Registrazione Gamma banda oscillazioni Pedunculopontine Nucleo neuroni

Riepilogo

Il nucleo pedunculopontine (PPN) si trova nel tronco cerebrale e le sue neuroni vengono attivati ​​al massimo durante gli stati di veglia e movimento rapido degli occhi (REM) del cervello sonno. Questo lavoro descrive l'approccio sperimentale di registrare in banda gamma di oscillazione membrana sottosoglia vitro in neuroni PPN.

Abstract

Efferenze Synaptic dal PPN sono noti per modulare l'attività neuronale di diverse regioni del talamo intralaminari (ad esempio, la centrolateral / parafascicular; Cl / Pf nucleo). L'attivazione di una PPN o nuclei Cl / Pf in vivo è stata descritta per indurre l'eccitazione dell'animale e un incremento dell'attività banda gamma nel elettroencefalogramma corticale (EEG). I meccanismi cellulari per la generazione di oscillazioni banda gamma di Attivazione Reticolare System (RAS) neuroni sono gli stessi di quelli trovati per generare oscillazioni banda gamma di altri nuclei cervello. Durante registrazioni current-clamp su neuroni PPN (da fette parasagittali da 9 - 25 giorni-ratti), l'uso di depolarizzante punti quadrato rapidamente attivato canali del potassio voltaggio-dipendenti che impedivano neuroni PPN venga depolarizzato oltre -25 mV.

Iniezione 1 - 2 sec depolarizzante lungo rampe attuali gradualmente depolarizzata PPN potenziale di membrana resting Valori verso 0 mV. Tuttavia, parenterale depolarizzanti impulsi quadrati generati oscillazioni gamma-banda di potenziale di membrana che mostravano ad essere più piccole in ampiezza rispetto alle oscillazioni generate da rampe. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in presenza di canali del sodio voltaggio-dipendenti e veloci recettori sinaptici bloccanti. E 'stato dimostrato che l'attivazione dei canali del calcio voltaggio-dipendenti soglia alta sottendono attività oscillatoria banda gamma nei neuroni PPN. Interventi metodologici e farmacologici sono descritte qui, fornendo gli strumenti necessari per indurre e sostenere PPN sottosoglia oscillazione banda gamma in vitro.

Introduzione

PPN nucleo è anatomicamente incluso nel tegmento mesencefalica caudale. Il PPN è un componente chiave di RAS ^1. Il PPN partecipa alla manutenzione degli stati attivati ​​comportamentali (ad esempio, la veglia, il sonno REM) ^2. La stimolazione elettrica del PPN in vivo indotta oscillazione veloce (20 - 40 Hz) nella EEG corticale ^3, mentre le lesioni bilaterali PPN nel ratto ridotti o eliminati sonno REM ^4. Mentre la maggioranza dei neuroni PPN fuoco potenziali d'azione a frequenza beta / gamma-banda (20 - 80 Hz), alcuni neuroni hanno presentato bassi tassi di scarica spontanea (<10 Hz) ^5. Inoltre, la PPN sembra essere coinvolti in altri aspetti del comportamento come la motivazione e l'attenzione ^6. Ad alta frequenza diretta (40 - 60 Hz) ⁷ stimolazione elettrica del nucleo PPN negli animali decerebrate può promuovere la locomozione. Negli ultimi anni, la stimolazione cerebrale profonda (DBS) del PPN è stato usato per trattare pazienti affetti frodisturbi m coinvolgono deficit della deambulazione come il morbo di Parkinson (PD) ^8.

Studi precedenti hanno dimostrato che quasi tutti i neuroni PPN possono sparare potenziali d'azione a frequenza di banda di gamma quando depolarizzato utilizzando impulsi di corrente quadrati ^9. A causa della drastica attivazione dei canali del potassio voltaggio-dipendenti durante impulsi depolarizzazioni quadrati pari o sotto -25 mV. Di conseguenza, non sono state osservate robusti oscillazioni gamma dopo il blocco generazione potenziali d'azione usando tetrodotoxin ^10. Nel tentativo di aggirare tale problema, 1 - sono stati utilizzati 2 sec depolarizzante lungo le rampe di corrente. Rampe gradualmente depolarizzati il ​​potenziale di membrana dai valori fino a 0 mV a riposo, mentre in parte l'inattivazione canali del potassio voltaggio-dipendenti. Oscillazioni della membrana banda gamma Cancella erano evidenti all'interno della finestra di dipendenza di tensione dei canali del calcio soglia alta (cioè tra -25 mV e -0 mV) ^10. In conclusione, banda gamma Activity stata osservata nei neuroni PPN ^9, ed entrambi P / Q e canali del calcio voltaggio-dipendenti di tipo N deve essere attivato al fine di generare oscillazioni banda gamma nella PPN ^10.

