום מוגבל שמפעיל תגובה T מסייעים תאים מסוג 1. הן תת-אוכלוסיות DC כי לגייס אל DLN מהעור BCG נגועים והגורמים להסדיר הגירה שלהם במהלך התהליך הזה אינם מובנים במלואם. לאור האמור לעיל, שיטה פשוטה אך הרומן פותחה שבו fluorochrome 5 ו 6-carboxyfluorescein אסתר diacetate succinimidyl (CFSE) מוזרק באתרו לעקוב אחר נדידת DCs לתוך DLN ^3. עכברי C57BL / 6 מוזרקים שודדים הדרכים האחוריות עם בידוד של BCG ושלשום קרבה, חיות מוזרקות באותו השודד עם ריכוז גבוה של CFSE. עשרים וארבע שעות לאחר מכן חיות מוקרבות ואת LN popliteal ניקוז (PLN) הוסרה והוכנה cytometry זרימה. assay זה מאפשר IDEntification של תאים הנודדים לילה מהעור שודד אל DLN (איור 1).

יתר על כן, עכברים במיקוד גן ניתן להשתמש כדי לסייע בזיהוי גורמים הנדרשים תאיים לגייס את DLN. שימוש assay זה, כותבי הדו"ח הזה מצאו בעבר כי BCG תחבורה DCs העור הנודד ^הגבוה CD11b ^נמוך EpCAM אל DLN בתהליך מוסדר על ידי קולטן אינטרלאוקין 1 ואת MyD88 מולקולת המתאם התאי ^3. הפרוטוקול עבור assay גירת CFSE מבוסס זה שמקורו מהדוח מעל ידי Bollampalli et al. ³ שם cytometry הזרימה שמש כדי לזהות ולנתח DCs עור נודד, מתואר במסמך זה. היתרונות והחסרונות של assay זה הם דנו.

Protocol

הערה: C67BL / 6 עכברים שימשו הניסויים הראו בכתב היד הזה. בעלי חיים אלה היו בית בתנאים מסוימים הפתוגן ללא במתקן בעלי החיים MTC, קרולינסקה בשטוקהולם, שבדיה. ניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם להוראות והנחיות דירקטוריון חקלאות השבדית, הסוכנות להגנת בעלי החיים השבדית, קרולינסקה Institutet. הניסויים אושרו על ידי מועצת האתיקה Animal שטוקהולם צפון.

1. הכנת מניות CFSE ואחסון

1. הכינו מלאי 5 מ"מ של 5 ו 6-carboxyfluorescein אסתר diacetate succinimidyl (CFSE) ב sulfoxide דימתיל. מְעַרבּוֹלֶת. לוותר 100 aliquots μl לתוך סטרילי, 0.5 מ"ל בורג microtubes כובע. חנות aliquots ב -80 מעלות צלזיוס.

2. עכברים

1. השתמש זכר טהור או עכברות בין 8 ל 12 שבועות של גיל. חיות לסקס ואת גיל בהתאמה עדיפות. ודא האישורים האתיים הנדרשים חית arדואר במקום לפני תחילתו של ניסויים.

3. קיבוע של בעלי חיים עם Isoflurane גז הרדמה

1. טען את יחידת הרדמה עם isoflurane. מלאו את 10 מ"ל מזרק זכוכית חזק גז עם isoflurane. הימנע החדרת בועות אוויר. חברו את המזרק כניסת נוזל עם צינורות סיפקה ולהעביר את דחפן קדימה עד שהנוזלים בצינור המחבר הוא בעליל רק עומד להיכנס מאדה.
   הערה: אין לאחסן isoflurane בתוך המזרק כאשר אינו בשימוש.
2. להרדים חיות עם isoflurane בתא אינדוקציה, עם זרימת אוויר שמרו על כ 400 - 500 מ"ל / דקה ואת הריכוז של isoflurane ב -3.5%.
   הערה: היחידה לא תפעל ללא זרימת אוויר.
3. לאחר החיות ישנות, סובב את הברזלים על יחידת ההרדמה לניתוב גז isoflurane אל יצירת המסכה. בדוק כי פיסת המסכה היא שלמים כדי למנוע דליפה של גז. יכול להישמר Airflow ב 400 מ"ל / דקה, alternaבקנייה ירד ל 200 מ"ל / דקה. צמצום הריכוזיות isoflurane ל -2.6%.
   הערה: ניתן להגדיל אפקט הרדמה ו / או ירידה על ידי התאמת קצב הזרימה.

