Ein CFSE-basierten Assay die Migration von murinen Haut Dendritischen Zellen in Lymphknoten während der Infektion zu studieren mit<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bazillus Calmette-Guérin

Zusammenfassung

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Guérin.

Zusammenfassung

Dendritische Zellen (DCs) sind wichtig für die Immunantwort initiieren, teilweise durch ihre Fähigkeit und Shuttle-Antigen zu den drainierenden Lymphknoten (DLN) zu erwerben. Die Mobilisierung von DCs zur DLN ist komplex und bleibt vollständig während der Infektion aufgeklärt werden. Hierin beschrieben ist die Verwendung eines innovativen, einfachen Test, der 5- und 6-Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester auf dem Fluorochrom beruht (CFSE) während der Fußballen Infektion mit Mycobacterium bovis Bazillus Calmette-Guérin (BCG) in C57BL die Migration von DCs zu verfolgen / 6-Mäuse. Dieser Test ermöglicht die Charakterisierung von Haut DC-Subpopulationen, die auf die Trockenlegung, poplitea LN in Reaktion auf BCG aktiv verlagern. Dieses Protokoll stammt aus einer BCG-Modell, bei dem wandernden Haut DCs wurden mittels Durchflusszytometrie identifiziert. Der Test ist liebenswürdig dem Studium und der Identifizierung von DCs oder anderen Zellen, die Heimat der poplitealen LN nach der Inokulation von Mikroben, deren Metaboliten oder andere entzündlicheStimuli in den Fußballen und folglich Faktoren zu untersuchen, die die Migration dieser Zellen zu regulieren.

Einleitung

DCs in Körperoberflächen lokalisiert spüren Mikroben oder ihre Produkte, und so mobilisieren über Lymphgefäße zur Trockenlegung LN (DLN) ^1,2 dabei. Diese Verlagerung ist für den Transport von mikrobiellen Antigen zur DLN und die daraus folgende Priming von Immunantworten gegen den eindringenden Mikrobe benötigt. Tatsächlich Blockade oder des Versagens von DCs aus dem infizierten Gewebe wandern in die DLN die Antwort T-Zell stumm geschaltet ^3-5. Dementsprechend entwickelt Assays Migration auf Einzelzellebene zu verfolgen sind nützlich zusprechen Migrationsfunktion zu einem gegebenen DC Teilmenge zu helfen.

Es gibt eine große Menge an Daten über die Inanspruchnahme von Haut DCs zur DLN. Letztere Konten für einen Großteil des Wissens über DC Migration von entzündeten oder infizierten Websites ^2. Dies ist nicht verwunderlich, da die Haut eine große Population von DCs beherbergt und ist eine gut zugängliche Fläche für Experimente im Labor Maus. Verschiedene Techniken so entwickelt worden, zu beurteilendie Migration von murinen DCs von der Haut zu der DLN ^2. FITC Haut Malerei ist bei weitem die am häufigsten verwendete Ansatz. In diesem Assay das Fluorochrom Fluorescein-5-isothiocyanat (FITC) wird in einer Mischung mit Aceton und einem Kontaktreiz hergestellt. Dieser Cocktail wird auf enthaarte oder rasierten Haut aufgetragen und die Anreicherung von FITC-markierten Zellen wird wiederum in der DLN analysiert. Migration kann auch durch Einspritzen der Haut mit Fluorochrom-markierten Nano- oder Mikropartikel untersucht werden, was die Verfolgung von phagozytischen Zellen ermöglicht, die die Leuchtstoffpartikel in die Haut internalisiert haben. Lymphgefäße können auch direkt eine Kanüle eingeführt werden, um die Migration DCs aus Lymphe extrahieren. Dies ist jedoch technisch anspruchsvoll, vor allem bei Mäusen. Die Anzahl der DCs für eine nachfolgende Analyse erhalten ist auch ein begrenzender Faktor.

Trotz vieler früheren Studien über die Haut DC Migration besteht nach wie vor ein Mangel an Informationen bezüglich der Haut DC Mobilisierung DLN folgende vacciNation mit Bazillus Calmette-Guérin (BCG), die lebenden, abgeschwächten Stamm von Mycobacterium bovis verwendet , um gegen M. impfen Tuberkulose. BCG wird in der Haut inokuliert, eine begrenzte Infektion verursacht, die eine T-Helfer-Zellen-Typ-1-Antwort auslöst. Sowohl die DC-Unterpopulationen, die von dem BCG-infizierten Haut und die Faktoren, die zur DLN mobilisieren, die ihre Migration während dieses Prozesses regulieren, sind nicht vollständig verstanden. In Anbetracht der obigen, ein einfaches , aber neues Verfahren entwickelt wurde , in dem das Fluorochrom 5- und 6-Carboxyfluorescein - Diacetat Succinimidylester (CFSE) in situ eingespritzt wird , ³ die Migration von DCs in die DLN zu verfolgen. C57BL / 6-Mäuse in den hinteren Fußballen mit einem Inokulum von BCG und dem Tag vor der Tötung injiziert, die Tiere in der gleichen Fußballen mit einer hohen Konzentration an CFSE injiziert. Vierundzwanzig Stunden später die Tiere getötet, und die poplitealen Entwässern LN (PLN) entfernt und für die Durchflusszytometrie vorbereitet. Dieser Test ermöglicht die identification von Zellen , die über Nacht von den Fußballen Haut zur DLN (Abbildung 1) migrieren.

