Recording Gamma-Band-Oszillationen in Nucleus pedunculopontinus Neurons

Zusammenfassung

Der Nucleus pedunculopontinus (PPN) wird in der Hirnstamm und seine Neuronen befinden sich maximal aktiviert während des Wachens und schnelle Augenbewegungen (REM) Schlaf Gehirnzustände. Diese Arbeit beschreibt die experimentellen Ansatz in vitro Gamma - Band unterschwelligen Membran Schwingung in PPN Neuronen aufzuzeichnen.

Zusammenfassung

Synaptischen efferents aus dem PPN bekannt , um die neuronale Aktivität von mehreren intralaminaren thalamischen Regionen zu modulieren (beispielsweise der zentrolateralen / parafascicular; Cl / Pf Kern). Die Aktivierung entweder des PPN oder Cl / Pf Kerne in vivo beschrieben worden , um die Erregung des Tieres und ein Inkrement in gamma - Band - Aktivität im kortikalen Elektroenzephalogramm (EEG) zu induzieren. Die zellulären Mechanismen für die Erzeugung von gamma Bandschwingungen in retikulären aktivierenden System (RAS) Neurone sind die gleichen wie diejenigen zu finden gamma Band Schwingungen in anderen Gehirnen Kerne erzeugen. Während Strom-Clamp Messungen von PPN Neuronen (von parasagittal Scheiben 9-25 Tage alte Ratten), die Verwendung von depolarisierenden quadratischen Schritte schnell spannungsabhängige Kaliumkanäle aktiviert, die PPN verhindert Neuronen von über -25 mV depolarisiert wird.

Injizieren von 1 bis 2 Sekunden lang depolarisierende Stromrampen depolarisiert allmählich PPN Membranpotential resting-Werte auf 0 mV. Jedoch Injizieren depolarisierende Rechteckimpulse erzeugt gamma-Band Oszillationen des Membranpotentials, die in der Amplitude kleiner zeigten im Vergleich zu den durch Rampen erzeugten Schwingungen. Alle Experimente wurden in Gegenwart von spannungsgesteuerten Natriumkanäle und schnelle synaptische Rezeptoren-Blocker durchgeführt. Es hat sich gezeigt, dass die Aktivierung von Hochschwellenspannungsabhängigen Calciumkanälen gamma-band oszillatorischen Aktivität in PPN Neuronen zugrundeliegen. Spezifische methodische und pharmakologische Interventionen sind hier beschrieben, die notwendigen Werkzeuge zur Verfügung stellt PPN in vitro unterschwelligen Gamma - Band Schwingung zu induzieren und aufrechtzuerhalten.

Einleitung

PPN Kern ist anatomisch in der Schwanz mesencephalen tegmentum enthalten. Die PPN ist eine Schlüsselkomponente der RAS ^1. Die PPN beteiligt sich an der Aufrechterhaltung von Verhaltens aktivierten Zustände (dh dem Aufwachen, REM - Schlaf) ^2. Elektrische Stimulation des PPN in vivo induziert schnelle Oszillation (20 bis 40 Hz) in dem kortikalen EEG ^3, während bilaterale PPN Läsionen in Ratten reduziert oder eliminiert REM sleep ^4. Während eine Mehrheit der PPN Neuronen Aktionspotenziale feuern bei Beta / Gamma-Band - Frequenz (20 - 80 Hz), einige Neuronen niedrige Raten von spontanen Feuer präsentiert (<10 Hz) ^5. Darüber hinaus scheint die PPN in anderen Aspekten des Verhaltens beteiligt zu sein wie Motivation und Aufmerksamkeit ^6. Direkte Hochfrequenz (40 - 60 Hz) ⁷ elektrische Stimulation von PPN Kern in decerebrate Tiere können die Fortbewegung zu fördern. In den letzten Jahren hat sich die tiefe Hirnstimulation (DBS) von PPN verwendet, um Patienten zu behandeln, Leiden from Erkrankungen mit Gang Defizite wie Parkinson-Krankheit (PD) ^8.