Una serie di studi ha determinato la posizione dei canali del calcio ad alta soglia nei neuroni PPN. Iniettando la combinazione di coloranti, imaging di fluorescenza raziometrico mostrato transienti di calcio attraverso i canali del calcio voltaggio-dipendenti che si attivano in diversi dendriti quando depolarizzato utilizzando le rampe di corrente ^11.

proprietà intrinseche dei neuroni PPN sono state proposte per permettere l'attivazione simultanea di queste cellule durante la veglia e il sonno REM, inducendo così oscillatoria ad alta frequenza attività neuronale tra la RAS e loop talamocorticali. Tale interazione lunga portata è considerata supportare uno stato del cervello in grado di valutare attendibilmente il mondo intorno noi su base continua ^12. Qui, descriviamo l'esperimentoAl condizioni necessarie per generare e mantenere gamma banda di oscillazione in cellule in vitro PPN. Questo protocollo non è stato descritto in precedenza, e avrebbe aiutato un certo numero di gruppi per studiare le proprietà intrinseche della membrana che mediano l'attività banda gamma in altre aree cerebrali. Inoltre, a pochi passi attuali potrebbero portare alla conclusione erronea che l'attività banda gamma non può essere generata in queste cellule.

Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali della University of Arkansas per le scienze mediche (numero protocollo # 3593) ed erano in accordo con le linee guida del National Institutes of Salute per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. Preparazione del liquido cerebrospinale standard-artificiale (aCSF)

1. Preparazione della soluzione Stock A
   1. Aggiungere 700 ml di acqua distillata ad una pulita 1 L bicchiere prima di aggiungere sostanze chimiche.
   2. Mentre agitando continuamente un volume di 500 ml, aggiungere 136.75 g di NaCl, 6,99 g di KCl, 2,89 g di MgSO _4, e 2,83 g di NaH ₂ PO _4.
   3. Aggiungere acqua distillata per raggiungere un volume finale di 1 L. Dopo la diluizione, la concentrazione finale di ogni composto è 117 mM NaCl, 4,69 mM KCl, 1,2 mM MgSO _4, e 1,18 mM NaH ₂ PO _4.
   4. Conservare in frigorifero a 4 ° C per un massimo di 2 settimane.
2. Preparazione della soluzione della B
   1. Aggiungere 700 ml di acqua distillata in un becher da 1L pulito prima di aggiungere sostanze chimiche.
   2. Mentre agitando continuamente un volume di 500 ml, aggiungere 41,45 g di D-glucosio e 41.84 g di NaHCO _3.
   3. Aggiungere acqua distillata per raggiungere un volume finale di 1 L. Dopo la diluizione, la concentrazione finale di ogni composto è 11,5 mM D-glucosio e 24,9 mM NaHCO _3.
   4. Conservare in frigorifero a 4 ° C per un massimo di 2 settimane.
   5. Prima di ogni mix esperimento 50 ml di brodo A con 50 ml di B e portare a 1 L con acqua distillata per ottenere una soluzione definitiva concentrazione aCSF e lasciare a temperatura ambiente, mentre continua ossigenante con CarboGen (95% O ₂ - 5% di CO ₂ mix) per almeno 30 min. Preparare aCSF concentrazione finale solo all'inizio di ogni esperimento e scartare alla fine della giornata.