4. זריקות BCG ושחזור

1. ראייה לאשר ולבצע בדיקות כגון בדיקת רפלקס קמצוץ בוהן לברר עכברים כי הם משותקים / ישנה על פיסת מסכת isoflurane לפני ביצוע זריקות.
2. לחסן את השודד האחורי, 1 x 10 ⁶ יחידות מושבה להרכיב של Mycobacterium בוביס Bacille Calmette-גרן (BCG) ב 30 μl של PBS באמצעות מזרק מצויד במחט 29 G x ½ אינץ '.
   הערה: הדור של מניות mycobacterial מתואר בקצרה בתיאור המקורי של הליך זה ^3, ובפירוט משמעותי במקומות אחרים ^6. BCG הוא גם זמין ממקורות מסחריים. החוקרים ממליצים BCG להיות sonicated דופק או עברו מזרק לשבש גושים לפני inoculati שלהעל לעכברים. BCG הוא חזר כאן כמו גירויים מיקרוביאלי נתון התעסוקה שלה בתיאור המקורי של פרוטוקול זה ³ אבל המחברים בהחלט לעודד בדיקה של גירויים חיידקים אחרים.
3. בצע בתהליך הזהה לזה שתואר לעיל עבור ההזרקה של PBS לעכברים שליטים.
4. צג חיות לאחר זריקות כדי לאשר התאוששות מההרדמה מוצלחת שחיות יכולות לפרנס את עצמם על השודד המוזרק, אחורי.

5. זריקות CFSE

1. הכנת CFSE עבור זריקות:
   1. להפשיר בקבוקון של 5 מניות פתרון מ"מ CFSE מ -80 מעלות צלזיוס. לדלל את פי 10 CFSE ב PBS. Resuspend הפתרון ביסודיות לפני מילוי המזרק כהכנה להזרקה.
2. הזרקת ושחזור CFSE:
   1. חזור על התהליך עבור הרדמה חיות בסעיף 3. להזריק 20 μl של 0.5 מ"מ CFSE ב שודד דרכים האחוריות שבעבר קיבל BCG או PBS.
      הערה: הזרקה של CFSE צריכה להתבצע יום לפני (24 שעות) המועד המתוכנן הקרבה.

הסרת 6. כירורגים של popliteal לימפה צומת (PLN)

הערה: שימוש מכשירי ניתוח עיקור הטיהור חזרה שלהם באתנול 70% מעודדים לאורך שלב זה.

1. להרדים את העכברים. תרסיס החיה עם אתנול 70%. צמד החיה בעמדת הגב, על קרש חיתוך.
   הערה: המחברים יכולים להמליץ ​​המתת חסד באמצעות פריקת צוואר רחם.
2. בזהירות לעשות חתך אנכי בירך האחורית. שרירים ושומן נקה באמצעות מספריים פינצטה לחשוף וכתוצאה מכך שיחתוך את PLN ממוקם עמוק בתוך כיס שומן, בשקע הברך.
3. מעבירים את PLN 0.5 מ"ל סטרילי PBS, על קרח.