Frühere Berichte zeigten , dass fast alle PPN Neuronen Aktionspotentiale bei Gamma - Band - Frequenz feuern kann , wenn ⁹ mit quadratischen Stromimpulse depolarisiert. Wegen der drastischen Aktivierung von spannungsgesteuerten Kaliumkanäle während der Rechteckimpulse Depolarisationen bis zu oder unter -25 mV. Als Folge wurden Tetrodotoxin ¹⁰ nach der Blockierung Aktionspotentiale Generation mit keine belastbaren Gamma - Oszillationen beobachtet. In dem Bemühen, dieses Problem zu umgehen, 1 - 2 sec lang Stromrampen depolarisierende wurden verwendet. Ramps depolarisiert allmählich das Membranpotential von Werten von bis zu 0 mV ruhen, während sie teilweise spannungsgesteuerte Kanäle Kalium inaktivieren. Klare gamma Band Membran Oszillationen waren evident in der Spannungsabhängigkeit Fenster der hohen Schwellencalciumkanäle (dh zwischen -25 mV und -0 mV) ^10. Abschließend Gamma-Band activity wurde müssen in PPN Neuronen ^9, und beide P / Q- und N-Typ - spannungsabhängigen Calciumkanälen beobachtet , um aktiviert zu werden , um Gammabandschwingungen im PPN ¹⁰ erzeugen.

Eine Reihe von Studien bestimmt die Position des hohen Schwellencalciumkanäle in PPN Neuronen. Injizieren der Kombination von Farbstoffen, ratiometrisch Fluoreszenzabbildung zeigte Calciumtransienten durch spannungsabhängige Calciumkanäle , die in unterschiedlichen Dendriten aktiviert werden , wenn ¹¹ unter Verwendung von Stromrampen depolarisiert.

Intrinsischen Eigenschaften von PPN Neuronen wurden vorgeschlagen im Wachzustand und REM-Schlaf gleichzeitige Aktivierung dieser Zellen zu ermöglichen, so dass der Hochfrequenz neuronaler Aktivität zwischen RAS und thalamokortikalen Schleifen induziert. Solche langreichende Interaktion gilt als die Welt um uns die Beurteilung auf einer kontinuierlichen Basis ¹² einen Gehirnzustand der Lage , zuverlässig zu unterstützen. Hier beschreiben wir das Experimental notwendigen Bedingungen zu erzeugen , und Gamma - Band Schwingung in PPN - Zellen in vitro aufrechtzuerhalten. Dieses Protokoll wurde bisher nicht beschrieben, und würde eine Anzahl von Gruppen Hilfe Eigenschaften intrinsischen Membranaktivität vermittelnden gamma-Bande bei anderen Gehirnbereichen zu untersuchen. Außerdem könnte von der aktuellen Schritte zum falschen Schluss führen, dass Gamma-Band-Aktivität kann nicht in diesen Zellen erzeugt werden.

Protokoll

Alle experimentellen Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Arkansas for Medical Sciences (Protokollnummer # 3593) und waren in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt.

1. Herstellung von Standard künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF)

1. Vorbereitung der Stammlösung A
   1. In 700 ml destilliertem Wasser in einen sauberen 1-Liter-Becher vor Zusatz von Chemikalien.
   2. Während kontinuierlich ein Volumen von 500 ml unter Rühren 136,75 g NaCl, 6,99 g KCl, 2,89 g MgSO ₄ und 2,83 g NaH ₂ PO ₄ hinzuzufügen.
   3. Noch ein destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1 l Nach der Verdünnung zu erreichen, wird die Endkonzentration jeder Verbindung ist 117 mM NaCl, 4,69 mM KCl, 1,2 mM MgSO ₄ und 1,18 mM NaH ₂ PO _4.
   4. Halten bei 4 ° C gekühlt für bis zu 2 Wochen.
2. Herstellung von Stammlösung B
   1. In 700 ml destilliertem Wasser in einen sauberen 1 l Becherglas vor Zusatz von Chemikalien.
   2. Während kontinuierlich ein Volumen von 500 ml Rühren wird 41,45 g D-Glucose und 41,84 g NaHCO _3.
   3. In mehr destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1 L. Nach der Verdünnung zu erreichen, ist die endgültige Konzentration jeder Verbindung 11,5 mM D-Glucose und 24,9 mM NaHCO _3.
   4. Halten bei 4 ° C gekühlt für bis zu 2 Wochen.
   5. Vor jedem Versuch Mix 50 ml Lager A mit 50 ml Lager B und bringen auf 1 Liter mit destilliertem Wasser bis zur endgültigen Konzentration aCSF Lösung erhalten und bei RT verlassen , während sie kontinuierlich mit Carbogen mit Sauerstoff (95% O _{2 bis 5%} CO ₂ mix) für mindestens 30 min. Vorbereitung Endkonzentration aCSF nur zu Beginn jedes Experiments und entsorgen am Ende des Tages.

