תנודות Band גמא הקלטה Pedunculopontine Nucleus נוירונים

Summary

גרעין pedunculopontine (PPN) ממוקם בגזע המוח ונוירונים שלה מופעלים מקסימאלי בזמן ערות לבין תנועות עיניים מהירות (REM) מצבי השינה המוח. עבודה זו מתארת ​​את הגישה הניסויית לרשום תנודת קרום התת להקה גמא במבחנה בנוירונים HBC.

Abstract

Efferents Synaptic מן PPN ידועים לווסת את הפעילות העצבית של כמה אזורים התלמוס intralaminar (למשל, centrolateral / parafascicular; גרעין Cl / PF). הפעלתי גם את HBC או גרעיני Cl / Pf in vivo תואר לנצל את השפעתה על העוררות של חית תוספת בפעילות להקת גמא ב אלקטרואנצפלוגרם קליפת המוח (EEG). המנגנונים התאיים עבור הדור של תנודות להקת גמא ב רשתי מערכת הפעלה (RAS) נוירונים זהים לאלה שנמצאו ליצור תנודות להקה גמא בגרעיני מוחות אחרים. במהלך הקלטה נוכחיים מהדקים של נוירונים של HBC (מ פרוסות parasagittal מן 9 - 25 יום בן חולדות), שימוש depolarizing צעדים מרובעים מופעל במהירות תעלות אשלגן מתח תלוי שמנעו נוירונים של HBC מלהיות depolarized מעבר -25 mV.

הזרקת 1 - 2 שניות ארוכות depolarizing רמפות נוכחיות depolarized בהדרגת הקרום של HBC מיל הפוטנציאלטינג ערכי כלפי 0 mV. עם זאת, פולסים מרובעים depolarizing הזרקה שנוצרו תנודות גמא-band של פוטנציאל הממברנה שהראו להיות קטן משרעת לעומת התנודות שנוצרו על ידי רמפות. כל הניסויים בוצעו בנוכחות תעלות נתרן מתח מגודרת וחוסמים קולטניים הסינפטי מהר. הוכח כי הפעלת ערוצי סידן תלוי מתח גבוה-סף ביסוד פעילות תנודתית גמא-band בנוירונים HBC. התערבויות מתודולוגיים תרופתיות ספציפיות מתוארות כאן, מתן הכלים הדרושים כדי לעודד ו לקיים PPN תנודת להקת גמא התת במבחנה.

Introduction

גרעין של HBC כלול אנטומית של tegmentum mesencephalic הזנב. PPN הוא מרכיב מרכזי של RAS ^1. PPN משתתף בשמירה על מדינות מופעלות התנהגותיות (כלומר, להעיר, רע"מ) ^2. גירוי חשמלי של PPN in vivo המושרה תנודה מהירה (20 - 40 Hz) ב EEG קליפת המוח ^3, בעוד נגעים של HBC הבילטרלי עכברוש צומצמו או בוטלו רע"מ ^4. בעוד שרוב הנוירונים של HBC לירות פוטנציאל פעולה ב בטא / תדר גמא-band (20 - 80 הרץ), כמה נוירונים מוצגים שיעורים נמוכים של ירי ספונטני (<10 Hz) ^5. יתר על כן, של HBC נראה מעורב בהיבטים אחרים של התנהגות כגון מוטיבציה ותשומת לב ^6. בתדירות גבוהה ישיר (40 - 60 Hz) ⁷ גירוי חשמלי של הגרעין של HBC בחיות decerebrate יכול לקדם תנועה. בשנים האחרונות, גירוי מוחי עמוק (DBS) של HBC כבר המשמשת לטיפול בחולים הסובלים הלוך ושובהפרעות מ מעורבים גירעונות הילוך כגון מחלת פרקינסון (PD) ^8.

דיווחים קודמים הראו כי כמעט כל הנוירונים של HBC יכולים לפטר פוטנציאל פעולה בתדר להקת גמא כאשר depolarized באמצעות ⁹ פולסים נוכחיים רבועים. בגלל ההפעלה דרסטי של תעלות אשלגן מתח מגודרת במהלך depolarizations פולסים מרובע עד או תחת -25 mV. כתוצאה מכך, אין תנודות גמא חזקות נצפו לאחר חסימת דור פוטנציאל פעולה באמצעות tetrodotoxin ^10. במאמץ לעקוף בעיה כזאת, 1 - 2 שניות ארוכות depolarizing רמפות נוכחיות היו בשימוש. רמפות depolarized פוטנציאל הממברנה בהדרגה נח ערכים של עד 0 mV, בעוד inactivating חלקית תעלות אשלגן מתח מגודרת. תנודות קרום להקת גמא נקה ניכרו בתוך חלון תלות מתח ערוצי סידן סף גבוה (כלומר, בין -25 mV ו -0 mV) ^10. לסיכום, להקת גמא פעילויותיוty נצפתה בנוירונים של HBC ^9, ושניהם P / Q- ו- N-סוג מתח מגודר ערוצי סידן צריכות להיות מופעל כדי ליצור תנודות להקת גמא ב PPN ^10.