7. דור של השעיה תא בודד מתוך PLN

1. Homogenize PLN דרך Plac מסננת תא 70 מיקרוןאד בשנת א-צלחת גם 6 המכיל 5 מ"ל PBS או התא המופעל הקרינה מיון (FACS) חיץ (PBS המכיל 2% נסיוב עגל עוברית (FCS), 5 מ"מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA), ו אזיד הנתרן 1 מ"מ). Homogenize דרך מסננת בעזרת קצה האחורי של מזרק 3 מ"ל.
   הערה: אזיד הנתרן הוא רעיל, יש לטפל בזהירות.
2. שטפו את המסננת עם 5 מ"ל אחר של חיץ PBS או FACS, לאסוף את החומר בתוך שפופרת 15 מ"ל ו גלולה התאים ב 277 XG (1,200 סל"ד, R = 172 מ"מ) במשך 5 דקות, 4 ° C. לחלופין, homogenize pLNs ישירות צינורות microcentrifuge באמצעות homogenizers פוליפרופילן.
3. בהתבסס על גודל גלולה, resuspend ההשעיה PLN ב נפח מתאים של PBS או חיץ FACS, למשל, 200 - 1,000 μl. השתמש קאמרי ספירה לכמת את המספר הסלולרי הכולל המתקבל בכל השעית LN. השתמש trypan כחול להוציא תאים מתים / גוסס.

8. תא מכתים cytometry זרימה

1. Transfer 1 - 10 x 10 ⁶ תאים עד 5 מ"ל מסביב לתחתית צינורות קלקר. לשטוף עם חיץ FACS, גלולה ידי צנטריפוגה ב 277 XG (1,200 סל"ד, R = 172 מ"מ) במשך 5 דקות, 4 ° C.
2. בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 50 - 100 μl של קוקטייל של נוגדנים (ראה תאים דנדריטים [DC] סמנים המשמשים מכתים השטח, לוח חומרים) המכיל 0.5 - 1 מיקרוגרם של אנטי עכבר CD16 / CD32 (לחסום Fc בתיווך נוקבים אינטראקציות) במאגר FACS עבור 30 - 45 דקות, על קרח. הגן על דגימות מן האור.
3. לאחר דגירה, לשטוף תאים עם FACS חיץ גלולה ידי צנטריפוגה ב 277 XG (1,200 סל"ד, R = 172 מ"מ) במשך 5 דקות, 4 ° C.
4. Resuspend התאים 50 - 100 μl של חיץ FACS. רוכש את הנתונים על cytometer זרימה ^7-10.
   הערה: לקבלה לביקורות מצוינות על זרימת cytometry אנחנו מפנים את הקורא את הפרסומים הבאים כי ממסר הוא מידע תיאורטי ומעשי על שיטה זו.

תוצאות

את assay ההגירה המבוססת CFSE (איור 1) שמשה יחד עם cytometry זרימה כדי לזהות ולאפיין את תאי CFSE שכותרתו המופיעים PLN לאחר BCG הזיהום שודד הדרכים. חלק גדול של תיוג CFSE של PLN נמצא על MHC-II ^גבוה CD11c ^{+ /} תאי ^נמוך (איור 2 א), עולה בקנה אחד עם DCs העור אשר היגרו העור DLN ^11. הן תדירות והמספר הכולל של CFSE שכותרתו, MHC-II ^גבוה CD11c ^{+ /} תאים ^נמוך גדל ב pLNs מעכברים נגועים BCG בהשוואה לקבוצת הביקורת מוזרק PBS (איור 2 ב-ג), דבר המצביע על כך BCG משפר את העברת אלה תאים אל DLN. מאז הגירת אמצעי assay זה במהלך תקופה של 24 שעות, ניתן היה לקבוע כי DCs העור עדיין נכנס הזיהום 5 ימים לאחר DLN (איור 2 ג). זה מרחיב הגירה DC ​​במודל הנוכחי הרבה מעבר ציר הזמן עבור activati ​​הראשוניתעל תאי T ⁺ CD4 אנטיגן ספציפי של PLN ^3. יתר על כן, DCs עור הנודד מבטאי רמות גבוהות של CD80 מולקולות גירוי שיתוף CD86 (איור 2 ד). זה עולה בקנה אחד עם תצפיות קודמות מתרבויות העור explant ו FITC עור צביעת ^11, תומכות הרעיון כי DCs הנודדת הם תאים מופעלים. חשוב לציין, היא DCs LN-תושב (MHC-II ⁺ CD11c תאים ^{גבוהים)} ו DCs plasmacytoid (MHC-II ^נמוך CD11c ^נמוך PDCA-1 ⁺ תאים), אשר נכנסים LNs מווסת דרך venules הגבוהה אנדותל ולא lymphatics מביא ^12, שבו שלילי CFSE (איור 2EF), דבר המצביע כי אכן תיוג CFSE התרחש בעיקר שודד הדרכים.