Darüber hinaus Gen-Targeting-Mäuse verwendet werden Faktoren für Zellen erforderlich zu identifizieren, um die DLN zu mobilisieren. Unter Verwendung dieses Tests haben die Autoren dieses Berichts zuvor festgestellt , dass EpCAM ^niedrige CD11b ^hoher Migrations Haut DCs Transport BCG auf die DLN in einem Prozess geregelt durch Interleukin-1 - Rezeptor und dem intrazellulären Adaptermolekül MyD88 ^3. Das Protokoll für dieses CFSE-basierte Migrationstest, der durch Bollampalli et al aus dem oben genannten Bericht stammt. ³ , wo die Durchflusszytometrie verwendet wurde , um wandernde Haut DCs erkennen und zu analysieren, wird hier beschrieben. Die Vor- und Nachteile dieses Assays werden diskutiert.

Protokoll

Hinweis: C67BL / 6-Mäuse für die Experimente in diesem Manuskript gezeigt verwendet wurden. Diese Tiere waren Haus unter bestimmten erregerfreien Bedingungen bei der MTC Tieranlage, Karolinska Institutet, Stockholm, Schweden. Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien und den Richtlinien des schwedischen Landwirtschaftsdurchgeführt, die schwedische Tierschutzbehörde und Karolinska Institutet. Die Experimente wurden von der Stockholm Nord Tierethikrates genehmigt.

1. Herstellung von CFSE Stocks und Lagerung

1. Bereiten Sie eine 5 mM Lager von 5- und 6-Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFSE) in Dimethylsulfoxid. Wirbel. Dispense 100 ul Aliquots in sterile 0,5 ml Schraubdeckel Mikro-Röhrchen. Shop Aliquots bei -80 ° C.

2. Mäuse

1. Verwenden Sie angeboren männliche oder weibliche Mäuse zwischen 8 und 12 Wochen alt sind. Sex- und altersangepassten Tiere werden bevorzugt. Achten Sie darauf, die erforderlichen Tier ethischen Genehmigungen are an Ort und Stelle vor Beginn der Experimente.

3. Immobilisierung von Tiere mit Isofluran Gas Anesthesia

1. Legen Sie das Anästhesiegerät mit Isofluran. Füllen Sie das 10 ml gasdichten Glasspritze mit Isofluran. Vermeiden Sie Luftblasen einzuführen. Verbinden Sie die Spritze und Flüssigkeitseinlass mit dem mitgelieferten Schlauch und den Schieber nach vorne bewegen, bis die Flüssigkeit in das Verbindungsrohr sichtbar gerade dabei ist, den Verdampfer zu betreten.
   HINWEIS: Bewahren Sie keine Isofluran in der Spritze, wenn sie nicht in Gebrauch ist.
2. Anästhesieren Tiere mit Isofluran in der Induktionskammer, mit einem Luftstrom bei ca. 400 gehalten - 500 ml / min und die Konzentration von Isofluran bei 3,5%.
   HINWEIS: Das Gerät wird nicht ohne Luftstrom betrieben werden.
3. Sobald die Tiere schlafen, drehen Sie den Hahn auf dem Anästhesiegerät die Isofluran-Gas zu der Maske Stück Weg. Überprüfen Sie, ob das Maskenteil intakt ist ein Austreten von Gas zu vermeiden. Luftstrom kann auf 400 ml / min, aufrechterhalten werden alternativ verringerte sich auf 200 ml / min. Reduzieren Sie Isofluran-Konzentration auf 2,6%.
   HINWEIS: Die anästhetische Wirkung kann durch Einstellen der Durchflussrate erhöht und / oder verringert werden.