2. Preparazione di liquido cerebrospinale saccarosio-artificiale(Saccarosio-aCSF)

1. Preparazione della soluzione della C
   1. Aggiungere 700 ml di acqua distillata ad una pulita 1 L bicchiere prima di aggiungere sostanze chimiche.
   2. Mentre continuo agitazione 500 ml di acqua distillata, aggiungere 240 g di saccarosio, 6,55 g di NaHCO _3, 0,671 g di KCl, 4,88 g di MgCl _2, 0,22 g di CaCl ₂ e 0,21 g di acido ascorbico.
   3. Aggiungere acqua distillata per raggiungere un volume finale di 1 L. Dopo la diluizione, la concentrazione finale di ogni composto è 701.1 mM di saccarosio, 78 mM NaHCO _3, 9 mM KCl, 24 mM MgCl _2, 1.5 mM CaCl ₂ e 1,2 mM di acido ascorbico .
   4. Mantenere Soluzione C a 4 ° C per un massimo di una settimana.
   5. Prima di ogni miscela esperimento 300 ml di 50 ml di brodo C con 600 ml di acqua distillata per ottenere la soluzione di saccarosio-aCSF alla concentrazione finale e lasciare a temperatura ambiente mentre continuamente ossigenante con CarboGen (95% O ₂ - 5% CO ₂ mix) per almeno 30 min.

3. Preparazione Slice

1. Posizionare un bicchiere pulito con 100 ml di soluzione di saccarosio-aCSF in ghiaccio mentre ossigenante con CarboGen e fissare il pH a 7,4 con un pH-metro mentre l'aggiunta di qualche goccia di soluzione 0,1 M di NaOH (quando il pH <7,4) o 0,1 soluzione M HCl (quando pH> 7.4).
2. Riempire una camera di taglio di un vibratome con saccarosio aCSF e ossigenare esso. Accendere il sistema di refrigerazione glicerolo basato accoppiato alla camera di taglio e attendere 15 min per permettere raffreddare 0 - 4 ° C.
3. Anestetizzare cuccioli di ratto (dai 9 ai 12 da adulti al momento giusto in gravidanza ratti Sprague-Dawley) con ketamina (70 mg / kg, ip; utilizzando <50 ml di volume finale). Quando cucciolo è calmo, doppio controllo che la coda pizzico riflesso è assente.
4. Decapitare cuccioli.
   1. Tagliare la pelle testa longitudinalmente dalla parte anteriore alla parte posteriore con un bisturi in acciaio al carbonio, e tirare la pelle ai lati con pinze. Tagliare l'osso che copre il cervello in movimento scissors lateralmente e totalmente rimuoverlo per esporre il cervello.
   2. Quindi, rimuovere rapidamente il cervello utilizzando una spatola (inizialmente posto sotto il bulbo olfattivo per spingere delicatamente il cervello dal più rostrale verso le zone più caudali). Spingere delicatamente il cervello in ossigenato liquido cerebrospinale di saccarosio-ghiaccio artificiale raffreddato (saccarosio-aCSF).
5. Effettuare un taglio parasagittale nell'emisfero destro (rimuovendo circa un terzo della semisfera), ed incollare la parte tagliata del cervello su un disco metallico che sarà magneticamente fissato alla camera di taglio di un vibroslicer tagliare sagittali 400 sezioni micron contenenti la pedunculopontine nucleo (PPN). Mantenere fette PPN a temperatura ambiente per 45 minuti prima di tutto-cell patch-clamp.