בהתחשב בכך MHC-II ^גבוה CD11c ^{+ /} תאים ^נמוכים מייצגים לא אחד אלא תת-אוכלוסיות מרובות DC ^13, סמני המשטח הנוספים CD103, EpCAM (CD326) ו CD11b נכללו בלוח מכתים הנוגדן משמש לגילוי cytometric הזרימה (לוח חומרים) כדי להמשיך לאפיין את אוכלוסיית DCs הנודדת (איור 3). בעשותו כן, תאים ^גבוהים תת-אוכלוסייה של EpCAM ^{הנמוכים} CD11b זוהתה משנה DC עור הנודד העיקרי בתגובה לזיהום BCG (איור 3).

נתוני התזרים cytometric המוצג כאן נרכשו על cytometer זרימה מצויד 4 לייזרים (488, 532, 640 ו 405 ננומטר). הנתונים נותחו באמצעות תוכנת ניתוח התא. Cytometers זרימה רב צבע שונה מזו המצוינת לוח חומרים יכול להיות מועסק על זיהוי מוצלח של סמנים המוזכרים המחקרים שהוזכרו לעיל או גילוי סמנים אחרים, על סוגי תאים אחרים לצורך העניין. בשביל הפרוטוקול כפי שיתואר בהמשך, המסוגלת cytometer לאתר 6 fluorochromes שונים הוא necessary. חשוב לציין כי השיבוטים לכל נוגדן משמשים מפורטים (חומרי טבלה). הבחירה של המצומד fluorochrome צריכה להיחשב זו יכולה להיות תלויה לייזרי ערוצי גילוי על הזרימה cytometer זמין. באופן דומה, נוגדנים צריכים להיות טיטרציה לקבוע את הדילולים המתאימים ביותר עבור מכתים.

תדרי אוכלוסין BCG- דגימות מוזרקות PBS על גרף, והשתמשו יחד עם ספירת תאים הכוללות לחשב במספרים מוחלטים של מוגדר, תת מגודרת של DCs. המשמעות של השוני באמצעים לקבץ נתונים נותח על ידי מבחן רח 'סטודנטים או ANOVA ובמידת הצורך, עם ניתוק של p <0.05. חריגים לא נכללו בניתוח להלן גרובס של מבחן עבור יוצאי דופן.

מתאר באיור 1.: זיהום שודד BCGדגם ו CFSE המבוסס Assay הגירה. BCG הוא מחוסן ב שודד הדרכים האחוריות של עכברי C57BL / 6. בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה, ו -24 שעות לפני ההקרבה, CFSE fluorochrome מוזרק באותו שודד כי בעבר קיבל BCG. הייבוש, הבלוטה לימפה popliteal מופרדת CFSE שכותרתו בתאים בעלי cytometry זרימה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. DCs נודדות העור הם אוכלוסייה סרן Relocating אל זיהום DLN לאחר BCG שודד. C57BL / 6 עכברים נדבקו 1 x 10 ⁶ CFUs של BCG ב שודד דרכים. עשרים וארבע שעות לפני ההקרבה, חיות הוזרקו 0.5 מ"מ CFSE באותו שודד. LNs popliteal נבצרו, הומוגנילתוך תא בודד השעיות נתונות cytometry זרימה. עבור מדידות שנעשו 1 יום לאחר BCG, CFSE הוזרק 2hr לאחר BCG. (A ו- B) מגרש זברה מראה ביטוי עיקרי של CFSE על MHCII ^גבוהה CD11c ^{+ /} תאים ^נמוכים ב BCG-ניקוז PLN 3 ימים לאחר ההדבקה. תדירות (C) ומספר הכולל של CFSE שכותרתו MHCII ^הגבוה CD11c ^{+ /} תאים ^נמוכים PLN מ BCG- ועכברים מוזרקים PBS על גרף, בנקודות זמן שונות. (ד) Mean הקרינה בעוצמה (MFI) עבור CD80 ו CD86 נקבע על CFSE ⁺ ו CFSE ^נג MHC-II ^גבוה CD11c ^{+ / נמוך} DCs העור PLN 3 ימים לאחר ההדבקה BCG. (E) ביטוי CFSE בתוך DCs העור (MHC-II ^גבוה CD11c ^{+ / נמוך),} LN-תושב DCS (MHC-II ⁺ CD11c ^גבוהה) ו- (F) DCs plasmacytoid (CD11c ^נמוך MHC-II ^נמוך PDCA-1 ⁺⁾נקבע על ידי זרימת cytometry 3 ימים לאחר BCG. עבור כל ניסוי, לפחות 5 עכברים שמשו קבוצות נגועות BCG ו -3 עבור פקדים מוזרקים PBS. ברים מצביעים סטיית התקן של הממוצע. מספר כולל של תאים שכותרתו CFSE בתוך כל קבוצת משנה ניתן Bollampalli ואח, PLoS Pathog 2015, 11:. E1005206 ^3. * מציין הבדל מובהק סטטיסטית בין בקרות BCG נגועים ו PBS. אחד משני ניסויים בלתי תלויים מוצגים. האיור המותאם Bollampalli ואח, PLoS Pathog 2015, 11:... E1005206 ^3, באישור המו"ל אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