4. BCG Injections und Erholung

1. Optisch bestätigen und Tests durchführen, wie der Zeh Prise Reflex-Test, dass Mäuse, um festzustellen, immobilisiert / schlafend auf dem Isofluran Maske Stück vor Injektionen durchgeführt wird.
2. Beimpfen in den hinteren Fußballen, 1 x 10 ⁶ koloniebildenden Einheiten von Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) in 30 ul PBS eine Spritze mit einer 29 G x ½ inch Nadel angebracht werden.
   HINWEIS: Die Erzeugung von Mykobakterien - Aktien ist in der ursprünglichen Beschreibung dieses Verfahrens ³ und im wesentlichen an anderer Stelle ausführlich ⁶ kurz beschrieben. BCG ist auch aus kommerziellen Quellen leicht erhältlich. Die Autoren empfehlen, dass BCG Puls-Ultraschall behandelt werden oder durch eine Spritze geleitet Klumpen vor seiner inoculati zu störenon in Mäuse. BCG wird wiederholt hier als mikrobielle Stimuli ³ seine Beschäftigung in der ursprünglichen Beschreibung dieses Protokolls gegeben , aber die Autoren sicherlich die Prüfung von anderen mikrobiellen Stimuli fördern.
3. Führen die gleiche oben beschriebene Verfahren für die Injektion von PBS in Kontrollmäusen.
4. Überwachen Tiere nach den Injektionen, dass die Erholung zu bestätigen aus der Narkose erfolgreich ist und dass die Tiere können sich auf dem injizierten, hinteren Fußballen unterstützen.

5. CFSE Injections

1. Herstellung von CFSE für Injektionszwecke:
   1. ein Fläschchen mit 5 mM CFSE Stammlösung von -80 ° C auftauen. Verdünnen Sie die CFSE 10-fach in PBS. Resuspendieren Sie die Lösung gründlich, bevor Sie die Spritze in der Vorbereitung für die Injektion zu füllen.
2. CFSE Injection and Recovery:
   1. Wiederholen Sie den Vorgang für die Tiere in Abschnitt 3. Inject 20 ul 0,5 mM CFSE in der hinteren Fußballen, die zuvor erhielt BCG oder PBS betäuben.
      Hinweis: Die Injektion von CFSE sollte am Tag vor der für das Opfer (24 h), um den geplanten Termin durchgeführt werden.

6. Die chirurgische Entfernung von Popliteal Lymph Node (ZL)

HINWEIS: Die Verwendung von sterilisierten chirurgischen Instrumenten und ihre wiederholten Dekontamination in 70% Ethanol werden in diesem Schritt gefördert werden.

1. Euthanize die Mäuse. Sprühen Sie das Tier mit 70% Ethanol. Pin das Tier in Rückenlage auf einer Dissektion Bord.
   HINWEIS: Die Autoren Euthanasie durch Genickbruch empfehlen kann.
2. machen Sie vorsichtig einen vertikalen Schnitt in der Hinter Oberschenkel. Klare Muskeln und Fett Schere und Pinzette folglich zu entlarven und die pLN befindet sich tief in der Fettbeutel, in der Kniekehle auszuschneiden.
3. Übertragen Sie die pLN bis 0,5 ml sterile PBS, auf Eis.

7. Erzeugung von Einzelzellsuspension von pLN

1. Homogenisieren pLN durch einen 70-Mikron-Sieb Zelle placed in einer 6-Well-Platte mit 5 ml PBS oder fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) Puffer (PBS, enthaltend 2% fötales Kälberserum (FCS), 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 1 mM Natriumazid). Homogenisieren durch das Sieb das hintere Ende einer 3 ml Spritze.
   HINWEIS: Natriumazid ist giftig und sollten mit Vorsicht behandelt werden.
2. Waschen Sie das Sieb mit weiteren 5 ml PBS oder FACS-Puffer, sammeln das Material in einem 15-ml-Röhrchen und Pellet die Zellen bei 277 × g (1200 rpm, R = 172 mm) für 5 min, 4 ° C. Alternativ homogenisieren PLNS direkt in Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen Homogenisatoren verwenden.
3. Bezogen auf die Pelletgröße, resuspendieren pLN Suspension in einem geeigneten Volumen von PBS oder FACS - Puffer, beispielsweise 200 - 1000 & mgr; l. Verwenden Sie eine Zählkammer die Gesamtzellzahl aus jeder LN Suspension erhalten zu quantifizieren. Verwenden Sie Trypanblau tot / sterbende Zellen auszuschließen.