2. Herstellung von Sucrose-künstliche Zerebrospinalflüssigkeit(Sucrose-aCSF)

1. Herstellung von Stammlösung C
   1. In 700 ml destilliertem Wasser in einen sauberen 1-Liter-Becher vor Zusatz von Chemikalien.
   2. Während kontinuierlich 500 ml destilliertem Wasser gerührt wurde, fügen Sie 240 g Saccharose, 6,55 g NaHCO _3, 0,671 g KCl, 4,88 g MgCl _2, 0,22 g CaCl ₂ und 0,21 g Ascorbinsäure.
   3. In mehr destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1 L. Nach der Verdünnung zu erreichen, ist die endgültige Konzentration jeder Verbindung 701,1 mM Saccharose, 78 mM NaHCO _3, 9 mM KCl, 24 mM MgCl _2, 1,5 mM CaCl ₂ und 1,2 mM Ascorbinsäure .
   4. Halten Sie Stammlösung C bei 4 ° C bis zu einer Woche.
   5. Vor jedem Versuch Mischung 300 ml 50 ml Stamm C mit 600 ml destilliertem Wasser , um die Saccharose-aCSF Lösung bei der Endkonzentration erhalten und bei RT verlassen , während kontinuierlich mit Sauerstoff mit Carbogen (95% O _{2 bis 5%} CO ₂ mix) für mindestens 30 min.

3. Scheibe Vorbereitung

1. Legen Sie einen sauberen Becher mit 100 ml Saccharose-aCSF Lösung in Eis, während es mit Carbogen mit Sauerstoff und befestigen Sie den pH-Wert bei 7,4 mit einem pH-Meter unter Zugabe einiger Tropfen 0,1 M NaOH-Lösung (bei pH <7,4) oder 0,1 M HCl-Lösung (wenn pH> 7,4).
2. Füllen Sie eine Schneidkammer eines Vibratom mit Saccharose-aCSF und oxigenieren. Schalten Sie das Glycerinbasis Kühlsystem an der Schneidkammer gekoppelt und 15 Minuten warten, damit sie auf 0 bis abkühlen - 4 ° C.
3. Anesthetize Rattenjungen ( im Alter von 9 bis 12 aus adulten timed-schwangere Sprague-Dawley - Ratten) mit Ketamin (70 mg / kg, ip, mit <50 & mgr; l Endvolumen). Wenn Welpe ruhig ist, überprüfen Sie das Doppelte Schwanz Prise Reflex fehlt.
4. Enthaupten Welpen.
   1. Schneiden Sie die Kopfhaut in Längsrichtung von der Vorderseite mit einem Kohlenstoffstahl Skalpellklinge zurück, und ziehen Sie die Haut an den Seiten mit einer Pinzette. Schneiden Sie den Knochen bedeckt das Gehirn die Bewegung des scissors seitlich und es vollständig zu entfernen, das Gehirn zu belichten.
   2. Entfernen Sie dann schnell das Gehirn mit einem Spatel (zunächst unter dem Riechkolben gelegt, um sanft das Gehirn aus dem die meisten rostral zu den kaudalste Bereiche schieben). Drücken Sie vorsichtig auf das Gehirn in eisgekühlte mit Sauerstoff angereicherte Saccharose-künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (Saccharose-aCSF).
5. Machen Sie einen parasagittal Schnitt auf der rechten Hemisphäre (etwa ein Drittel der Halbkugel zu entfernen), und kleben Sie die getrimmten Seite des Gehirns auf eine Metallscheibe, die an der Schneidkammer eines vibroslicer magnetisch fixiert werden sagittale 400 um Abschnitte enthält, die zu schneiden pedunculopontinus Kern (PPN). Halten Sie PPN Scheiben bei RT für 45 min vor der Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen.

