와 감염시 배수 림프절에 쥐 피부 수지상 세포의 마이그레이션을 연구하는 CFSE 기반 분석<em&gt; 소 결핵균</em&gt; Bacille 칼 메트 - GUERIN

요약

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Guérin.

초록

수지상 세포 (DCS)는 배수 림프절 (DLN) 그들의 취득 능력 셔틀 항원을 부분적으로 면역 반응을 개시하는 것이 중요하다. DLN에 수지상 세포의 동원은 복잡하고 완전히 감염 동안 밝혀지지 남아있다. 여기 C57BL에 소 결핵균 Bacille 칼 메트 - GUERIN (BCG)과 발바닥 감염시 수지상 세포의 이동을 추적하기 위해 형광 색소 5와 6 카르복시 디 아세테이트의 숙신 이미 딜 에스테르 (CFSE)에 의존 혁신, 간단한 분석의 사용입니다 설명 / 6 마우스. 이 분석은 적극적으로 BCG에 대한 응답으로 배수, 오금 LN 이주 피부 DC 하위 집단의 특성을 수 있습니다. 이 프로토콜은 철새 피부 수지상 세포는 유동 세포 계측법에 의해 확인 하였다 BCG 모델에서 유래. 분석은 DC가 다른 세포의 연구 및 식별에 호감하다 집으로 오금 LN에 미생물 대사 산물 또는 염증 다른 접종 후이러한 세포의 이동을 조절하는 요인을 연구하기 위해 결과적으로 발바닥에 자극합니다.

서문

몸 표면에 국부적 인 수지상 세포는 미생물 또는 제품을 감지하고, 그렇게에 배수 LN (DLN) ^{1, 2에} 림프관을 통해 동원. 이 재배치는 DLN 및 침입 미생물에 대한 면역 반응의 결과의 프라이밍에 미생물 항원의 수송을 위해 필요하다. DLN은 T 세포 반응 ^3-5 음소거에 실제로 수지상의 봉쇄 또는 실패는 감염된 조직에서 마이그레이션합니다. 따라서, 단일 세포 수준에서의 이동을 추적하기위한 분석은 주어진 DC 서브 세트 돌리다 이동성 기능을 도울 유용하다.

DLN에 피부 수지상 세포의 동원에 큰 데이터 본체가있다. 염증 또는 감염 사이트 ^2에서 DC 마이그레이션에 대한 지식의 대부분을 후자를 차지한다. 피부 수지상의 많은 인구를 수용하고 실험실 쥐에 실험을위한 매우있는 표면이기 때문에 이것은 놀라운 일이 아니다. 몇 가지 기술은 따라서 평가하기 위해 개발되어왔다DLN ² 피부에서 쥐의 수지상 세포의 이동. FITC 피부 페인팅까지 가장 많이 사용되는 방식으로있다. 이 분석에서, 형광 플루오 레세 인 -5- 이소 티오 시아 네이트 (FITC)의 아세톤 및 접촉 자극을 함께 혼합하여 제조된다. 이 칵테일 면도 한 면도 또는 피부에 도포하고 FITC 표지 된 세포의 축적이 DLN 분석 차례이다. 마이그레이션은 피부의 형광 입자를 내재화 한 대 식세포의 추적을 가능하게, 형광 표지 된 나노 - 또는 마이크로 입자와 피부에 주입하여 연구 될 수있다. 림프 혈관이 직접 림프에서 마이그레이션 수지상를 추출하기 위해 유관 될 수있다. 특히 생쥐 그러나 기술적 도전이다. 후속 분석을 위해 수득 된 수지상 세포의 수 또한 제한 요소이다.

피부 DC 마이그레이션에 많은 선행 연구에도 불구하고, DLN 다음 vacci에 피부 DC 동원에 관한 정보의 소수가 남아Bacille 칼 메트 - GUERIN (BCG), 소 결핵균의 라이브, 감쇠 변형과 국가는 M.에 대해 예방 접종에 사용 결핵. BCG는 T 헬퍼 세포 1 형 응답을 트리거 제한된 감염을 일으키는 원인이되는 피부에 접종한다. 둘 다이 과정에서 자신의 이동을 조절하는 BCG 감염 피부에서 DLN에 동원 직류 하위 집단과 요소는 완전히 이해되지 않습니다. 형광 색소 5- 및 6- 카르복시 디 아세테이트 숙시 니미 딜 에스테르 (CFSE)가 DLN ^(3)에 DC에서의 이동을 추적하는 반응계에 주입되는 경우, 상기에 비추어, 간단하면서도 신규 한 방법이 개발되었다. C57BL / 6 마우스는 BCG의 접종 희생 전날과 뒷다리 발바닥에 주입되고, 동물 CFSE의 고농도와 같은 발바닥에 주입된다. 24 시간 후에 동물을 희생하고 배수 오금 LN (PLN)을 제거하고 유동 세포 계측법에 대 한 준비가되어 있습니다. 이 분석은 IDE를 할 수 있습니다DLN에 발바닥 피부에서 하룻밤 마이그레이션 세포 (그림 1)의 ntification.