בסדרת מחקרים קבעו את המיקום של תעלות סידן סף גבוה בנוירונים HBC. הזרקת השילוב של צבעים, דימות פלואורסצנטי ratiometric הראתה ארעי סידן דרך תעלות סידן מתח מגודר אשר מופעלות דנדריטים שונים כאשר depolarized באמצעות רמפות נוכחיות ^11.

נכסים מהותיים של נוירונים של HBC הוצעו כדי לאפשר הפעלה בו זמנית של תאים אלה בזמן הערות ושנת REM, ובכך גרימת פעילות עצבית תנודתית בתדירות גבוהה בין RAS ולולאות thalamocortical. אינטראקציה כזו לכת ארוכה נחשבת תומכת במדינת מוח מסוגלת להעריך את העולם באופן מהימן סביבנו על בסיס מתמשך ^12. כאן אנו מתארים את הניסויתנאים אל צורך ליצור ולתחזק תנודת להקה גמא בתאים של HBC במבחנה. פרוטוקול זה לא תואר בעבר, ויעזור מספר הקבוצות ללמוד תכונות הממברנה פנימיות בתיווך פעילות להקת גמא ב אזורי מוח אחרים. יתר על כן, צעדים נוכחיים עשויים להוביל למסקנה המוטעית כי פעילות להקת גמא לא יכולה להיוצר בתאים אלה.

Protocol

כל פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש מאוניברסיטת ארקנסו למדעי הרפואה (# מספר פרוטוקול 3593) והם היו תמימי דעים עם ה- National Institutes of הנחיות בריאות לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה.

1. הכנת הנוזל השדרתי תקן-מלאכותי (aCSF)

1. הכנת מאגר הפתרון
   1. להוסיף 700 מ"ל מים מזוקקים מבחנה 1 L נקי לפני הוספת כימיקלים.
   2. תוך ערבוב נפח ברציפות של 500 מ"ל, להוסיף 136.75 גרם של NaCl, 6.99 גרם של KCl, 2.89 גרם של MgSO _4, ו 2.83 גרם של לאא ₂ PO _4.
   3. מוסיפים מים מזוקקים יותר להגיע נפח סופי של 1 ל לאחר דילול, את הריכוז הסופי של כל המתחם הוא 117 מ"מ NaCl, 4.69 מ"מ KCl, 1.2 מ"מ MgSO _4, ו 1.18 מ"מ לאא ₂ PO _4.
   4. יש לשמור בקירור ב 4 ° C עד 2 שבועות.
2. הכנת מאגר הפתרון B
   1. להוסיף 700 מ"ל מים מזוקקים מבחנה 1L נקי לפני הוספת כימיקלים.
   2. תוך ערבוב נפח ברציפות של 500 מ"ל, להוסיף 41.45 גרם של D-גלוקוז 41.84 גרם של NaHCO _3.
   3. מוסיפים מים מזוקקים יותר להגיע נפח סופי של 1 ל לאחר דילול, את הריכוז הסופי של כל המתחם הוא 11.5 מ"מ D- גלוקוז ו -24.9 מ"מ NaHCO _3.
   4. יש לשמור בקירור ב 4 ° C עד 2 שבועות.
   5. לפני כל תערובת הניסוי 50 מ"ל של המניה עם 50 מ"ל המניה B ומביאים 1 ליטר עם מים מזוקקים כדי להשיג פתרון aCSF הריכוז הסופי ולהשאיר ב RT בעוד ברציפות מחמצנים אותו עם carbogen (95% O ₂ - 5% CO ₂ תערובת) לפחות 30 דקות. כן aCSF לריכוז סופי רק בתחילת כל ניסוי וזורק בסוף היום.