8. Zellfärbung und Durchflusszytometrie

1. Transfer 1 - 10 x 10 ⁶ Zellen bis 5 ml Rundboden - Polystyrolröhrchen. Waschen mit FACS-Puffer und Pellet durch Zentrifugation bei 277 xg (1.200 rpm, R = 172 mm) für 5 min, 4 ° C.
2. Überstand verwerfen und das Pellet in 50 bis 100 & mgr; l Antikörper - Cocktail (siehe Dendritische Zelle [DC] Marker für die Oberflächenfärbung verwendet, Werkstoff - Tabelle) , die 0,5 bis 1 ug anti-Maus - CD16 / CD32 (zu blockieren unspezifische Fc-vermittelte Wechselwirkungen) in FACS-Puffer für 30 - 45 min, auf Eis. Schützen Proben aus Licht.
3. Nach der Inkubation, Waschen Zellen mit FACS-Puffer und Pellet durch Zentrifugation bei 277 xg (1.200 rpm, R = 172 mm) für 5 min, 4 ° C.
4. Die Zellen in 50 bis 100 & mgr; l FACS-Puffer. Erwerben von Daten auf einem Durchflusszytometer ^7-10.
   HINWEIS: Für hervorragende Bewertungen auf Durchflusszytometrie wir den Leser auf die folgenden Veröffentlichungen beziehen, die sowohl theoretische als auch praktische Informationen über diese Methode weiterzuleiten.

Ergebnisse

Die CFSE-basierte Migrationstest (Abbildung 1) wurde zusammen mit der Durchflusszytometrie verwendet , um die CFSE-markierten Zellen zu erkennen und zu charakterisieren , die in der pLN nach BCG - Infektion in den Fußballen erscheinen. Ein großer Teil des CFSE Kennzeichnung in der pLN auf MHC-II ^hoch und CD11c ^{+ / Low} - Zellen (2A), im Einklang mit der Haut DCs gefunden, die auf die Haut DLN ¹¹ gewandert sind. Sowohl die Häufigkeit und die Gesamtzahl der CFSE-markierten, MHC-II - ^Hoch CD11c ^{+ / low} - Zellen werden in PLNS von BCG-infizierten Mäusen erhöhte sich im Vergleich zu PBS-injizierten Kontrollen (2B-C), was darauf hindeutet , dass BCG die Verlagerung von diesen verbessert Zellen zur DLN. Da dieser Test misst die Migration während einer 24-Stunden - Zeitraum, war es möglich , dass die Haut DCs zu etablieren noch Eingabe der DLN 5 Tage nach der Infektion (Abbildung 2C). Dies erweitert DC Migration im aktuellen Modell weit über den Zeitplan für die anfängliche activatiauf der Antigen-spezifischen CD4 ⁺ T - Zellen in der pLN ^3. Ferner äußern wandernde Haut DCs erhöhte Werte von co-stimulierenden Molekülen CD80 und CD86 (2D). Dies steht im Einklang mit früheren Beobachtungen aus Hautexplantat Kulturen und FITC Haut Malerei ^11, unterstützen das Konzept , dass die Migrations DCs sind aktivierten Zellen. Wichtig ist , dass beide LN-resident DCs (MHC-II ⁺ CD11c ^hoch Zellen) und plasmazytoiden DCs (MHC-II ^niedrige CD11c ^niedrig PDCA-1 ⁺ Zellen), die entzündeten LNs durch hohe Venolen betreten und nicht die zuführenden Lymphgefäße ^12, wo negativ CFSE (Abbildung 2EF), was darauf hindeutet , dass in der Tat CFSE Kennzeichnung erfolgte vor allem in den Fußballen.

Da die MHC-II - ^Hoch CD11c ^{+ / low} Zellen repräsentieren nicht nur eine , sondern mehrere DC-Subpopulationen ^13, die zusätzlichen Oberflächenmarker CD103, EpCAM (CD326) und CD11b wurden in der Antikörper - Färbung Panel enthalten für den durchflusszytometrischen Nachweis (Werkstoff - Tabelle) verwendet , um die Population der wandernden DCs (Abbildung 3) zu charakterisieren. Dabei wird eine Subpopulation von EpCAM ^niedrigen CD11b ^hoch Zellen wurde als Hauptmigrations Haut DC Teilmenge als Reaktion auf BCG - Infektion (Abbildung 3) identifiziert.

Die durchflusszytometrischen Daten hier gezeigt wurde, auf einem Fluss erworben Zytometer mit 4 Lasern ausgestattet (488, 532, 640 und 405 nm). Die Daten wurden mit der Zellanalyse-Software analysiert. Andere Mehrfarben Durchflusszytometer als die spezifizierte einer in der Werkstoff - Tabelle kann für die erfolgreiche Erkennung der Markierungen in den obigen Studien oder der Nachweis von anderen Markern für diese Angelegenheit auf andere Zelltypen verwendet werden , erwähnt. Für das Protokoll hier beschrieben ist, ist ein Zytometer Lage 6 verschiedene Fluorochrome des Erfassens necessar. Wichtig ist , dass die Klone für jeden Antikörper verwendet angegeben (Werkstoff - Tabelle). Die Wahl des Fluorochrom-Konjugat muss berücksichtigt werden, da diese auf den Laser und Detektionskanäle auf dem Durchflusszytometer zur Verfügung abhängen kann. Ebenso müssen Antikörper die am besten geeigneten Verdünnungen für die Färbung zu bestimmen titriert werden.