또한, 유전자 타겟팅은 생쥐에 DLN 동원 세포에 필요한 요소를 식별하는데 사용될 수있다. 이 분석을 사용하여,이 보고서의 저자가 이전에 발견하는 인터루킨 -1 수용체 및 세포 내 어댑터 분자에서 MyD88 ^(3)에 의해 규제 프로세스의 DLN로는 EpCAM ^낮은 CD11b를 ^높은 철새 피부 수지상 전송 BCG는. 유동 세포 계측법은 이동성 피부 수지상을 검출하고 분석하는 데 사용 된 Bollampalli 외. ^(3)에 의해 상기 리포트에서 유래이 CFSE 기반 이동 분석을위한 프로토콜이 설명된다. 장점이 분석의 단점이 논의된다.

프로토콜

주 : C67BL / 6 마우스가이 원고에 도시 한 실험에 사용 하였다. 이 동물은 MTC 동물 시설, 카롤린스카 연구소, 스톡홀름, 스웨덴에서 특정 병원균이없는 조건에서 집이었다. 동물 실험은 농업의 스웨덴 이사회, 스웨덴의 동물 보호 기관 및 카롤린스카 연구소의 지시 및 지침에 따라 수행 하였다. 실험은 스톡홀름 북한의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었다.

CFSE 주식 및 저장 1. 준비

1. 디메틸 설폭 사이드에서 5와 6 카르복시 디 아세테이트의 숙신 이미 딜 에스테르 (CFSE)의 5 mM의 주식을 준비합니다. 와동. 멸균에 100 ㎕의 분취 량을 분배, 0.5 ml의 캡 마이크로 튜브를 나사. -80 ° C에서 보관 씩.

2. 마우스

1. 나이의 8 12 주 사이에 근친 남성 또는 여성 마우스를 사용합니다. , 성별 및 연령대 동물이 바람직하다. 필요한 동물 윤리 허가가 아칸소 확인실험 개시 전에 장소에 전자.

아이소 플루 란 가스 마취와 동물 3. 고정화

1. 이소 플루 란으로 마취 장치를로드합니다. 이소 플루 란과 10 ml의 기밀 유리 주사기를 입력합니다. 공기 방울을 도입하지 마십시오. 공급 튜브와 주사기와 액체 입구를 연결하고 연결 관에 액체가 눈에 띄게 기화기를 입력 막 때까지 앞으로 미는 이동합니다.
   참고 : 주사기에 사용하지 않을 때 이소 플루 란을 보관하지 마십시오.
2. 500 ㎖ / 분에서 3.5 %의 이소 플루 란의 농도 - 기류는 약 400으로 유지하여, 유도 챔버에 동물을 이소 플루 란 마취.
   참고 :이 장치는 공기 흐름없이 작동하지 않습니다.
3. 동물들이 잠되면, 마스크 조각 경로에 마취 기기의 이소 플루 란 가스 꼭지를 켭니다. 마스크 조각 가스의 누출을 방지하기 위해 그대로 있는지 확인합니다. 기류는 400 ㎖ / 분, 알터 유지할 수상대적으로 / 분 200㎖의 감소. 2.6 %의 이소 플루 란 농도를 줄일 수 있습니다.
   주 : 마취 효과를 증가 및 / 또는 유속을 조절함으로써 감소 될 수있다.