4. Oscillazioni Recordings banda gamma a PPN Fette

1. Preparazione di potassio gluconato soluzione intracellulare (High-K ⁺ Solution)
   1. Posizionare inghiaccio un bicchiere pulito con 10 ml di acqua distillata. Mentre continua a mescolare aggiungere: K ⁺ -gluconate, 90.68 mg phosphocreatine di Tris sale, 47.66 mg HEPES, 1,5 mg EGTA, 40.58 mg Mg ²⁺ -ATP, e 4 mg Na ⁺ ₂ -GTP.
   2. Regolare il pH a 7,3 con KOH (100 mm di acqua distillata). Aggiungere acqua distillata per raggiungere un volume finale di 20 ml. Se necessario, regolare osmolarità con saccarosio (100 mm di acqua distillata) ad essere 280-290 mOsm. Dopo la diluizione, la concentrazione finale di ogni composto è 124 mm K ⁺ -gluconate, 10 mM phosphocreatine di Tris di sale, 10 mM HEPES, 0,2 mM EGTA, 4 mM Mg ²⁺ -ATP, e 0,3 mm Na ⁺ ₂ -GTP.
   3. Le soluzioni Aliquota intracellulari in 1 ml tubi e congelare a -20 ° C. Utilizzare un'aliquota al giorno e mantenere a 4 ° C durante gli esperimenti.
2. Cellula intera Bloccare Registrazioni patch
   1. Mettere le fette in una camera di immersione e li (1,5 ml / min) profumato con ossigenato(95% O ₂ - 5% di CO ₂₎ aCSF contenente i seguenti antagonisti del recettore NMDA: antagonista dei recettori dell'acido 2-amino-5-phosphonovaleric selettivo (APV, 40 micron), competitivo AMPA / kainato dei recettori del glutammato antagonista del 6-ciano-7- nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX, 10 micron), del recettore della glicina antagonista del stricnina (STR, 10 micron), il GABA specifica _un antagonista del recettore gabazine (GBZ, 10 micron), e sodio-antagonista tetrodotossina (TTX, 3μM)
      NOTA: Nei risultati e le cifre, questi antagonisti sono indicate collettivamente bloccanti come Synaptic o SB.
   2. Riempire le pipette di patch di registrazione (Resistenza 2-7 MW, costituito da regolari, capillari in commercio di spessore parete di vetro borosilicato di 1,0 mm di diametro esterno e diametro interno 0,6 millimetri) con la soluzione intracellulare alta K ⁺ utilizzando disponibili in commercio filler patch-pipetta con filtro soluzione. Inserire la pipetta nel supporto del suo amplificatore. Applicare una piccola pospressione itive utilizzando una siringa da 1 ml collegato al supporto pipetta utilizzando un tubo in silicone collegato ad una valvola a tre vie. Collegare il retro del supporto pipetta ad un amplificatore di patch clamp.
   3. Spostare la pipetta registrazione utilizzando un micromanipolatore meccanico vicino al nucleo PPN utilizzando un obiettivo 4X combinati per l'ottica di contrasto di interferenza differenziale ad infrarossi.
      NOTA: PPN nucleo può essere osservato in fette dorsale al peduncolo cerebellare superiore (SCP; osservabile come uno spesso fascio di assoni). Pipette di registrazione erano situati nella PPN pars compacta, che si trova immediatamente dorsale alla estremità posteriore del peduncolo.
   4. Portare la pipetta di registrazione a contatto con un neurone PPN mentre visualizzati utilizzando un obiettivo ad immersione 40X acqua, e applicare rapidamente aspirazione negativo per formare una tenuta con la cella.
   5. Utilizzare il software di tenuta di tensione-clamp per monitorare la resistenza pipetta durante l'aspirazione negativo utilizzando il protocollo del produttore.
      1. Quando s negativiuzione è lentamente aumentata e valori di resistenza di lettura dal monitor patch-clamp sulla punta della pipetta raggiungere 80-100 MOhm, cambiare rapidamente il potenziale tenendo a -50 mV e rilasciare la pressione negativa. Avviare l'applicazione in continuo di aspirazione negativa fino a quando la rottura della membrana ed elettrica accesso del neurone è realizzato nella cellula intera configurazione.
      2. Se i valori di resistenza accesso rilevati dal software di tenuta di tensione-clamp sono 10 MOhm o superiore, quindi continuare ad applicare l'aspirazione negativa in piccole quantità.
   6. Compensare capacità (cioè, transitori lenti e veloci osservati dopo rottura della membrana della cellula) e resistenza serie in modo tensione-clamp. Passare modalità di registrazione a pinza di corrente, e rapidamente compensare valori ponte (ad esempio, spostare la manopola amplificatore o fare clic sul menu compensazione automatica utilizzando il mouse del computer utilizzato).
      1. Monitorare costantemente riposo potenziale di membrana del neurone PPN in fase di registrazione ucantare protocollo del produttore. Se riposo potenziale di membrana spostamento verso valori depolarizzanti o iperpolarizzanti, quindi utilizzare una piccola quantità di corrente continua (fino a 100 Pa) per mantenere il valore finale mV ottimale -50.
         NOTA: Conservare soltanto neuroni PPN con un potenziale di membrana a riposo stabile (RMP) di -48 mV o più hyperpolarized (vale a dire, RMP <-48 mV).