EpCAM האיור 3. DCs ^{גבוה הנמוך} CD11b הוא העור הראש Traffick בתת קבוצת DCing אל זיהום BCG שודד לאחר DLN. C57BL / 6 עכברים הוזרקו BCG ו CFSE כמו באיור 2. (א) מגרשים זברה מראה gating האסטרטגיה המועסקים (הפאנל העליון) ותדירות CFSE ⁺ תאים בתוך כל, מוגדר משנה ב שונות נקודות זמן לאחר הדבקת BCG (לוחות למטה). תדרים בתוך כל קבוצת משנה עשוי להשתנות תלוי בנקודת זמן לאחר ההדבקה. לאחר 3 ימים של BCG אפשר לצפות למצוא כ תאי 0.2% MHC-II ^גבוה CD11c ^{+ / נמוכים} בין כל תאי LN. מתוכם, כ -6% הם CD103 ⁺ תאים. עבור תת נמצא בתוך שער MHC-II ^גבוה CD103 ^{השלילי,} אפשר למצוא כ -42% CD11b תאים ^{נמוכים הגבוה} EpCAM, 27% CD11b תאים ^{נמוכים הנמוך} EpCAM ו -7 LCS%. (ב) המספר הכולל של עבודות CFSE ⁺ תאים בתוך כל, משנה מוגדר בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה BCG מוצג. עבור כל experimeNT, לפחות 5 עכברים שמשו קבוצות נגועות BCG ו -3 עבור פקדי PBS. ברים מצביעים סטיית התקן של הממוצע. * מציין מובהקים סטטיסטי הבדלים בהשוואה לביקורות מוזרקות PBS. אחד שלושה ניסויים בלתי תלויים מוצגים. איור מחדש מודפס Bollampalli ואח, PLoS Pathog 2015, 11:.. E1005206 ^3, באישור המו"ל אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

noDCs הם תאים מיוחדים מציגי אנטיגן שיכול להגיב לאתגר מיקרוביאלי על משטחי גוף באמצעות רכישת אנטיגן מיקרוביאליים מעבר ל DLN באמצעות lymphatics. יש, DCS להציג אנטיגן זה לתא T באופן שמניע תגובות תאי T עיקריות. תהליך ההגירה DC ​​מרקמות כדי DLN לכן מאוד חשוב להבנת תגובה T-cell פרודוקטיבי היא יזמה. שיטות למדוד הגירה DC ​​ולכן יש מאוד שימושי התגלגלות האמור לעיל.