4. BCG 주사 및 복구

1. 시각적으로 확인하고 주사를 수행하기 전에 이소 플루 란 마스크 조각에 잠 / 고정되도록 마우스를 확인하기 발가락 핀치 반사 테스트로 테스트를 수행합니다.
2. 29 G X ½ 인치 바늘 장착 된 주사기를 사용 PBS의 30 μL에, 뒷다리 발바닥에 소 결핵균 Bacille 칼 메트 - GUERIN (BCG)의 1 × 10 ⁶ 콜로니 형성 단위를 접종한다.
   참고 : 마이코 박테리아 주식의 생성을 간략하게이 절차 ^3의 원래 설명에 설명하고, 다른 곳에서 ⁶ 상당한 상세하게된다. BCG는 상용 소스에서 쉽게 사용할 수 있습니다. 저자는 inoculati 이전에 대단히 짧은 시간을 방해하기 위해 주사기를 통해 BCG는 펄스 초음파 또는 전달하는 것이 좋습니다마우스로합니다. 미생물 자극이 프로토콜 ^3의 원래 설명에 자사의 고용을 제공하지만 저자는 확실히 다른 미생물 자극의 테스트를 장려으로 BCG는 여기에서 반복된다.
3. 대조군으로 PBS를 주입에 대해 상기 기술 된 것과 동일한 절차를 수행한다.
4. 마취에 성공에서 그 회복을 확인하기 위해 주사 후 동물을 모니터링하고 동물 주입, 뒷다리 발바닥에 자신을 지원할 수있다.

5. CFSE 주입

1. 주사에 대한 CFSE의 제조 :
   1. C ° -80에서 5 밀리미터 CFSE 주식 솔루션의 유리 병을 해동. PBS에서 CFSE 10 배 희석. 완전히 주입 준비 주사기를 채우기 전에 용액을 재현 탁.
2. CFSE 주입 및 복구 :
   1. 이전에 BCG 또는 PBS를받은 뒷다리 발바닥에 절에 0.5 밀리미터 CFSE 3.를 주입 20 μl를 동물을 마취하는 절차를 반복합니다.
      참고 : CFSE의 주입 희생의 일을하기 전에 (24 시간) 계획된 날짜를 수행해야합니다.

슬와 림프절 6. 외과 제거 (PLN)

참고 : 멸균 수술 도구 및 70 % 에탄올에서의 반복 오염 제거의 사용은이 단계에 걸쳐 권장합니다.

1. 쥐를 안락사. 70 % 에탄올로 동물을 분무. 해부 보드, 지느러미 위치에 동물을 핀.
   주 : 저자는 자궁 경부 전위를 통해 안락사를 추천 할 수 있습니다.
2. 조심스럽게 뒷 허벅지에 수직 절개를합니다. 무릎의 중공에 지방 주머니에 깊이있는 PLN 노출 결과적으로 절제 가위와 핀셋을 사용하여 삭제 근육과 지방.
3. 얼음에, 0.5 ml의 멸균 PBS로 PLN을 전송합니다.

PLN에서 단일 세포 현탁액의 7 세대

1. 70 마이크론 셀 스트레이너의 PLAC를 통해 PLN을 균질화ED 포함하는 6 웰 플레이트에 5 ㎖ PBS 또는 형광 - 활성화 된 세포 소팅 (FACS) 완충액 (PBS 함유 2 % 소 태아 혈청 (FCS), 5 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 1 mM의 나트륨 아 지드). 3 mL의 주사기의 백엔드를 사용하여 여과기를 통해 균질화.
   주 : 아 지드 화 나트륨은 독성이주의를 처리해야합니다.
2. , PBS 또는 FACS 버퍼의 또 다른 5 ml의 스트레이너를 씻어 15 ML 튜브에서 자료를 수집하고 5 분, 4 ° C를위한 277 XG (1,200 rpm으로, R = 172mm)에서 세포 펠렛. 대안 적으로, 균질 폴리 프로필렌을 사용하는 마이크로 원심 튜브에 직접 pLNs 균질화.
3. 1000 μL - 펠렛의 크기에 기초하여, 예를 들어 PBS 또는 FACS 완충액 적절한 부피 (200)를 PLN 현탁액을 재현 탁. 각 LN 현탁액에서 얻은 총 세포 수를 정량화하기 위해 계산 실을 사용합니다. 죽은 / 죽어가는 세포를 제외 트리 판 블루를 사용합니다.