Bevölkerung Frequenzen in BCG und PBS-injizierten Proben wurden graphisch dargestellt und zusammen mit der Gesamtzellzahl verwendet, um absolute Zahlen von definierten, gated Teilmengen von DCs berechnen. Die Bedeutung der Unterschiede in der Datengruppe Mittel wurde durch den Student 'st-Test oder ANOVA gegebenenfalls mit einem Cut-off von p <0,05 analysiert. Ausreißer wurden Ausreißer aus der Analyse folgende Grubbs 's Test ausgeschlossen.

Abbildung 1. Outline: BCG Footpad InfektionModell und CFSE-Based Migration Assay. BCG ist im hinteren Fußballen von C57BL / 6 - Mäuse inokuliert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion und 24 Stunden vor der Tötung wird das Fluorochrom CFSE in der gleichen Fußballen injiziert, die zuvor BCG erhalten. Die Trockenlegung wird poplitea Lymphknoten isoliert und CFSE-markierten durch Strömungs gekennzeichnet Zellen Zytometrie. Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Migratory Haut DCs sind eine wichtige Bevölkerung Relocating zur DLN Nach BCG Footpad Infektion. C57BL / 6 - Mäuse wurden infiziert mit 1 × 10 ⁶ KBE von BCG in den Fußballen. Vierundzwanzig Stunden vor der Tötung wurden die Tiere mit 0,5 mM CFSE in der gleichen Fußballen. Popliteal LNs wurden geerntet, homogenisiertin Einzelzell-Suspensionen und Zytometrie unterzogen zu fließen. Für 1 Tag durchgeführten Messungen nach BCG wurde CFSE 2hr nach BCG injiziert. (A und B) Zebra Plots zeigt vorherrschende Expression von CFSE auf MHCII ^hoch und CD11c ^{+ / low} Zellen in pLN 3 Tage nach der Infektion BCG-Entleerung. (C) Frequenz und Gesamtzahl der CFSE-markierten MHCII ^hohe CD11c ^{+ / low} Zellen in pLN von BCG und PBS-injizierten Mäuse wurden zu verschiedenen Zeitpunkten grafisch dargestellt. (D) mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für CD80 und CD86 wurde auf CFSE bestimmt ⁺ und CFSE ^neg MHC-II - ^Hoch CD11c ^{+ / low} Haut DCs in pLN 3 Tage nach der Infektion BCG. (E) CFSE Expression innerhalb Haut DCs (MHC-II ^hoch CD11c ^{+ / niedrig),} LN-resident DCs (MHC-II ⁺ CD11c ^hoch) und (F) plasmazytoiden DCs (MHC-II ^niedrige CD11c ^niedrig PDCA-1 ⁺⁾wurde mittels Durchflusszytometrie 3 Tage nach der BCG bestimmt. Für jedes Experiment wurden mindestens 5 Mäuse für BCG-infizierten Gruppen und 3 für PBS-injizierten Kontrollen verwendet. Die Balken zeigen Standardfehler des Mittelwerts. Gesamtzahl an CFSE-markierten Zellen innerhalb jeder Untergruppe sind in Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015 . 11: e1005206 ^3. * Kennzeichnet statistisch signifikanten Unterschiede zwischen BCG-infizierten und PBS Kontrollen. Eines von zwei unabhängigen Experimenten gezeigt. Abbildung von Bollampalli angepasst et al, PLoS Pathog 2015 11:... E1005206 ^3, mit freundlicher Genehmigung des Verlags Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. EpCAM ^niedrig CD11b ^hoch DCs sind die Haupthaut DC Subset Traffickzur Geräte- DLN Nach BCG Footpad Infektion. C57BL / 6 - Mäuse wurden 2 mit BCG und CFSE wie in Abbildung injiziert. (A) Zebra Plots Gating Strategie (oberes Feld) und die Häufigkeit der CFSE ⁺ Zellen innerhalb jeder verwendet wird, zeigt, definierte Teilmenge an unterschiedlichen Zeitpunkten nach der BCG-Infektion (Bodenplatten). Frequenzen innerhalb jeder Untergruppe kann in Abhängigkeit von dem Zeitpunkt nach der Infektion variieren. Nach 3 Tagen BCG kann man etwa 0,2% MHC-II - ^Hoch CD11c ^{+ / Low} - Zellen unter allen LN - Zellen zu finden erwarten. Von diesen sind etwa 6% CD103 ⁺ Zellen. Für die Untergruppen innerhalb des MHC-II - ^Hoch CD103 ^negative Gate gefunden, kann man etwa 42% CD11b ^hohe EpCAM ^niedrigen Zellen, 27% CD11b ^niedrigen EpCAM ^niedrigen Zellen und 7% LCs finden. (B) Gesamtzahl der CFSE ⁺ Zellen innerhalb jedes definierten Untergruppe zu verschiedenen Zeitpunkten nach der BCG - Infektion gezeigt. Für jede Experiment, mindestens 5 Mäuse wurden für BCG-infizierten Gruppen und 3 für PBS Kontrollen verwendet. Die Balken zeigen Standardfehler des Mittelwerts. * Kennzeichnet statistisch signifikanten Unterschiede in Bezug auf PBS-injizierten Kontrollen. Eine von drei unabhängigen Experimenten gezeigt. Abbildung Wieder gedruckt von Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015 11:.. E1005206 ^3, mit freundlicher Genehmigung des Verlags Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

