Gravação Gama Oscilações banda em pedunculopontino Núcleo Neurônios

Resumo

O núcleo pedunculopontino (PPN) está localizado no tronco cerebral e seus neurônios são maximamente ativado durante a vigília e movimento rápido dos olhos (REM) do cérebro sono estados. Este trabalho descreve a abordagem experimental para gravar em oscilação vitro membrana subliminares banda gama em neurônios PPN.

Resumo

Eferentes sinápticos de PPN são conhecidas por modular a actividade neuronal das várias regiões talâmicos intralaminares (por exemplo, o centrolateral / parafascicular; Cl / Pf núcleo). A activação quer do PPN ou núcleos Cl / pf in vivo tem sido descrito para induzir a estimulação do animal e um aumento na actividade de banda na gama cortical electroencefalograma (EEG). Os mecanismos celulares para a geração de oscilações da banda gama de sistema ativando reticular (RAS) neurónios são os mesmos que aqueles encontrados para gerar oscilações banda gama de outros núcleos cérebros. Durante gravações corrente-clamp de neurónios PPN (a partir de fatias de parassagitais 9 - ratos 25 dias de idade), a utilização de medidas de despolarização quadrados activado rapidamente os canais de potássio dependentes da voltagem que impediram neurónios PPN seja despolarizada além de -25 mV.

Injectar 1 - 2 seg longo despolarização rampas atuais gradualmente despolarizado PPN potencial de membrana resting valores na direção de 0 mV. No entanto, injetáveis ​​despolarizantes pulsos quadrados gerado oscilações gama-banda de potencial de membrana que se mostraram menores em amplitude em comparação com as oscilações geradas por rampas. Todas as experiências foram realizadas na presença de canais de sódio dependentes da voltagem e rápidos bloqueadores dos receptores sinápticos. Tem sido demonstrado que a activação dos canais de cálcio dependentes da voltagem de limiar elevado subjacentes actividade oscilatório gama-banda em neurónios PPN. Intervenções metodológicas e farmacológicos específicos são descritos aqui, fornecendo as ferramentas necessárias para induzir e manter PPN subliminares oscilação banda gama in vitro.

Introdução

PPN núcleo está anatomicamente incluídos no tegmento mesencefálico caudal. O PPN é um componente chave da RAS ^1. O PPN participa na manutenção de estados ativados comportamentais (ou seja, de vigília, o sono REM) ^2. A estimulação elétrica do PPN in vivo induzida oscilação rápida (20 - 40 Hz) no EEG cortical ^3, enquanto lesões bilaterais PPN no rato reduzidos ou eliminados sono REM ^4. Enquanto a maioria dos neurônios PPN disparar potenciais de ação em frequência beta / gama-band (20 - 80 Hz), alguns neurônios apresentou baixas taxas de queima espontânea (<10 Hz) ^5. Além disso, o PPN parece estar envolvido em outros aspectos do comportamento, tais como motivação e atenção ^6. Alta freqüência direta (40 - 60 Hz) ⁷ estimulação elétrica do núcleo PPN em animais decerebrate pode promover a locomoção. Nos últimos anos, a estimulação cerebral profunda (DBS) de PPN tem sido utilizado para tratar pacientes que sofrem frodistúrbios m envolvendo défices da marcha, tais como a doença de Parkinson (DP) ^8.

Relatórios anteriores demonstraram que quase todos os neurônios PPN pode disparar potenciais de ação na frequência da banda de gama quando despolarizado usando pulsos de corrente quadrados ^9. Devido à activação drástica dos canais de potássio dependentes de voltagem durante pulsos quadrados despolarizações até ou menos de -25 mV. Como consequência, há oscilações gama robustas foram observados após o bloqueio geração de potenciais de ação usando tetrodotoxina ^10. Em um esforço para contornar tal problema, 1 - foram utilizados 2 seg longo despolarização rampas atuais. Rampas gradualmente despolarizado o potencial de membrana a partir de valores de repouso até 0 mV, enquanto inativar parcialmente canais de potássio dependentes de voltagem. Oscilações da membrana banda gama claras foram evidentes dentro da janela dependência da voltagem dos canais de cálcio limiar elevado (isto é, entre -25 mV e -0 mV) ^10. Em conclusão, a banda gama activiTy foi observada em neurónios PPN ^9, e ambos P / Q e canais de cálcio dependentes da voltagem de tipo N precisa de ser activado, a fim de gerar oscilações da banda gama na PPN ^10.