8. 세포 염색 및 유동 세포 계측법

1. TRansfer 중 1 - 10 × 10 ⁶ 세포를 5 ml의 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브. 5 분, 4 ° C에 대한 277 XG (1,200 rpm으로, R = 172mm)에서 원심 분리하여 FACS 버퍼 및 펠릿 씻으시오.
2. 뜨는을 취소하고 50 펠렛 재현 탁 - 0.5 포함하는 항체 칵테일 100 ㎕ (수지상 세포 [DC] 마커 표면 염색에 사용되는 재료 표 참조) - 항 - 마우스 CD16 / CD32의 1 μg의을 (불특정 된 Fc를 매개 차단 얼음에 45 분, - 30 FACS 버퍼에 상호 작용). 빛으로부터 샘플을 보호합니다.
3. 배양 후, 5 분, 4 ° C에 대한 277 XG (1,200 rpm으로, R = 172mm)에서 원심 분리하여 FACS 버퍼와 펠렛와 세포를 씻는다.
4. FACS 완충액 100 μL - (50)에 세포를 재현 탁. ^7-10 유세포에 데이터를 획득.
   참고 : 흐름에 우수한 리뷰 세포 계측법 우리는이 방법에 모두 이론 및 실제 정보를 중계 다음 책에 독자를 참조하십시오.

결과

CFSE 기반 마이그레이션 분석 (그림 1)은 발바닥에 PLN BCG 후 감염에 나타나는 CFSE 표지 된 세포를 감지하고 특성화하기 위해 유동 세포 계측법과 함께 사용되었다. PLN에서 CFSE 라벨의 큰 부분은 피부 DLN ^(11)로 마이그레이션 한 피부 수지상 세포와 일치하는 MHC-II ^높이의 CD11c ^{+ / 낮은} 세포를 (그림 2A)에 있습니다. 주파수와 CFSE 표지, MHC-II ^높은 중 CD11c의 총 수는 모두 ^{+ / 낮은} 세포는 BCG이의 재배치를 향상 것을 제안, PBS 주입 컨트롤 (그림 2B-C)에 비해 BCG에 감염된 마우스에서 pLNs에 증가 DLN에 세포. 24 시간의 기간 동안이 분석 측정 마이그레이션 이후, 그 피부 DC가 여전히 DLN 오일 후 감염 (그림 2C)를 입력하는 설정하는 것이 가능했다. 이 잘 초기 activati에 대한 타임 라인을 넘어 현재 모델에서 DC 마이그레이션을 확장PLN ^3의 항원 특이 적 CD4 ⁺ T 세포에. 또한, 철새 피부 수지상 세포 공동 자극 분자 CD80 및 CD86 (그림 2D)의 높은 수준을 표현한다. 이는 피부 이식편 배양 및 FITC 피부 ¹¹ 페인팅 이동성 수지상 활성화 세포이라는 개념을 지원하는 이전의 관찰과 일치한다. 중요한 것은, 모두 LN 상주 수지상 (MHC-II ^+의 CD11c ^높은 세포) 및 형질 수지상 (MHC-II ^낮은 중 CD11c ^낮은 PDCA-1 ⁺ 셀), 고 내피 세정맥을 통해 염증이 림프절를 입력하지 심성 림프관 ^(12), 음수 CFSE (그림 2EF)는, 참으로 제안 CFSE 라벨은 발바닥에 주로 발생있다.

MHC-II ^높은 중 CD11c ^{+ / 낮은} 세포가 하나 있지만 여러 DC 하위 집단 ^(13), 추가 표면 마커 CD103,는 EpCAM (C를하지 나타내는 점을 감안D326) 및 CD11b를 더 이동성 수지상 (도 3)의 집단을 특징 유세포 검출부 (표 재료)에 사용되는 항체 염색 패널에 포함되었다. 이 과정에서는 EpCAM ^낮은 CD11b를 ^높은 세포의 하위 인구는 BCG 감염 (그림 3)에 대한 응답으로 주요 철새 피부 DC 서브 세트로 확인되었다.

(4) 레이저 (488, 532, 640 및 405 ㎚)를 구비 사이토 여기 도시 유세포 데이터 플로우에 수집 하였다. 데이터는 셀 분석 소프트웨어로 분석 하였다. 재료 표에 지정된 것과 다른 다색 유동 세포 계측기는 그 문제에 대한 다른 유형의 세포에 대한 연구 상기 언급 된 표지의 성공적인 검출, 또는 다른 마커의 검출을 위해 사용될 수있다. 본원에 기술 된 프로토콜의 경우, 6 개의 형광 색소를 검출하는 능력은 사이토 nece은ssary. 중요한 것은, 사용 된 각 항체에 대한 클론 (재료 표) 지정됩니다. 형광 색소 접합체의 선택이 가능한 흐름 cytometer의 레이저 및 검출 채널에 따라 달라질 것으로 간주되어야한다. 유사하게, 항체 염색을위한 가장 적절한 희석액을 결정하도록 적정 될 필요가있다.