Risultati

Inizialmente, oscillazioni gamma sono stati evocati utilizzando impulsi di corrente quadrati. Clamp attuale dei neuroni PPN in presenza di bloccanti sinaptiche e TTX è stata continuamente monitorata per assicurare che riposa potenziale di membrana è stato mantenuto stabile a ~ -50 mV (Figura 1A). Due impulsi di corrente quadrati lunghi secondi sono stati iniettati intracellulare dall'amplificatore patch clamp attraverso la pipetta registrazione, aumentando la loro ...

Discussione

Neuroni PPN hanno proprietà intrinseche che permettono loro di fuoco potenziali d'azione a frequenze in banda beta / gamma durante le registrazioni in vivo da animali che sono sveglio o durante il sonno REM, ma non durante il sonno ad onde lente ^2,3,5,13-17. Altri autori hanno mostrato che transections tronco cerebrale a più livelli anteriori di PPN ha ridotto le frequenze di gamma durante le registrazioni EEG. Tuttavia, quando le lesioni del tronco cerebrale posteriore al punto in cui si trova...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501	C12H22O11, molecular weight = 342.30
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014	NaHCO3, molecular weight = 84.01
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911	KCl, molecular weight = 74.55
Magnesium Chloride Hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272	MgCl2 · 6H2O, molecular weight =  203.30
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma-Aldrich	C3881	CaCl2 · 2H2O, molecular weight =147.02
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	C6H12O6, molecular weight = 180.16
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A5960	C6H8O6, molecular weight =176.12
Sodium Chloride	Acros Organics	327300025	NaCl, molecular weight =  58.44
Potassium Gluconate	Sigma-Aldrich	G4500	C6H11KO7, molecular weight =  234.25
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma-Aldrich	P1937	C4H10N3O5P · 2C4H11NO3, molecular weight =  453.38
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	C8H18N2O4S, molecular weight = 238.30
EGTA	Sigma-Aldrich	E0396	[-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2, molecular weight = 380.40
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma-Aldrich	A9187	C10H16N5O13P3 · xMg2+, molecular weight = 507.18
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G8877	C10H16N5O14P3 · xNa+, molecular weight = 523.18
Tetrodotoxin citrate	Alomone Labs	T-550	C11H17N3O8, molecular weight = 319.27
DL-2-Amino-5-Phosphonovaleric Acid	Sigma-Aldrich	A5282	C5H12NO5P, molecular weight = 197.13
CNQX disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	C239	C9H2N4Na2O4 · xH2O, molecular weight = 276.12
Strychnine	Sigma-Aldrich	S0532	C21H22N2O2, molecular weight = 334.41
Mecamylamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	M9020	C11H21N · HCl, molecular weight = 203.75
Gabazine (SR-95531)	Sigma-Aldrich	S106	C15H18BrN3O3, molecular weight = 368.23
Ketamine hydrochloride	Mylan	67457-001-00
Microscope	Nikon	Eclipse E600FN
Micromanipulator	Sutter Instruments	ROE-200
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
A/D converter	Molecular Devices	Digidata 1440A
Heater	Warner Instruments	TC-324B
Pump	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
Pump cartridge	Cole-Parmer	Masterflex 7519-85
Pipette puller	Sutter Instruments	P-97
Camera	Q-Imaging	RET-200R-F-M-12-C
Vibratome	Leica Biosystems	Leica VT1200 S
Refrigeration system	Vibratome Instruments	900R
Equipment
microscope	Nikon	Eclipse E600FN
micromanipulator	Sutter Instruments	ROE-200
micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
A/D converter	Molecular Devices	Digidata 1440A
heater	Warner Instruments	TC-324B
pump	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
pump cartridge	Cole-Parmer	Masterflex 7519-85
pipette puller	Sutter Instruments	P-97
camera	Q-Imaging	RET-200R-F-M-12-C