noDCs sind spezialisierte Antigen-präsentierende Zellen, die auf mikrobielle Herausforderung an Körperoberflächen durch den Erwerb von mikrobiellen Antigen und die Migration auf DLN über Lymphgefäße reagieren zu können. Es stellen DCs dieses Antigens an T-Zellen in einer Weise, die primäre T-Zell-Reaktionen antreibt. Der Prozess der DC Migration von Gewebe zu DLN ist daher sehr wichtig für das Verständnis, wie ein produktives T-Zell-Antwort ausgelöst wird. Methoden DC Migration sind daher sehr nützlich, um zu messen, die oben in Entfaltung.

nach Infektion mit BCG, einem Lebendimpfstoff wurde ein Mausmodell zu studieren Haut DC Migration zu DLN eingesetzt, die klinisch in die Haut injiziert wird. Entsprechend wird BCG im hinteren Fußballen diese kutanen Weg der Impfung zu imitieren. Ein einfacher Test wurde entwickelt und damit zu diesem Modell integriert, um die Migration der Haut DC-Subpopulationen von der BCG-Impfstelle in den Fußballen Haut zur Trockenlegung pLN zu untersuchen. Dieses Protokoll Relies auf den Fluorochrom CFSE in der gleichen Fußballen Injektion, die zuvor BCG empfangen und dann die Trockenlegung pLN 24 Stunden Isolierung später die Anwesenheit von CFSE-markierten Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. Obwohl nicht in dem Protokoll beschrieben, LNs von dieser Einrichtung kann auch für die Analyse durch konfokale Mikroskopie vorbereitet werden, Migrationsprozesse wie beispielsweise die Positionierung von wandernd Zellen in der LN ³ zu studieren. Des Weiteren ähnliche Ergebnisse auf BCG ausgelöste Haut DC Migration wurden mit beiden BCG Pasteur 1173P2 ³ und BCG SSI 1331 ¹⁴ erhalten.

CFSE wird üblicherweise zur Kennzeichnung Zellen in vitro und zu verfolgen , wie zum markierten Zellen in vivo nach dem Zelltransfer ¹⁵ verwendet. Obwohl im aktuellen Protokoll wurde verwendet , um direkt die Hautzellen in situ bezeichnen. Die molekulare Basis von CFSE Markierung ist ähnlich FITC, die auch eine aminreaktive Fluoreszenzfarbstoff ist. CFSE wird aber über FITC für die Konjugation bevorzugt, da es creAtes sehr stabile carboxamid Bindungen ^16. Außerdem ist CFSE hoch permeable Membran und diffundiert passiv in die Zellen. Einmal drinnen, bildet sie intrazelluläre Amin (fluoreszierend) Konjugate , die ¹⁵ in der markierten Zelle zurückgehalten werden.

Die CFSE-basierte Migrationstest von den Autoren entwickelte ermöglicht die Identifizierung von Zellen von der Haut zu DLN innerhalb einer 24-Stunden-Periode in Reaktion auf BCG verlagern. Er misst somit acute Migration während eines definierten Zeitrahmen und ermöglicht es, die Fähigkeit verschiedener, zu untersuchen, injiziert Stimuli Migration zu triggern. Dieser Test unterscheidet sich von der klassischen Technik der FITC Hautmalerei, die eine kumulative Migration Ereignis durch kutane topische Anwendung eines berührungsSensibilisierungsMittels ausgelöst misst. Somit kann der CFSE-basierte Migrationstest eingesetzt werden wandernde Haut DCs oder anderen Zellen zu identifizieren, die Heimat der pLN nach der Injektion von Mikroben, mikrobielle Produkte oder andere entzündliche Reize in der footpad. Tatsächlich beide Neutrophilen und γ: δ haben T - Zellen wurden von der Haut zu DLN als Reaktion auf BCG ^17,18 zu verlagern gezeigt. In der Tat wurde der Test vor kurzem in einer Co-Infektion Einstellung , um zu zeigen , dass ein gut-lokalisierte Nematodeninfektion BCG ausgelöste Haut DC Migration auf DLN ¹⁴ stumm schalten können.