BCG- 및 PBS 주입 시료에서 인구 주파수는 그래프와 수지상의 정의, 게이트 부분 집합의 절대 수를 계산하는 총 세포 수와 함께 사용되었다. 데이터 군 수단 차이의 유의성은 p <0.05의 컷오프와 학생 ST '시험 또는 적절한 ANOVA로 분석 하였다. 아웃 라이어는 아웃 라이어에 대한 그럽의 시험 다음과 같은 분석에서 제외 하였다.

그림 1. 개요 : BCG 발바닥 감염모델 및 CFSE 기반 마이그레이션 분석. BCG는 C57BL / 6 마우스의 뒷다리 발바닥에 접종한다. 상이한 시간 감염 후 포인트 희생 전 24 시간에, 형광 색소 CFSE 이전 BCG를 수신 동일한 발바닥에 주입된다. 배수, 오금 림프절을 분리하고 세포 계측법. 흐름을 특징으로 세포를 CFSE가 표지 된 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 철새 피부 수지상는 주요 인구가 DLN BCG 노상 후 감염에 재배치합니다. C57BL / 6 마우스는 발바닥에 BCG의 1 × ⁶ CFUs에 감염되었다. 24 시간 전에 희생 동물은 동일한 풋 0.5mm의 CFSE와 함께 주사 하였다. 오금 림프절은 수확 균질화 하였다단일 세포 현탁액 내로 유동 세포 계측법을 실시. BCG 후 일일 만든 측정을 위해 CFSE는 BCG 후 2 시간을 주입 하였다. (A와 B) 삼일 감염 후 PLN을 BCG는 배수에 MHCII ^높이의 CD11c ^{+ / 낮은} 세포 CFSE의 지배적 인 표현을 보여주는 얼룩말 플롯. BCG-와 PBS가 주입 된 마우스의 PLN에서 CFSE 표지 ^높은 MHCII의 CD11c의 (C) 주파수 및 갯수가 ^{+ / 낮은} 셀은 다른 시점에서 그래프로 하였다. CD80 및 CD86에 대한 (D) 평균 형광 강도 (MFI)는 CFSE ^+와 CFSE의 ^음수 MHC-II ^높은 중 CD11c 삼일 BCG 감염 후 PLN에서 ^{+ / 낮은} 피부 DC에서 결정되었다. (E) 피부 DC가 내 CFSE 식 (MHC-II ^높은 중 CD11c ^{+ / 낮음),} LN 상주 수지상 (MHC-II ^+의 CD11c ^높은) 및 (F) 형질 DC가 (MHC-II ^낮은 중 CD11c ^낮은 PDCA-1 ⁺⁾삼일 BCG 후에 유동 세포 계측법에 의해 결정 하였다. 각 실험에서, 적어도 5 마우스는 PBS 주사 한 컨트롤 BCG 감염 그룹에 사용 하였다 3. 바 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 각 부분 집합 내에서 CFSE 표지 세포의 총 수는 Bollampalli 등의 알에 제시되어, PLoS의 Pathog 2015, 11 :. e1005206 ^3. * BCG 감염과 PBS 컨트롤 사이에 통계적으로 유의 한 차이를 나타냅니다. 표시된 두 개의 독립적 인 실험 중 하나입니다. Bollampalli에서 적응도 등, PLoS의 Pathog 2015, 11 :... e1005206 ^3, 발행인의 허가를 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3.는 EpCAM ^낮은 CD11b를 ^높은 DC의 메인 스킨 DC 부분 트래 피킹 있습니다DLN BCG 노상 후 감염에 보내고. C57BL / 6 마우스 (A) 얼룩말 플롯 채용 전략 (상단 패널)와 각 내에서 CFSE ⁺ 세포의 주파수를 게이팅 게재합니다. 그림 2에서와 같이 BCG와 CFSE 주사 다양한에서 하위 집합을 정의 된 BCG 감염 (아래 패널) 후 시점. 각 부분 집합 내에서 주파수는 감염 후 시점에 따라 달라질 수 있습니다. BCG 3 일 후에 한 모든 LN 세포 중 약 0.2 % MHC-II ^높은 중 CD11c ^{+ / 낮은} 세포를 찾을 것으로 예상 할 수있다. 이들 중 약 6 %가 CD103 ⁺ 세포이다. MHC-II ^높은 CD103 ^부정적인 게이트 내에있는 서브 세트를 들어, 하나의 약 42 %는 CD11b ^높은는 EpCAM ^낮은 세포를, 27 %는 CD11b ^낮은는 EpCAM ^낮은 세포와 7 %의 LC를 찾을 수 있습니다. (B) BCG 감염 후 상이한 시점에서 CFSE ⁺ 세포 내에서 각각의 정의 된 서브 세트의 총 수를 나타낸다. 각 experime에 대한NT를, 적어도 5 마우스는 BCG 감염 그룹과 PBS 컨트롤 3 사용 하였다. 바 평균의 표준 오차를 나타냅니다. *은 PBS 주입 제어에 비해 통계적으로 유의 한 차이를 나타냅니다. 도시 3 개의 독립적 인 실험 중 하나입니다. 그림 재 인쇄 Bollampalli 등에서, PLoS의 Pathog 2015, 11 :.. e1005206 ^3, 발행인의 허가를 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