Uma série de estudos determinou-se a localização dos canais de cálcio limiar elevado em neurónios PPN. Injetando a combinação de corantes, imagens de fluorescência ratiometric mostrou transientes de cálcio através de canais de cálcio dependentes da voltagem que são ativados em diferentes dendrites quando despolarizado usando rampas atuais ^11.

propriedades intrínsecas de neurónios PPN têm sido sugeridos para permitir a activação simultânea dessas células durante a vigília e sono REM, induzindo, assim, a actividade neuronal oscilatória de alta frequência entre o RAS e lacetes tálamo. Tal interação de longo alcance é considerado para apoiar um estado cerebral capaz de avaliar de forma confiável o mundo em torno de nós em uma base contínua ^12. Aqui, descrevemos o experimentoal condições necessárias para gerar e manter a gama da banda de oscilação em células in vitro PPN. Este protocolo não foi descrito anteriormente, e ajudaria um número de grupos para estudar as propriedades de membrana intrínsecas que medeiam a actividade banda gama a outras áreas do cérebro. Além disso, os passos atuais poderia levar à conclusão errônea de que a atividade banda gama não pode ser gerada nestas células.

Protocolo

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Arkansas para Ciências Médicas (número Protocolo # 3593) e estavam de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde diretrizes para o cuidado e uso de animais de laboratório.

1. Preparação do líquido cefalorraquidiano Standard-artificial (aCSF)

1. Preparação da Solução A de
   1. Adicionar 700 ml de água destilada para uma proveta de 1 L limpo antes da adição de produtos químicos.
   2. Enquanto agitando continuamente um volume de 500 ml, adicionar 136,75 g de NaCl, 6,99 g de KCl, 2,89 g de _MgSO4, e 2,83 g de NaH ₂ PO _4.
   3. Adicionar mais água destilada para atingir um volume final de 1 L. Depois da diluição, a concentração final de cada composto é de NaCl a 117 mM, KCl 4,69 mM, 1,2 mM de _MgSO4, e 1,18 mM de NaH ₂ PO _4.
   4. Manter refrigerado a 4 ° C durante até 2 semanas.
2. Preparação de Solução Stock B
   1. Adicionar 700 ml de água destilada para uma proveta de 1 L limpo antes da adição de produtos químicos.
   2. Enquanto agitando continuamente um volume de 500 ml, adicionar 41,45 g de D-glucose e 41,84 g de _NaHCO3.
   3. Adicionar mais água destilada para atingir um volume final de 1 L. Depois da diluição, a concentração final de cada composto é de 11,5 mM de D-glucose 24,9 mM e NaHCO _3.
   4. Manter refrigerado a 4 ° C durante até 2 semanas.
   5. Antes de cada mix experimento 50 ml de estoque A com 50 ml estoque B e trazer para 1 L com água destilada para obter solução final concentração aCSF e deixar à temperatura ambiente, enquanto oxigenando-o continuamente com carbogênio (95% O ₂ - 5% de CO ₂ mix) durante pelo menos 30 min. Prepare aCSF concentração final apenas no início de cada experiência e descartar no final do dia.