2. הכנת הנוזל השדרתי סוכרוז-מלאכותית(סוכרוז-aCSF)

1. הכנת מאגר הפתרון C
   1. להוסיף 700 מ"ל מים מזוקקים מבחנה 1 L נקי לפני הוספת כימיקלים.
   2. תוך ערבוב רציף 500 מ"ל מים מזוקקים, להוסיף 240 גרם של סוכרוז, 6.55 גרם של ₃ NaHCO, 0.671 גרם של KCl, 4.88 גרם של MgCl _2, 0.22 גר 'CaCl ₂ ו 0.21 גרם של חומצה אסקורבית.
   3. מוסיפים מים מזוקקים יותר להגיע נפח סופי של 1 ל לאחר דילול, את הריכוז הסופי של כל המתחם הוא סוכרוז 701.1 מ"מ, 78 מ"מ ₃ NaHCO, 9 מ"מ KCl, 24 מ"מ MgCl _2, 1.5 מ"מ CaCl ₂ ו -1.2 מ"מ חומצה אסקורבית .
   4. שמור C פתרון המניה ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
   5. לפני כל תערובת הניסוי 300 מ"ל של 50 מ"ל של C המניות עם 600 מ"ל מים מזוקקים כדי להשיג את הפתרון סוכרוז-aCSF בריכוז הסופי ולהשאיר ב RT בעוד ברציפות מחמצנים אותו עם carbogen (95% O ₂ - 5% CO ₂ תערובת) לפחות 30 דקות.

3. הכנת Slice

1. מניחים כוס נקי עם 100 מ"ל תמיסת סוכרוז-aCSF בקרח תוך חמצון זה עם carbogen ולתקן את ה- pH 7.4 באמצעות מד pH תוך הוספת כמה טיפות של 0.1 פתרון M NaOH (כאשר pH <7.4) או 0.1 פתרון M HCl (כאשר pH> 7.4).
2. מלאו את תא חיתוך של vibratome עם-aCSF סוכרוז חמצן זה. הפעל את מערכת הקירור מבוסס גליצרול מצמידה את תא החיתוך ולחכות 15 דקות כדי לאפשר לו להתקרר ל 4 - 0 ° C.
3. להרדים גורי חולדה (בגילאי 9 עד 12 ממבוגר מתוזמן בהריון חולדות Sprague-Dawley) עם קטמין (70 מ"ג / ק"ג, IP; באמצעות <50 μl נפח סופי). כאשר הגור הוא רגוע, בדוק היטב כי רפלקס הזנב קמצוץ נעדר.
4. לערוף גורים.
   1. חותך את עור ראש longitudinally מן מלפנים לאחור באמצעות סכין אזמל פלדת פחמן, ולמשוך את העור לצדדים באמצעות מלקחיים. חותכים את העצם המכסה את המוח הזזת SCissors רוחבית לחלוטין להסיר אותו כדי לחשוף את המוח.
   2. ואז, במהירות להסיר את המוח בעזרת מרית (להציב תחילה תחת נורת חוש הריח כדי לדחוף את המוח בעדינות מן המקורי ביותר כלפי אזורי הזנב ביותר). דחף בעדינות את המוח לתוך הנוזל השדרתי מלאכותי סוכרוז מחומצן מקורר קרח (סוכרוז-aCSF).
5. ביצוע חתך parasagittal על האונה הימנית (הסרה כשליש האונה), ודבק בצד הגזוז של המוח על גבי דיסק מתכתי שייקבע מגנטי לתא החיתוך של vibroslicer לחתוך חלקי sagittal 400 מיקרומטר המכילים את גרעין pedunculopontine (PPN). שמור פרוסות של HBC ב RT במשך 45 דקות לפני הקלטות תיקון- clamp כל תא.