במודל של עכברים הועסק ללמוד גירת עור DC ל DLN בעקבות זיהום עם BCG, חיסון חי כי מוזרק קליני בעור. בתור, BCG מוזרק שודד הדרכים האחוריות לחקות מסלול עורית זו של חיסון. Assay פשוט פותח וכתוצאה מכך משולב מודל זה לחקור את ההגירה של תת-אוכלוסיות עור DC מאתר חיסון BCG בעור השודד אל PLN הניקוז. רלי פרוטוקול זהes על הזרקת CFSE fluorochrome לאותו שודד כי בעבר קיבל BCG ואז לבודד את hr 24 PLN ניקוז מאוחר יותר בכדי לנתח את נוכחותם של תאים שכותרתו CFSE ידי cytometry הזרימה. למרות שלא כמתואר בפרוטוקול, LNs מהגדרה זה יכול גם להיות מוכן לניתוח על ידי מיקרוסקופיה confocal, ללמוד תהליכי הגירה כגון המיצוב של תאים נודדים ב LN ^3. יתר על כן, תוצאות דומות על הגירה DC העור BCG-מופעלות התקבלו באמצעות שני BCG פסטר 1173P2 ³ ו BCG SSI 1331 ^14.

CFSE הוא נפוץ לתייג תאים במבחנה כדי לעקוב אחר תאים שכותרתו כגון in vivo לאחר העברות תא ^15. בפרוטוקול הנוכחי לעומת זאת, הוא שימש לתייג ישירות תאי עור באתרו. הבסיס המולקולרי של תיוג CFSE דומה FITC, שהוא גם צבע פלואורסצנטי אמין-reactive. CFSE הוא העדיף זאת על FITC עבור נטיה כפי שהוא creאטס אג"ח carboxamide יציב מאוד ^16. יתר על כן, CFSE מאוד קרום חדיר מפזר פסיבי לתאים. ברגע שהיה בפנים, הוא יוצר אמין תאי (ניאון) conjugates שנשמרות בתא שכותרתו ^15.

את assay ההגירה מבוססת CFSE שפותחה על ידי המחברים מאפשרת זיהוי של תאי מעבר מן עור DLN בתוך תקופה של 24 שעות בתגובת BCG. בכך הוא מודד הגירה חריפה במהלך פרק זמן מוגדר מאפשר לחקור את היכולת של שונה, מוזרק גירויים כדי לעורר הגירה. assay זה שונה הטכניקה הקלסית של ציור עור FITC, אשר מודדת אירוע הגירה המצטבר מופעל על ידי יישום עורית, אקטואלי של סוכן קשר-רגישות. לפיכך, assay ההגירה המבוססת CFSE יכול להיות מועסק על מנת לזהות DCs עור נודד או תאים אחרים ביתם של PLN לאחר ההזרקה של חיידקים, מוצרי חיידקים או גירויים דלקתיים אחרים footpad. ואכן, הוא נויטרופילים γ: δ תאי T הוכחו להעביר מעור כדי DLN בתגובת BCG ^17,18. למעשה, assay שמש לאחרונה בסביבת שיתוף זיהום להראות כי זיהום נמטודות-מקומי במעי יכול להשתיק BCG-מופעלת גירת עור DC ל ^-14 DLN.

הגירה DC מוערכת לעתים קרובות בין 24 עד 72 שעות בציור העור FITC מאז FITC שכותרתו DCs קשה לזהות 4 עד 5 ימים לאחר צביעת ^19. הפסד של האות CFSE על DCs שכותרתו אינה מהווה בעיה ב assay המוצג כאן מאז ניתוח של הגירה הוגבל ל -24 שעות; הסיבה מאחורי זה להיות כי המחברים רצו ללמוד במיוחד "לילה" אירועי הגירה. אחרים מעוניינים assay זה עם זאת מעודדים לחקור קודם לכן או אפילו מאוחר יותר נקודות זמן למעקב מבוסס CFSE. יתר על כן, מאז CFSE הוא הציג בזריקה זה יכול להינתן בכל עת מוגדרת. גמישות זו אפשרה אuthors להעריך הגירה DC בין יום 5 ו -6 לאחר ההדבקה BCG (איור 2 ג) ^3. הזרקת CFSE שעלול להגביל את סוגי התאים נגישים באתרו תגובת התיוג. עבור תאים למשל לנגרהנס (LCS), אשר הם DCs הנמצא בשכבה העליונה של העור, האפידרמיס, להעביר גרוע בתגובת BCG ב assay ההגירה המבוססת CFSE (איור 3) ^3. עם זאת, במהלך הציור העור FITC, DCS מיקומו של הדרמיס, השכבה שמתחת לאפידרמיס, מסומנים בקלות ולנדוד אל DLN מהר יותר ^20,21 LCS. הדבר מצביע על כך תאים יכולים להיות fluorochrome שכותרתו ללא צורך בהכרח למקם על השכבה של העור שבו פתרון התיוג מוחל.