2. Preparação de líquido cefalorraquidiano sacarose-artificial(Sacarose-aCSF)

1. Preparação de Solução Stock C
   1. Adicionar 700 ml de água destilada para uma proveta de 1 L limpo antes da adição de produtos químicos.
   2. Enquanto agitando continuamente a 500 ml de água destilada, adicionar 240 g de sacarose, 6,55 g de _NaHCO3, 0,671 g de KCl, 4,88 g de _MgCl2, 0,22 g de CaCl ₂ e 0,21 g de ácido ascórbico.
   3. Adicionar mais água destilada para atingir um volume final de 1 L. Depois da diluição, a concentração final de cada composto é sacarose 701.1 mM, 78 mM de NaHCO _3, 9 mM de KCl, 24 mM de MgCl _2, CaCl 1,5 mM ácido ascórbico 1,2 mM e ₂ .
   4. Mantenha a solução estoque C a 4 ° C durante até uma semana.
   5. Antes de cada mistura experimental 300 ml de 50 ml de estoque de C com 600 ml de água destilada para se obter a solução de sacarose-aCSF na concentração final e deixar à temperatura ambiente durante a oxigenação continuamente com carbogénio (95% _O2 - 5% CO ₂ mix) durante pelo menos 30 min.

3. Preparação Slice

1. Coloque um copo limpo com 100 ml de solução de sacarose-aCSF em gelo enquanto oxigenar com carbogénio e fixar o pH em 7,4 usando um medidor de pH durante a adição de algumas gotas de solução de NaOH 0,1 M (quando o pH <7,4) ou uma solução 0,1 M de HCl (quando pH> 7,4).
2. Encha-se de uma câmara de corte de um vibratome com sacarose-aCSF e oxigenar-lo. Ligue o sistema de refrigeração à base de glicerol acoplado à câmara de corte e esperar 15 minutos para permitir que ele esfriar, 0 - 4 ° C.
3. Anestesiar ratos jovens (com idade de 9 a 12 a partir de adulto cronometrado-grávidas de ratos Sprague-Dawley) com cetamina (70 mg / kg, ip; usando <50 uL de volume final). Quando filhote é calmo, verifique que reflex cauda pitada está ausente.
4. Decapitar filhotes.
   1. Cortar a cabeça pele longitudinalmente a partir da frente para trás usando uma lâmina de bisturi de aço carbono e puxar a pele para os lados usando uma pinça. Cortar o osso que cobre o cérebro movendo o SCissors lateralmente e removê-lo totalmente para expor o cérebro.
   2. Em seguida, remove-se rapidamente o cérebro utilizando uma espátula (inicialmente colocado sob o bolbo olfactivo, a fim de empurrar suavemente para fora do cérebro do mais rostral para as áreas mais caudal). Com cuidado, empurre o cérebro em fluido gelada oxigenado sacarose-artificial cerebrospinal (sacarose-aCSF).
5. Fazer um corte parassagital no hemisfério direito (remoção de aproximadamente um terço do hemisfério) e colar o lado cortado do cérebro para um disco metálico que irá ser magneticamente fixado à câmara de corte de um vibroslicer para reduzir sagitais 400 uM secções contendo o núcleo pedunculopontino (PPN). Manter fatias PPN à TA durante 45 min antes de célula inteira gravações de patch-clamp.