4. תנודות הקלטות גמא-band ב Slices של HBC

1. הכנת הפתרון תאי אשלגן גלוקונאט (High-K ⁺ פתרון)
   1. מניחים בקרח בכוס נקייה עם 10 מ"ל מים מזוקקים. תוך ערבוב רציף להוסיף: K ⁺ -gluconate, 90.68 מ"ג phosphocreatine di טריס מלח, 47.66 HEPES מ"ג, 1.5 מ"ג EGTA, 40.58 מ"ג Mg ²⁺ -ATP, ו -4 מ"ג Na ⁺ ₂ -GTP.
   2. התאם ל- pH 7.3 עם KOH (100 מ"מ במים מזוקקים). מוסיפים מים מזוקקים כדי להגיע נפח סופי של 20 מ"ל. במידת הצורך, להתאים osmolarity עם סוכרוז (100 מ"מ במים מזוקקים) להיות 280 - 290 mOsm. לאחר דילול, את הריכוז הסופי של כל המתחם הוא 124 מ"מ K ⁺ -gluconate, 10 מ"מ phosphocreatine di טריס מלח, 10 HEPES מ"מ, 0.2 מ"מ EGTA, 4 מ"מ Mg ²⁺ -ATP, ו -0.3 מ"מ Na ⁺ ₂ -GTP.
   3. פתרונות תאיים Aliquot ב 1 מ"ל צינורות ולהקפיא ב -20 ° C. השתמש aliquot אחד ליום ולשמור על 4 מעלות צלזיוס במהלך הניסויים.
2. הקלטות כל תא צמד תיקון
   1. מניחים פרוסות בתא טבילה ו perfuse אותם (1.5 מ"ל / דקה) עם מחומצן(95% O ₂ - 5% CO ₂₎ aCSF המכיל את אנטגוניסטים לקולטן הבאים: אנטגוניסט לרצפטור NMDA סלקטיבית חומצה 2-אמינו-5-phosphonovaleric (APV, 40 מיקרומטר), תחרותי קולטן הגלוטמט AMPA / Kainate אנטגוניסט 6-cyano-7- nitroquinoxaline-2,3-Dione (CNQX, 10μM), סטריכנין אנטגוניסט לרצפטור גליצין (STR, 10 מיקרומטר), ה GABA _{ספציפית} gabazine אנטגוניסט לקולטן (GBZ, 10 מיקרומטר), ו tetrodotoxin חוסם ערוץ נתרן (TTX, 3μM)
      הערה: התוצאות והדמויות, אנטגוניסטים אלה יכונו חוסמי הסינפטי כמו או SBS.
   2. מלא את טפטפות תיקון הקלטה (התנגדות 2-7 MΩ; עשוי קבועות, זמין נימי זכוכית בורוסיליקט קיר עבות המסחרי של 1.0 מ"מ קוטר חיצוני 0.6 מ"מ קוטר פנימי) עם פתרון גבוה K ⁺ תאי באמצעות זמינים מסחריים תופסי תיקון- פיפטה עם מסנן פתרון. הכנס את פיפטה מחזיק של המגבר שלה. למרוח קופה קטנהלחץ itive באמצעות מזרק 1 מ"ל מחובר לבעל פיפטה באמצעות צינורית סיליקון מחוברת שסתום משולשת. חבר את הגב של בעל פיפטה מגבר מהדק תיקון.
   3. הזז את פיפטה הקלטה באמצעות micromanipulator מכני ליד הגרעין של HBC באמצעות המטרה 4X בשילוב לאופטיקה התערבות ההפרש לעומת זאת האינפרה-אדום הקרוב.
      הערה: הגרעין של HBC ניתן לצפות הגבי פרוסות אל peduncle המוח הקטן המעולה (SCP; הנצפה כמו צרור עבה של אקסונים). טפטפות הקלטה אותרו PPN pars compacta, הנמצא מיד הגב עד הסוף האחורי של peduncle.
   4. תביא פיפטה ההקלטה במגע עם הנוירון של HBC בעוד דמיין באמצעות עדשת טבילה במים 40X, במהירות להחיל יניקה שלילית כדי ליצור חותם עם התא.
   5. השתמש בתוכנה חותמת מתח- clamp לפקח התנגדות פיפטה במהלך יניקה שלילית באמצעות הפרוטוקול של היצרן.
      1. כאשר s שליליuction הוא גדל לאט ערכי התנגדות יושבים וקוראים ליד צג תיקון- clamp על קצה פיפטה להגיע 80 - 100 mOhm, במהירות לשנות את פוטנציאל ההחזקה כדי -50 mV ולשחרר את הלחץ השלילי. התחל ברציפויות החלת יניקה שלילית עד פקיעת גישת הקרום והחשמלי של נוירון מושגת בתצורת כל התא.
      2. אם ערכי התנגדות הגישה נמדדו על ידי התוכנה חותם מתח- הידוק 10 mOhm ומעלה, ואז להמשיך וליישם יניקה שלילית בכמויות קטנות יותר.
   6. לפצות קיבול (כלומר, הארעיים איטיים ומהירים ציינו לאחר פקיעת הקרום של התא) והתנגדות סדרה במצב מתח- clamp. חלף מצב הקלטת מהדק נוכחי, ולפצות ערכי גשר במהירות (למשל, להעביר ידית מגבר או לחץ על תפריט הפיצוי האוטומטי באמצעות עכבר computer's).
      1. לפקח באופן רציף פוטנציאל הממברנה במנוחה של נוירון PPN מוקלט uלשיר פרוטוקול של היצרן. אם נחים משמרת פוטנציאל הממברנה לערכים depolarizing או hyperpolarizing, אז השתמשו בכמות קטנה של זרם חשמלי קבוע (עד 100 PA) כדי לשמור על הערך הסופי אופטימלי -50 mV.
         הערה: שמור נוירונים של HBC רק עם פוטנציאל הממברנה המנוחה יציבה (RMP) של -48 mV או יותר hyperpolarized (כלומר, RMP <-48 mV).