DC Migration wird häufig zwischen 24 bis 72 h in FITC Hautauftragung da FITC-markiertem DCs sind schwer zu erkennen 4 bis 5 Tage nach dem Lackieren ¹⁹ beurteilt. Der Verlust des CFSE Signal an gekennzeichneten DCs ist nicht ein Problem in dem Test hier dargestellt, da Analyse der Migration auf 24 Stunden beschränkt wurde; der Grund dafür ist, dass die Autoren "über Nacht" Migrationen gezielt studieren wollte. Andere interessiert in diesem Test werden jedoch ermutigt, früher oder später Zeitpunkte für CFSE-basierten Tracking zu untersuchen. Da darüber hinaus CFSE durch Injektion eingeführt wird, kann es jeder definierten Zeit gegeben werden. Diese Flexibilität erlaubt, die eineuthors DC Migration zwischen Tag zu beurteilen 5 und 6 nach der BCG - Infektion (2C) ^3. Injecting CFSE könnte möglicherweise die Zelltypen zugänglich in situ auf der Markierungsreaktion begrenzen. Beispielsweise Langerhans - Zellen (LCs), die DCs, die in der obersten Schicht der Haut befinden, wandern die Epidermis, schlecht in Reaktion auf BCG in der CFSE-basierte Migrationstest (Abbildung 3) ^3. Doch während FITC Haut malen, positioniert DCs in der Dermis, die Schicht unter der Epidermis, sind leicht beschriftet und auf den DLN schneller als LCs ^20,21 migrieren. Dies legt nahe, dass Zellen Fluorochrom-markierten ohne notwendigerweise benötigt werden, kann auf die Schicht der Haut zu lokalisieren, wo die Markierungslösung aufgebracht wird.

Als Modell für BCG - Infektion bietet die Maus Ohr eine bona fide intradermal der Impfung , die mit der klinischen Anwendung von BCG als Tuberkulose - Impfstoff mehr im Einklang ist. foOtpad Einspritzung auf der anderen Seite, ist wahrscheinlich eine Kombination der intradermale und subkutane Wege. Das heißt, es erfordert Geschick und Training korrekt und reproduzierbar BCG in die Dermis liefern ^22, so in der klinischen Praxis ist es nicht immer wirklich intradermal verabreicht werden kann , sondern subkutanen oder eine Kombination von beiden. Als Impfstelle hat die Fußballen zwei sehr deutliche Vorteile gegenüber dem Ohr haben, die zu erwähnen Verdienst. Zuerst wird die Immunantwort auf das Ablaufen pLN konzentriert nach einer Fußballeninjektion und dies erleichtert die Prüfung der Antworten. Die Autoren dieses Berichts die pLN die erste und wichtigste LN Ablassen der Fußballen ³ zu sein. Andere haben nach der Injektion von Evan-Blau ²³ geteilte Drainage zwischen den Kniekehlen und subiliac LNs vorgeschlagen. Dennoch in Bezug auf das Ohr, gibt es mehr als ein Ohr DLN in Mäusen und diese möglicherweise nicht regelmäßig vorhanden oder einfach ²⁴ zu lokalisieren. Letztere stellt eindeutig eine liability in Studien der Suche nach Antworten in DLN zu untersuchen. (- 50 & mgr; l 10) gegenüber dem Ohr Zweitens können größere Mengen in den Fußballen inokuliert werden. Dies wiederum minimiert sowohl die Haftung der großen Veränderungen in den Lymphfluss der Einführung und des Habens mit sehr kleinen Injektionsvolumina zu arbeiten, die an sich ist ein Problem, wenn es um Impfen große Mengen von Mykobakterien kommt. Im Ohr, wo die Injektionsvolumina klein (1-10 ul) zu sein, auch 5 ul kann Lymphfluss verändern und möglicherweise eine größere Menge des injizierten Materials zwingen, direkt in den DLN in unkontrollierter Weise. Es ist daher wichtig für Injektionsvolumina zu berücksichtigen. Dies ist besonders wichtig bei Versuchen, den Beitrag der Zellen in Überführung Bakterien an der LN-Adressierung. Im BCG Fußballen Modell haben einige BCG kann die DLN in Abwesenheit von zellulären Transport erreicht. Dies basiert auf der Beobachtung, dass eine BCG noch erkennen kann, in der DLN von Mäusen, wo die Zellmigration vom FußKissen wurde durch lokale Injektion von Pertussis - Toxin ³ vollständig abgetragen. Ob dies ein Hinweis darauf, dass BCG direkt Lymphgefäße zugreifen können und die DLN in einer wirklich zellfreie Weise erreichen noch bestimmt werden, da sie nicht, dass Mykobakterien in diesem Fall ausgeschlossen werden kann, wo durch die Kraft des eingespritzten Volumens Zugang zu Lymphgefäße gegeben.