4. Oscilações Recordings Gamma-banda em PPN Slices

1. Preparação de Solução de potássio intracelular-gluconato (alta-K ⁺ Solução)
   1. Colocar emgelo num copo limpo com 10 ml de água destilada. Enquanto continuamente agitando acrescentar: K ⁺ -gluconate, 90,68 mg phosphocreatine di sal Tris, 47,66 mg HEPES, 1,5 mg EGTA, 40,58 mg Mg ²⁺ -ATP e 4 mg Na ⁺ ₂ -GTP.
   2. Ajustar o pH para 7,3 com KOH (100 mM em água destilada). Adiciona-se água destilada para atingir um volume final de 20 mL. Se necessário, ajustar a osmolaridade com sacarose (100 mM em água destilada) a ser 280-290 mOsm. Após diluição, a concentração final de cada composto é K ⁺ 124 mM -gluconate, fosfocreatina sal di Tris 10 mM, HEPES 10 mM, EGTA 0,2 mM, 4 mM de ^{Mg2 +} -ATP, e 0,3 mM de Na ⁺ ₂ -GTP.
   3. soluções alíquota intracelulares em 1 ml tubos e congelar a -20 ° C. Utilize uma aliquota por dia e manter a 4 ° C durante as experiências.
2. Whole-cell Grampo patch Recordings
   1. Coloque as fatias de uma câmara de imersão e perfundir-los (1,5 ml / min) com oxigenado(95% de _O2 - 5% CO ₂₎ aCSF contendo os seguintes: antagonistas de receptor de antagonista de receptor de ácido 2-amino-5-phosphonovaleric selectivo de NMDA (APV, 40 uM), competitiva AMPA / cainato antagonista do receptor de glutamato de 6-ciano-7- nitroquinoxalina-2.3-diona (CNQX, 10 uM), antagonista do receptor de glicina estricnina (STR, 10 | iM), o GABA específica gabazine _Um antagonista do receptor (GBZ, 10 uM), e tetrodotoxina bloqueador do canal de sódio (TTX, 3 um)
      NOTA: Nos resultados e números, estes antagonistas são referidos coletivamente bloqueadores como sinápticas ou SBS.
   2. Encha as pipetas de patch de gravação (Resistência 2-7 mohms; feita a partir de capilares regulares, disponíveis comercialmente espessura da parede de vidro de borosilicato de diâmetro exterior 1,0 mm e diâmetro interno 0,6 mm) com solução intracelular high-K ⁺ usando enchimentos patch-pipetas disponíveis comercialmente com um Filtro de solução. Insira a pipeta no suporte de seu amplificador. Aplique uma pequena postivo de pressão usando uma seringa de 1 ml ligada ao suporte da pipeta usando um tubo de silicone ligado a uma válvula de três vias. Ligue a volta do suporte da pipeta para um amplificador de patch clamp.
   3. Mover a pipeta de gravação usando um micromanipulador mecânica perto do núcleo PPN usando uma objetiva de 4X combinados para infravermelho próximo de interferência diferencial óptica de contraste.
      NOTA: PPN núcleo pode ser observada em fatias dorsal para o pedúnculo cerebelar superior (SCP; observável como um feixe de espessura dos axónios). Pipetas de registo foram localizados na PPN pars compacta, que está localizado imediatamente dorsal para a extremidade posterior do pedúnculo.
   4. Traga a pipeta de gravação em contacto com um neurónio PPN enquanto visualizadas utilizando uma lente de imersão em água 40X, e aplicar rapidamente sucção negativa para formar uma vedação com a célula.
   5. Utilize software selo de tensão-clamp para monitorar a resistência da pipeta durante a aspiração negativa usando o protocolo do fabricante.
      1. Quando s negativosução é aumentada lentamente e valores de resistência de leitura pelo monitor de patch-clamp na ponta da pipeta atingir 80-100 MOhm, mudar rapidamente o potencial de manutenção de -50 mV e aliviar a pressão negativa. Comece a aplicar continuamente sucção negativa até ruptura de membrana e o acesso eléctrico do neurónio é conseguido na configuração de célula inteira.
      2. Se os valores de resistência de acesso medidos pelo software selo de tensão-clamp são 10 MOhm ou superior, em seguida, continuar a aplicar sucção negativa em quantidades menores.
   6. Compensar capacitância (ou seja, transientes rápidos e lentos observada após rotura da membrana da célula) e resistência em série em modo de tensão-grampo. Mudar o modo de gravação a pinça de corrente, e rapidamente compensar valores ponte (por exemplo, mover o botão amplificador ou clique no menu automático de compensação usando o mouse computer's).
      1. Monitorar continuamente potencial de repouso da membrana da PPN neurônio sendo gravado ucantar o protocolo do fabricante. Se membrana em repouso mudança potencial para valores despolarização ou hiperpolarizantes, em seguida, usar pequenas quantidades de corrente contínua (até 100 Pa) para manter o valor final mV óptima -50.
         NOTA: Mantenha apenas os neurônios PPN com um potencial estável de membrana em repouso (RMP) de -48 mV ou mais hyperpolarized (ie, RMP <-48 mV).