כמודל זיהום BCG, אוזן העכבר מציעה מסלול תוך-עורית בתום לב של חיסון כי הוא יותר בקנה אחד עם הממשל הקליני של BCG כחיסון שחפת. Foהזרקת otpad מצד שני, סביר להניח שילוב של intradermal ומסלולים תת עורית. עם זאת, זה דורש מיומנות והכשרה נכונה reproducibly לספק BCG אל הדרמיס ^22, כך בפרקטיקה הקלינית זה לא תמיד תינתן באמת intradermal אלא תת עורית או שילוב של שניהם. כאתר חיסון שודד הדרכים אכן יש שני יתרונות ברורים מאוד על האוזן שצריכה להזכיר. ראשית, התגובה החיסונית מרוכזת אל PLN ניקוז לאחר הזרקה שודדת מה שמסייע בין שאר הבחינה של תגובות. מחברי הדו"ח הזה מצאו את PLN להיות LN הראשונה והעיקרית ניקוז שודד דרכים ^3. אחרים הציעו ניקוז הפיצול בין LNs popliteal ו subiliac לאחר ההזרקה של אוון של כחול ^23. עם זאת, בכל קשור לאוזן, יש יותר מאחד האוזן DLN בעכברים אלה לא יכולים להיות קבועים נוכחיים או קלים לאתר ^24. הלה בבירור מציג liability במחקרים המבקשים לחקור תגובות DLN. שנית, כמויות גדולות יותר ניתן מחוסנות לתוך שודד הדרכים (10 - 50 μl) בהשוואה לאוזן. זה בתורו הוא ממזער ההתחייבות של החדרה לשינויים גדולים זרימת הלימפה ושל הצורך לעבוד עם כרכי הזרקה קטנים מאוד, וזה כשלעצמו בעיה כשמדובר ייחס כמויות גדולות של mycobacteria. באוזן שבו כרכים הזרקת צריך להיות קטן (1-10 μl), אפילו 5 μl רשאי לשנות זרימת הלימפה ואפשרות לכפות כמות גדולה של החומר המוזרק ישירות לתוך DLN בצורה בלתי מבוקרת. לכן חשוב לתת דין וחשבון על כרכי הזרקה. זה חשוב במיוחד בניסויים פונים התרומה של תאי ferrying לחיידקי LN. במודל שודד BCG, כמה BCG אולי הגיע DLN בהעדר תחבורה הסלולר. זה מבוסס על תצפיות כי עדיין אפשר לזהות BCG ב DLN של עכברים שבו נדידת תאים ממרגלותכרית היה ablated לחלוטין על ידי זריקה מקומית של שעלת רעלן ^3. בין אם יש בכך כדי להצביע כי BCG יכול לגשת lymphatics ישירות ולהגיע DLN באופן תא ללא באמת עדיין לא נקבע מאז זה לא ניתן לשלול כי mycobacteria במקרה זה שבו ניתן גישת lymphatics בכוח של הנפח המוזרק.