Eine praktische Überlegung für Immunisierungen im Ohr oder Fußballen ist, dass die Tiere ausreichend immobilisiert werden müssen für Injektionszwecke korrekt und in einer reproduzierbaren Art und Weise durchgeführt werden. Isofluran Gas wird in dem aktuellen Protokoll als ein Verfahren zu beschränken Tiere in Vorbereitung für Injektionen Fußballen beschrieben. Die relativ schnelle Induktion und Wiederherstellungszeiten für Isofluran-vermittelte Anästhesie machen es eine beliebte Methode, aber ähnlich wie bei anderen Anästhetika, es wirkt sich die Physiologie, die ²⁵ mit den experimentellen Ergebnissen stören können. Tatsächlich sowohl flüchtige als auch injizierbare Anästhetika verringern Lymphfluss durch die Abschaffungfreiwillige Muskelbewegungen, Muskeltonus zu reduzieren und abnehm Lymphangion Kontraktion ^26. Weiterhin ist eine 5-fache Verringerung der Migration von DLN DCs adoptiv in den Fußballen übertragen hat in narkotisierten Tieren ²⁷ berichtet. In Anbetracht der obigen, und da die Handhabung Verfahren vor der Anästhesie sind wahrscheinlich mehr Stress für die Tiere zu verursachen als die Injektion selbst, die sowohl schnell zu verwalten ist und keine Wiederherstellungsschritt erfordern, hemmen die Möglichkeit, ausreichend um das Tier ohne Betäubung sollten in Betracht gezogen werden. Eine Maus Verzögerer für Fußballen Injektionen besonders angefertigt, in dem das Tier schnell an eine immobilisierte Position und geimpft in den Fußballen innerhalb von 30 bis 40 sec gebracht werden Ideal wäre die Maus in die hinteren Fußballen zu injizieren, ohne andere Aspekte ihrer Physiologie in den Prozess zu verändern und wäre äußerst nützlich in Studien, in denen die Zellmigration durch Lymphgefäße sein.

Abschließend dieser Berichthebt ein neuartiges Protokoll Haut DCs während ihrer Mobilisierung der DLN anhand eines Tests, die Migration während einer definierten 24-Stunden-Fenster überwacht für die Verfolgung. Diese CFSE-basierte Migrationstest ermöglicht die Erkennung und Analyse von Migrationszellen durch Durchflusszytometrie, wie hier detailliert, sowie durch konfokale Mikroskopie ^3. Es bietet eine flexible Plattform für eine Vielzahl von injizierten Stimuli zu studieren und ihre Fähigkeit, DC Migration auslösen, und vor allem, können eingesetzt werden, nicht nur DCs zu verfolgen, sondern auch andere Populationen von der Haut zu DLN während der verschiedenen experimentellen Bedingungen zu bewegen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Baxter	1001936060
5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	Invitrogen	C1157
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F7524
Bacille Calmette-Guérin (BCG)			strain Pasteur, in house
Trypan blue solution	Sigma	T8154
EDTA			In house
Sodium azide	Sigma	S2002
PBS			In house
Filtered water			In house
BD Plastipak 3 ml syringe	BD Medical Surgical Systems	309658	alternative: 5 ml syringe
6 well plates	TPP	92006
15 ml centrifuge tubes	TPP	91015	Polypropylene
5 ml round bottom tubes	BD Falcon	3272948	Polystyrene
Univentor  400 anaesthesia unit	Univentor	8323001
Monojet 3/10ml syringe	Medicarrier	8881511144	29 G x 1/2 in.
Sterile filter unit	TPP	99500	PES membrane
EPPI-Pistill homogenizer	Schuett biotech	3.200 512	Polypropylene
Allegra X-30R centrifuge	Beckman Coulter	B01145
Bürker counting chamber	VWR	631-0920
0.5 ml screw cap microtube	Sarstedt	72.730	Polypropylene
1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tube	VWR	700-5239	Polypropylene
70 micron cell strainers	VWR	734-0003
BD LSR-II flow cytometer, operated with FACSDiva software	BD Biosciences		Discontinued. Other Flow cytometers available, minimum detection of 6 fluorochromes needed
FlowJo cell analysis software	Tree Star
Antibody	Clone	Company
Antibodies
MHC-II I-A/I-E	M5/114.15.2	BD Biosciences
CD11b	M1/70	BD Biosciences
CD11c	HL3	BD Biosciences
CD16/CD32 (Fc-block)	2.4G2	BD Biosciences
CD326/EpCAM	G8.8	Biolegend
CD103	2E7	Biolegend
CD80	16-10A1	Biolegend
CD86	GL-1	Biolegend