תוצאות

בתחילה, תנודות גמא היו עוררות באמצעות פולסים נוכחי רבוע. הקלטת מהדק הנוכחית של נוירונים של HBC בנוכחות חוסמי הסינפטי TTX הייתה פיקוח רציף על מנת להבטיח כי פוטנציאל הממברנה נח נשמר יציבות ב ~ -50 mV (איור 1 א). שני פולסים נוכחיים שניים ארוכים מרובעי?...

Discussion

יש PPN נוירונים נכסים מהותיים המאפשרים להם לירות פוטנציאל פעולה בתדרי להקה בטא / גמא במהלך הקלטות vivo ב מחיות שהן ערות או במהלך שנת רע"מ, אבל לא בזמן שנת גל איטי ^2,3,5,13-17. חוקרים אחרים הראו transections גזע המוח כי יותר רמות קדמיות מאשר PPN מופחת תדרי גמא במהלך הקלטות E...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501	C12H22O11, molecular weight = 342.30
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014	NaHCO3, molecular weight = 84.01
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911	KCl, molecular weight = 74.55
Magnesium Chloride Hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272	MgCl2 · 6H2O, molecular weight =  203.30
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma-Aldrich	C3881	CaCl2 · 2H2O, molecular weight =147.02
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	C6H12O6, molecular weight = 180.16
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A5960	C6H8O6, molecular weight =176.12
Sodium Chloride	Acros Organics	327300025	NaCl, molecular weight =  58.44
Potassium Gluconate	Sigma-Aldrich	G4500	C6H11KO7, molecular weight =  234.25
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma-Aldrich	P1937	C4H10N3O5P · 2C4H11NO3, molecular weight =  453.38
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	C8H18N2O4S, molecular weight = 238.30
EGTA	Sigma-Aldrich	E0396	[-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2, molecular weight = 380.40
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma-Aldrich	A9187	C10H16N5O13P3 · xMg2+, molecular weight = 507.18
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G8877	C10H16N5O14P3 · xNa+, molecular weight = 523.18
Tetrodotoxin citrate	Alomone Labs	T-550	C11H17N3O8, molecular weight = 319.27
DL-2-Amino-5-Phosphonovaleric Acid	Sigma-Aldrich	A5282	C5H12NO5P, molecular weight = 197.13
CNQX disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	C239	C9H2N4Na2O4 · xH2O, molecular weight = 276.12
Strychnine	Sigma-Aldrich	S0532	C21H22N2O2, molecular weight = 334.41
Mecamylamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	M9020	C11H21N · HCl, molecular weight = 203.75
Gabazine (SR-95531)	Sigma-Aldrich	S106	C15H18BrN3O3, molecular weight = 368.23
Ketamine hydrochloride	Mylan	67457-001-00
Microscope	Nikon	Eclipse E600FN
Micromanipulator	Sutter Instruments	ROE-200
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
A/D converter	Molecular Devices	Digidata 1440A
Heater	Warner Instruments	TC-324B
Pump	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
Pump cartridge	Cole-Parmer	Masterflex 7519-85
Pipette puller	Sutter Instruments	P-97
Camera	Q-Imaging	RET-200R-F-M-12-C
Vibratome	Leica Biosystems	Leica VT1200 S
Refrigeration system	Vibratome Instruments	900R
Equipment
microscope	Nikon	Eclipse E600FN
micromanipulator	Sutter Instruments	ROE-200
micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
A/D converter	Molecular Devices	Digidata 1440A
heater	Warner Instruments	TC-324B
pump	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
pump cartridge	Cole-Parmer	Masterflex 7519-85
pipette puller	Sutter Instruments	P-97
camera	Q-Imaging	RET-200R-F-M-12-C