שיקול מעשי עבור חיסונים באוזן או השודד הוא שבעלי חיים צריכים להיות משותקים מספקים זריקות להתבצע כראוי ובאופן לשחזור. גז Isoflurane מתואר בפרוטוקול הנוכחי כשיטה לריסון בעלי חיים כהכנת זריקות שודדות. בפעמי האינדוקציה והתאוששות המהירות יחסית עבור הרדמה בתיווך isoflurane לעשות את זה שיטה פופולרית, אבל דומה סוכני הרדמה אחרים, זה משפיע פיזיולוגיה, שעלול להפריע תוצאות ניסוי ^25. ואכן, הוא הרדמה נדיפים בזריקות להפחית את זרימת הלימפה על ידי ביטולתנועות השרירים הרצוניים, הפחתת טונוס השרירים, ולהפחית התכווצות lymphangion ^26. יתר על כן, הפחתה של 5 לקפל הגירת DLN של DCs הועברה adoptively ב שודד הדרכים דווחה חיות הרדימו ^27. לאור האמור לעיל, ומאחר כיצד לטפל בדבר לפני הרדמה צפויים לגרום ללחץ יותר חיות מאשר ההזרקה עצמה, שהוא גם מהיר לנהל ואינו דורש צעד התאוששות, אפשרות לרסן את החיה כראוי ללא הרדמה צריך תתחשב. עצר עכבר המותאם אישית עבור זריקות שודדות, שבו החיה ניתן להביא במהירות למצב עצמו משותק ואינה מחוסן ב שודד הדרכים בתוך 30 עד 40 שניות יהיה אידיאלי להזריק את העכבר השודד האחורי מבלי לשנות היבטים אחרים של הפיסיולוגיה שלה בתהליך , ו יהיה מאוד שימושי במחקרים פונים נדידת תאים באמצעות lymphatics.

לסיכום, הדו"ח הזהמדגיש פרוטוקול רומן למעקב DCs העור אגב הניוד שלהם DLN באמצעות assay מנטרת הגירה במהלך חלון 24 שעות מוגדרות. Assay הגירה CFSE מבוססי זה מאפשר זיהוי וניתוח של תאים נודדים על ידי cytometry זרימה, כמפורט כאן, כמו גם על ידי מיקרוסקופ confocal ^3. הוא מספק פלטפורמה גמישה ללימוד למגוון של גירויים מוזרקים ויכולתי לעורר גירת DC, וחשוב מכך, יכול להיות מועסק על מנת לעקוב אחר לא רק DCs אלא גם באוכלוסיות אחרות נעו עור DLN במהלך הגדרות ניסויים שונות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Baxter	1001936060
5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	Invitrogen	C1157
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F7524
Bacille Calmette-Guérin (BCG)			strain Pasteur, in house
Trypan blue solution	Sigma	T8154
EDTA			In house
Sodium azide	Sigma	S2002
PBS			In house
Filtered water			In house
BD Plastipak 3 ml syringe	BD Medical Surgical Systems	309658	alternative: 5 ml syringe
6 well plates	TPP	92006
15 ml centrifuge tubes	TPP	91015	Polypropylene
5 ml round bottom tubes	BD Falcon	3272948	Polystyrene
Univentor  400 anaesthesia unit	Univentor	8323001
Monojet 3/10ml syringe	Medicarrier	8881511144	29 G x 1/2 in.
Sterile filter unit	TPP	99500	PES membrane
EPPI-Pistill homogenizer	Schuett biotech	3.200 512	Polypropylene
Allegra X-30R centrifuge	Beckman Coulter	B01145
Bürker counting chamber	VWR	631-0920
0.5 ml screw cap microtube	Sarstedt	72.730	Polypropylene
1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tube	VWR	700-5239	Polypropylene
70 micron cell strainers	VWR	734-0003
BD LSR-II flow cytometer, operated with FACSDiva software	BD Biosciences		Discontinued. Other Flow cytometers available, minimum detection of 6 fluorochromes needed
FlowJo cell analysis software	Tree Star
Antibody	Clone	Company
Antibodies
MHC-II I-A/I-E	M5/114.15.2	BD Biosciences
CD11b	M1/70	BD Biosciences
CD11c	HL3	BD Biosciences
CD16/CD32 (Fc-block)	2.4G2	BD Biosciences
CD326/EpCAM	G8.8	Biolegend
CD103	2E7	Biolegend
CD80	16-10A1	Biolegend
CD86	GL-1	Biolegend