noDCs 미생물 항원을 획득하고 림프관을 통해 DLN로 마이그레이션하여 신체 표면에서 미생물의 도전에 대응할 수있는 전문 항원 제시 세포이다. 거기에서, 수지상 차 T 세포 반응을 구동하는 방식으로 T 세포에 항원을 제시이. DLN으로 조직으로부터 DC 이전의 과정은 생산 T 세포 반응을 개시하는 방법을 이해하기위한, 따라서 매우 중요하다. DC 마이그레이션을 측정하는 방법은 결과적으로 위의 전개에 매우 유용하다.

마우스 모델은 BCG 피부에서 임상 주입 생백신 감염 DLN 다음에 피부 DC 마이그레이션을 연구하는데 사용 하였다. 행에서, BCG 예방 접종이 피부 경로를 모방하기 위해 뒷다리 발바닥에 주입된다. 간단한 분석은 개발 결과적으로 배수 PLN에 발바닥 피부의 BCG 접종 부위에서 피부 DC 하위 인구의 이동을 조사하기 위해이 모델에 통합되었다. 이 프로토콜 RELI이전 BCG를 수신 동일한 발바닥에 형광 색소 CFSE 주입 후 유세포 CFSE 표지 된 세포의 존재를 분석 후에 배수 PLN 24 시간 분리에 에스. 프로토콜에 설명되어 있지 않지만,이 설정에서 림프절는 또한 이동성 LN ³ 셀의 위치로 이동 과정을 연구하기 위해 공 초점 현미경 분석을 위해 제조 될 수있다. 또한, BCG 트리거 피부 DC 마이그레이션에 유사한 결과는 BCG 모두 파스퇴르 1173P2 ³ BCG SSI 1331 ^(14)를 사용하여 얻어졌다.

CFSE 일반적으로 시험관 내에서 세포를 라벨 세포 전달 ^{15 일} 이후 생체 내에서 세포와 같은 표지를 추적하는 데 사용된다. 비록 현재의 프로토콜에서, 바로 현장에서 피부 세포에 라벨을 사용 하였다. CFSE 표지 분자 기초는 아민 반응성 인 FITC 형광 염료, 유사하다. 이 CRE로 CFSE 그러나 접합 대한 FITC보다 선호ATES 매우 안정 카르 채권 ^16. 또한, CFSE 매우 막 투과성이고 수동적 세포로 확산. 일단 내부, 그것은 세포 내 아민 (형광) 표지 셀 ^(15)에 유지됩니다 접합체를 형성한다.

저자에 의해 개발 된 CFSE 기반 마이그레이션 분석은 BCG에 응답하여 24 시간 이내에 피부에서 DLN 재배치 세포의 식별을 가능하게한다. 이는 따라서 정해진 기간 동안 급성 이동을 측정하고 다른 하나의 능력을 조사 할 수 있도록, 이동을 유발하는 자극을 주입. 이 분석은 접촉 증감 제의 피부, 국소 적용에 의해 트리거 누적 마이그레이션 이벤트를 측정 FITC 피부 회화의 전통적인 기술과는 다릅니다. 따라서, CFSE 기반 마이그레이션 분석은 이동성 피부 수지상 또는 F에서 미생물, 미생물 제품 또는 다른 염증성 자극의 주입 후 PLN 곳 다른 셀을 식별하기 위해 사용될 수있다ootpad. 실제로, 호중구 및 γ 둘 : δ T 세포는 BCG ^{(17, 18)에} 응답 DLN 피부에서 원치 것으로 나타났다. 사실, 분석은 최근 장 지역화 선충의 감염이 DLN ^(14)에 BCG 트리거 피부 DC 마이그레이션을 음소거 수 있다는 것을 보여주기 위해 공동 감염 설정에 사용되었다.