4. Recordings Gamma-Band-Oszillationen in PPN Scheiben

1. Herstellung von Kalium-Gluconat intrazellulärer Lösung (High-K ⁺ Solution)
   1. Platzieren Sie inEis ein sauberes Becherglas mit 10 ml destilliertem Wasser. Unter ständigem Rühren hinzufügen: K ⁺ -gluconat, 90,68 mg phosphocreatine di Tris - Salz, 47,66 mg HEPES, 1,5 mg EGTA, 40,58 mg Mg ²⁺ -ATP und 4 mg Na ⁺ ₂ -GTP.
   2. PH-Wert auf 7,3 mit KOH (100 mM in destilliertem Wasser). Destilliertes Wasser, um ein Endvolumen von 20 ml zu erreichen. Passen Sie bei Bedarf die Osmolarität mit Saccharose (100 mM in destilliertem Wasser) 280 sein - 290 mOsm. Nach der Verdünnung die Endkonzentration jeder Verbindung beträgt 124 mM K ⁺ -gluconat, 10 mM Phosphocreatin di - Tris - Salz, 10 mM HEPES, 0,2 mM EGTA, 4 mM Mg ²⁺ -ATP und 0,3 mM Na ⁺ ₂ -GTP.
   3. Aliquotieren intrazellulären Lösungen in 1-ml-Röhrchen und gefrier bei -20 ° C. Verwenden Sie eine aliquote Menge pro Tag und halten bei 4 ° C während der Experimente.
2. Whole-Cell - Patch - Clamp - Aufnahmen
   1. Die Scheiben in einer Tauchkammer und perfundieren ihnen (1,5 ml / min) mit sauerstoff(95% O _{2 bis 5%} CO ₂₎ aCSF enthält die folgenden -Rezeptorantagonisten: selektive NMDA - Rezeptorantagonisten 2-Amino-5-phosphonovaleric Säure (APV, 40 uM), wettbewerbsfähige AMPA / Kainat Glutamat - Rezeptor - Antagonisten 6-cyano-7- nitrochinoxalin-2,3-dion (CNQX, 10 uM), Glycin - Rezeptor - Antagonist Strychnin (STR, 10 & mgr; M), dem spezifischen GABA - _A - Rezeptor - Antagonist Gabazin (GBZ, 10 & mgr; M) und Natriumkanalblocker Tetrodotoxin (TTX, 3 uM)
      HINWEIS: In den Ergebnissen und Zahlen werden diese Antagonisten zusammen als synaptischen Blocker oder SBs bezeichnet.
   2. Füllen Sie die Aufnahme Patch - Pipetten (Resistance 2-7 MOhm, aus regelmäßigen, im Handel erhältliche dicke Wand Borosilicatglas Kapillaren von 1,0 mm Außendurchmesser und 0,6 mm Innendurchmesser) mit intrazellulären High-K ⁺ Lösung im Handel erhältliche Patch-Pipette Füllstoffe mit einer unter Verwendung von Lösungsfilter. Legen Sie die Pipette in seinem Verstärker des Inhabers. Tragen Sie eine kleine positive Druck eine 1 ml Spritze mit dem Pipettenhalter mit einem Silikonschlauch mit einem Dreiwegeventil verbunden werden. Schließen Sie die Rückseite des Pipettenhalters an einem Patch-Clamp-Verstärker.
   3. Bewegen Sie die Aufnahme Pipette einen mechanischen Mikromanipulator in der Nähe des PPN Kern mit einem 4X-Objektiven kombiniert, um im nahen Infrarot Differentialinterferenzkontrastoptik verwendet wird.
      HINWEIS: PPN Kern kann in Scheiben dorsal der oberen Kleinhirnstiels beobachtet werden (SCP; beobachtbaren als ein dickes Bündel von Axonen). Aufzeichnungspipetten wurden in dem PPN pars compacta befindet, der unmittelbar an dem hinteren Ende des Stieles dorsal befindet.
   4. Bringen Sie die Aufnahme Pipette in Kontakt mit einem Neuron PPN während visualisiert eine 40X Wassertauchobjektiv und wenden sich schnell negativ Sog eine Dichtung mit der Zelle zu bilden.
   5. Verwenden Sie Voltage-Clamp Dichtung Software Pipette Widerstand während des negativen Sog mit Herstellerprotokoll zu überwachen.
      1. Wenn negativ suction langsam erhöht und Widerstandswerte von der Patch-Clamp-Monitor an der Spitze der Pipette 80 zu lesen erreichen - 100 MOhm das Haltepotential mV ändern, schnell bis -50 und den negativen Druck freigeben. Starten Sie kontinuierlich negativ abgesaugt wird, bis der Neuron-Membran und elektrische Aufreißen Zugang in der Gesamtzellkonfiguration erreicht wird.
      2. Wenn der Zugriff Widerstandswerte von der Voltage-Clamp Dichtung Software gemessen 10 MOhm oder höher sind, dann weiter negativen Sog Mengen in kleinere Anwendung.
   6. Kompensieren Kapazität (dh langsame und schnelle Transienten beobachtet , nachdem die Membran der Zelle Zerreißen) und Reihenwiderstand in Voltage-Clamp - Modus. Schalten Sie den Aufnahmemodus zu Stromzange und kompensieren schnell Brücke Werte (zB bewegen Verstärker - Regler oder klicken Sie auf das Menü automatische Kompensation mit Rechners Maus).
      1. Kontinuierlich zu überwachen Ruhemembranpotentials von PPN Neuron wird u aufgezeichnetsingen Protokoll des Herstellers. Wenn das Membranpotential Verschiebung in Richtung depolarisierende oder hyperpolarisierender Werte ruhen, dann kleine Mengen von Gleichstrom (bis zu 100 pA) die optimale -50 mV Endwert zu halten.
         HINWEIS: Nur PPN Neuronen mit einer stabilen Ruhemembranpotential (RMP) von -48 mV oder mehr hyperpolarisierten (dh RMP <-48 mV).