Resultados

Inicialmente, as oscilações gama foram evocados usando impulsos de corrente quadrados. Actual de gravação de braçadeira de neurónios PPN na presença de agentes bloqueadores sinápticas e TTX foi monitorizada continuamente para assegurar que o potencial de repouso da membrana foi mantida estável a ~ -50 mV (Figura 1A). Dois impulsos de corrente quadrados longo segundo foram injectados intracelularmente pelo amplificador de patch clamp através da pipeta de gravaç...

Discussão

Neurônios PPN têm propriedades intrínsecas que lhes permitem disparar potenciais de ação em frequências da banda beta / gama durante em gravações vivo a partir de animais que são acordado ou durante o sono REM, mas não durante o sono de ondas lentas ^2,3,5,13-17. Outros autores mostraram que os transectos do tronco cerebral em mais níveis anteriores de PPN reduzida frequências gama durante as gravações de EEG. No entanto, quando as lesões no tronco cerebral posterior ao núcleo, onde es...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501	C12H22O11, molecular weight = 342.30
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014	NaHCO3, molecular weight = 84.01
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911	KCl, molecular weight = 74.55
Magnesium Chloride Hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272	MgCl2 · 6H2O, molecular weight =  203.30
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma-Aldrich	C3881	CaCl2 · 2H2O, molecular weight =147.02
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	C6H12O6, molecular weight = 180.16
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A5960	C6H8O6, molecular weight =176.12
Sodium Chloride	Acros Organics	327300025	NaCl, molecular weight =  58.44
Potassium Gluconate	Sigma-Aldrich	G4500	C6H11KO7, molecular weight =  234.25
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma-Aldrich	P1937	C4H10N3O5P · 2C4H11NO3, molecular weight =  453.38
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	C8H18N2O4S, molecular weight = 238.30
EGTA	Sigma-Aldrich	E0396	[-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2, molecular weight = 380.40
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma-Aldrich	A9187	C10H16N5O13P3 · xMg2+, molecular weight = 507.18
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G8877	C10H16N5O14P3 · xNa+, molecular weight = 523.18
Tetrodotoxin citrate	Alomone Labs	T-550	C11H17N3O8, molecular weight = 319.27
DL-2-Amino-5-Phosphonovaleric Acid	Sigma-Aldrich	A5282	C5H12NO5P, molecular weight = 197.13
CNQX disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	C239	C9H2N4Na2O4 · xH2O, molecular weight = 276.12
Strychnine	Sigma-Aldrich	S0532	C21H22N2O2, molecular weight = 334.41
Mecamylamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	M9020	C11H21N · HCl, molecular weight = 203.75
Gabazine (SR-95531)	Sigma-Aldrich	S106	C15H18BrN3O3, molecular weight = 368.23
Ketamine hydrochloride	Mylan	67457-001-00
Microscope	Nikon	Eclipse E600FN
Micromanipulator	Sutter Instruments	ROE-200
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
A/D converter	Molecular Devices	Digidata 1440A
Heater	Warner Instruments	TC-324B
Pump	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
Pump cartridge	Cole-Parmer	Masterflex 7519-85
Pipette puller	Sutter Instruments	P-97
Camera	Q-Imaging	RET-200R-F-M-12-C
Vibratome	Leica Biosystems	Leica VT1200 S
Refrigeration system	Vibratome Instruments	900R
Equipment
microscope	Nikon	Eclipse E600FN
micromanipulator	Sutter Instruments	ROE-200
micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
A/D converter	Molecular Devices	Digidata 1440A
heater	Warner Instruments	TC-324B
pump	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
pump cartridge	Cole-Parmer	Masterflex 7519-85
pipette puller	Sutter Instruments	P-97
camera	Q-Imaging	RET-200R-F-M-12-C