DC 마이그레이션은 종종 DC가 ^{19 페인팅} 후 4 ~ 5 일을 감지하기 어려운 FITC 표지부터 24 FITC 피부 회화 시간 72 사이에 평가된다. 이주의 분석은 24 시간으로 제한 된 이후 레이블의 DC에 CFSE 신호의 손실은 여기에 제시된 분석에서 문제가되지 않습니다; 이 저자가 특별히 공부 "하룻밤"마이그레이션 이벤트를 원했다는 것을 뒤에 이유. 이 분석에 관심있는 사람들은 그러나 CFSE 기반 추적에 대한 이전 또는 이후의 시점을 조사하는 것이 좋습니다. CFSE 사출에 의해 도입되기 때문에, 또, 어떤 정의 된 시간에 주어질 수있다. 이러한 유연성은 A 허용uthors는 BCG 감염 (그림 2C) ³ 후 하루 5와 6 사이의 DC 마이그레이션을 평가합니다. 주입 잠재적 CFSE 표지 반응 시츄 접근 세포 유형을 제한 할 수있다. 피부의 최상층에있는 DC에있는 인스턴스 랑게르한스 세포 (LCS)에 대해서는, 표피 (도 3) ³ CFSE 기반 이동 분석에서 BCG에 응답 제대로 이동한다. 그러나, FITC 피부 페인팅, 진피에 위치 수지상 동안, 표피 아래 층은 쉽게 표시되어 빠른 LC를 ^{20, 21보다} DLN로 이동한다. 이것은 세포를 형광 표지 될 수 있다는 것을 반드시 라벨 솔루션이 적용되는 피부의 층에 지역화없이 제시한다.

BCG 감염의 모델로, 마우스 귀는 더 결핵 백신으로 BCG의 임상 적 관리와 라인에 접종의 선의의 피내 경로를 제공합니다. FO한편 otpad 분사 가능성 피내 및 피하 경로의 조합이다. 즉, 임상에서 항상 진정으로 피내 주어 오히려 피하 또는이 둘의 조합되지 않을 수도 있습니다 정확하고 재현성, 진피 ^(22)에 BCG를 제공하는 기술과 훈련이 필요했다. 접종 사이트로 발바닥은 언급 장점 귀를 통해이 매우 분명 장점을 가지고있다. 우선, 면역 반응은 발바닥 주사 다음 배수 PLN 농축 이는 반응의 검사를 용이하게한다. 이 보고서의 저자는 PLN은 발바닥 ^{3 배수} 제 주 LN 것으로 나타났습니다. 다른 사람들은 에반의 파란색 ^(23)의 주입 후 오금 및 subiliac 림프절 사이의 분할 배수를 제안했다. 그럼에도 불구하고, 귀에 관해서,이 마우스에서 하나 이상의 귀 DLN이며, 이들은 정기적으로 현재 또는 ^(24)를 쉽게 찾을 수 없습니다. 후자는 분명히 liab을 소개합니다DLN의 반응을 조사하고자하는 연구 ility. 귀 비교 - (50 μL 10) 둘째, 더 큰 볼륨은 발바닥에 접종 할 수있다. 이것은 차례로 모두 림프 유동에 큰 변화를 도입하고 마이코 박테리아의 대량 접종에 관해서 자체에 문제가 매우 작은 주입량 함께 작동해야하는 책임의 최소화. 사출 볼륨이 작은 (1 ~ 10 μL)해야 귀에도 5 μL는 림프의 흐름을 바꿀 수 있으며, 잠재적으로 통제되지 않은 방식으로 직접 DLN에 주입 된 물질의 많은 양을 강제로. 주입 볼륨을 고려하는 것이 중요하다. 이것은 LN에 박테리아 배로 건네 세포의 기여를 어드레싱 실험에서 특히 중요하다. BCG 풋 모델 일부 BCG 셀룰러 전송의 부재에 DLN 도달 할 수있다. 이것은 하나 여전히 발에서 마우스의 DLN 곳에서 세포 이동을 BCG를 검출 할 수있는 관찰에 기초패드는 완전히 백일해 독소 ⁽³⁾ 지방 주입에 의해 절제 하였다. 이러한 BCG 직접 림프관 액세스 진정한 무 세포 방식 DLN 도달 할 수 있다는 표시를 할 것인가 아닌가를 배제 할 수 없기 때문에 판단 될 남아 주입 부피 강제 림프관 액세스를 부여이 경우 마이코 박테리아.