Ergebnisse

Zunächst Gamma-Oszillationen wurden unter Verwendung von quadratischen Stromimpulse hervorgerufen. Current clamp Aufzeichnung von PPN Neuronen in Gegenwart von synaptischen Blockern und TTX wurde kontinuierlich überwacht , um sicherzustellen , dass Ruhemembranpotential stabil gehalten wurde bei ~ -50 mV (1A). Zwei zweite lange Rechteckstromimpulse wurden intrazellulär durch die Patch - Clamp - Verstärkers durch die Aufzeichnungspipette injiziert, die Erhöhung ihrer ...

Diskussion

PPN Neuronen intrinsische Eigenschaften, die sie während der Aktionspotentiale in vivo - Aufnahmen von Tieren bei Beta / Gamma - Band - Frequenzen zu feuern lassen , die wach sind oder während des REM - Schlaf, aber nicht während der langsamen Welle Schlaf ^2,3,5,13-17. Andere Autoren haben gezeigt, dass brainstem Querschnitten erhalten bei mehreren vorderen Ebenen zeigte als PPN Gamma Frequenzen während EEG-Aufzeichnungen reduziert. Wenn jedoch brainstem Läsionen posterior, wo dieser Kern befind...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501	C12H22O11, molecular weight = 342.30
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014	NaHCO3, molecular weight = 84.01
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911	KCl, molecular weight = 74.55
Magnesium Chloride Hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272	MgCl2 · 6H2O, molecular weight =  203.30
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma-Aldrich	C3881	CaCl2 · 2H2O, molecular weight =147.02
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	C6H12O6, molecular weight = 180.16
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A5960	C6H8O6, molecular weight =176.12
Sodium Chloride	Acros Organics	327300025	NaCl, molecular weight =  58.44
Potassium Gluconate	Sigma-Aldrich	G4500	C6H11KO7, molecular weight =  234.25
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma-Aldrich	P1937	C4H10N3O5P · 2C4H11NO3, molecular weight =  453.38
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	C8H18N2O4S, molecular weight = 238.30
EGTA	Sigma-Aldrich	E0396	[-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2, molecular weight = 380.40
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma-Aldrich	A9187	C10H16N5O13P3 · xMg2+, molecular weight = 507.18
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G8877	C10H16N5O14P3 · xNa+, molecular weight = 523.18
Tetrodotoxin citrate	Alomone Labs	T-550	C11H17N3O8, molecular weight = 319.27
DL-2-Amino-5-Phosphonovaleric Acid	Sigma-Aldrich	A5282	C5H12NO5P, molecular weight = 197.13
CNQX disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	C239	C9H2N4Na2O4 · xH2O, molecular weight = 276.12
Strychnine	Sigma-Aldrich	S0532	C21H22N2O2, molecular weight = 334.41
Mecamylamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	M9020	C11H21N · HCl, molecular weight = 203.75
Gabazine (SR-95531)	Sigma-Aldrich	S106	C15H18BrN3O3, molecular weight = 368.23
Ketamine hydrochloride	Mylan	67457-001-00
Microscope	Nikon	Eclipse E600FN
Micromanipulator	Sutter Instruments	ROE-200
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
A/D converter	Molecular Devices	Digidata 1440A
Heater	Warner Instruments	TC-324B
Pump	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
Pump cartridge	Cole-Parmer	Masterflex 7519-85
Pipette puller	Sutter Instruments	P-97
Camera	Q-Imaging	RET-200R-F-M-12-C
Vibratome	Leica Biosystems	Leica VT1200 S
Refrigeration system	Vibratome Instruments	900R
Equipment
microscope	Nikon	Eclipse E600FN
micromanipulator	Sutter Instruments	ROE-200
micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
A/D converter	Molecular Devices	Digidata 1440A
heater	Warner Instruments	TC-324B
pump	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
pump cartridge	Cole-Parmer	Masterflex 7519-85
pipette puller	Sutter Instruments	P-97
camera	Q-Imaging	RET-200R-F-M-12-C