귀 또는 발바닥의 접종하기위한 실용적인 고려 주사 정확하고 재현 가능한 방식으로 수행 될 때까지 동물을 적절하게 고정 될 필요가 있다는 것이다. 이소 플루 란 가스 발바닥 주사 준비 동물을 억제하기위한 방법으로서, 현재의 프로토콜을 설명한다. 이소 플루 란 매개 마취의 비교적 빠른 유도 및 복구 시간은 인기있는 방법 만들지 만, 다른 마취제와 마찬가지로,이 실험 결과 ^25를 방해 할 수 있습니다 생리에 영향을줍니다. 실제로, 휘발성 마취제 주사 모두 폐지하여 림프 흐름을 감소수의근 운동 근육을 감소시키고 lymphangion 수축 ^(26)을 감소시킨다. 또한, 적응 적 발바닥에 전달 수지상의 DLN 마이그레이션의 5 배 감소는 마취 된 동물 ^{(27)에보고되었다.} 상기를 감안 전에 마취로 처리 절차 때문에 관리가 모두 신속하고 회수하는 단계를 요구하지 않는 주사 자체보다 동물에 더 스트레스를 야기 할 가능성이있는 가능성이 충분히 마취없이 동물을 억제하기해야 간주 될 수있다. 동물 빠르게 30-40 초 이내에 발바닥에 고정 위치에 위치 접종 할 수 발바닥 주사를위한 맞춤형 마우스 제한 수단은 실행 과정에서 생리학의 다른 측면을 변경하지 않고 뒷다리 발바닥에 마우스를 주입하는 것이 이상적 및 림프관을 통해 세포 이동을 다루는 연구에 매우 유용 할 것이다.

결론적으로,이 보고서정의 된 24 시간의 기간 동안 마이그레이션을 모니터링하는 분석을 사용하여 DLN 그들의 동원 동안 피부 수지상 세포를 추적하기위한 새로운 프로토콜을 강조한다. 이 CFSE 기반 마이그레이션 분석은 여기에 설명 된대로, 유동 세포 계측법뿐만 아니라, 공 초점 현미경 ^(3)에 의한에 의해 탐지 및 철새 세포의 분석을 할 수 있습니다. 그것은 주입 자극의 다양성과 DC의 이동을 유발하는 능력을 연구 유연한 플랫폼을 제공하고, 중요하게, DC가 아니라 다른 실험 설정 중에 DLN 피부에서 이동하는 다른 집단뿐만 추적하는데 이용 될 수있다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Baxter	1001936060
5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	Invitrogen	C1157
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F7524
Bacille Calmette-Guérin (BCG)			strain Pasteur, in house
Trypan blue solution	Sigma	T8154
EDTA			In house
Sodium azide	Sigma	S2002
PBS			In house
Filtered water			In house
BD Plastipak 3 ml syringe	BD Medical Surgical Systems	309658	alternative: 5 ml syringe
6 well plates	TPP	92006
15 ml centrifuge tubes	TPP	91015	Polypropylene
5 ml round bottom tubes	BD Falcon	3272948	Polystyrene
Univentor  400 anaesthesia unit	Univentor	8323001
Monojet 3/10ml syringe	Medicarrier	8881511144	29 G x 1/2 in.
Sterile filter unit	TPP	99500	PES membrane
EPPI-Pistill homogenizer	Schuett biotech	3.200 512	Polypropylene
Allegra X-30R centrifuge	Beckman Coulter	B01145
Bürker counting chamber	VWR	631-0920
0.5 ml screw cap microtube	Sarstedt	72.730	Polypropylene
1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tube	VWR	700-5239	Polypropylene
70 micron cell strainers	VWR	734-0003
BD LSR-II flow cytometer, operated with FACSDiva software	BD Biosciences		Discontinued. Other Flow cytometers available, minimum detection of 6 fluorochromes needed
FlowJo cell analysis software	Tree Star
Antibody	Clone	Company
Antibodies
MHC-II I-A/I-E	M5/114.15.2	BD Biosciences
CD11b	M1/70	BD Biosciences
CD11c	HL3	BD Biosciences
CD16/CD32 (Fc-block)	2.4G2	BD Biosciences
CD326/EpCAM	G8.8	Biolegend
CD103	2E7	Biolegend
CD80	16-10A1	Biolegend
CD86	GL-1	Biolegend