אוטומטית רובוטית טיפול בנוזלים הרכבה של התקנים DNA מודולרי

Summary

. הנה, זרימת עבודה אוטומטית לבצע הרכבה "התקן" DNA מודולרי, באמצעות שיטה מודולרית DNA שיבוט הרכבה על רובוטים נוזלי-טיפול מוצג. הפרוטוקול משתמשת כלי תוכנה אינטואיטיבית ליצירת רשימות המטפל נוזלי לדור קומבינטורית DNA התקן הספרייה, אשר נדגים באמצעות שתי פלטפורמות טיפול בנוזלים.

Abstract

ההתקדמות בטכניקות להרכבה מודולרית DNA אפשרו ביולוגים סינתטי לבחון באופן משמעותי יותר זמינים "עיצוב חלל" המיוצג על-ידי "התקני" שנוצר כמו שילובים של רכיבים גנטיים בודדים. אולם, הרכבה ידנית מספר כה גדול של התקנים היא אינטנסיבית, מועדת לטעויות, ויקר. קנה המידה של מחקר בביולוגיה סינתטית תחכום הגוברת מחייבת דרך יעילה, לשחזור כדי להכיל את התפוקה בקנה מידה גדול, מורכב וגבוה התקן הבנייה.

כאן, פרוטוקול האסיפה DNA בטכניקה סוג-IIS endonuclease ההגבלה מבוססת מודולרי שיבוט (MoClo) היא אוטומטית בפלטפורמות רובוטית נוזלי-טיפול שני. רובוטים אוטומטיים נוזל-טיפול דורשים זהירות, לעתים קרובות פעמים אופטימיזציה מייגע של פרמטרים pipetting של נוזלים של צמיגויות שונים (למשל אנזימים, ה-DNA, מים, מאגרי), כמו גם תכנות מפורש על מנת להבטיח שאיפה נכונה dispensing של ה-DNA חלקים, ריאגנטים. זה הופך את התסריט ידנית כותב עבור הרכבות מורכבים רק בעייתי כמערכת ה-DNA ידנית, מחייבת כלי תוכנה שיכולות להפוך קובץ script הדור. לשם כך, פיתחנו כלי תוכנה מבוססת אינטרנט, http://mocloassembly.com, ליצירת ספריות קומבינטורית של התקן ה-DNA של החלקים הבסיסיים של הדנ א, נטען כקבצי Genbank. אנו מספקים גישה לכלי, קובץ ייצוא של התוכנה שלנו המטפל נוזלי אשר כולל אופטימיזציה מחלקות נוזלי, מכשור מעבדתי פרמטרים ופריסת הסיפון. כל חלקי דנ א המשמש זמינים דרך Addgene, מפות דיגיטליות שלהם ובבוקינג ברישום קרח BDC אוניברסיטת בוסטון. יחד, רכיבים אלה מספקים בסיס עבור ארגונים אחרים להפוך לאוטומטי ניסויים שיבוט מודולרי ופרוטוקולים דומה.

אוטומטיות DNA הרכבה זרימת העבודה המוצגת כאן מאפשר ייצור הדיר, אוטומטית, תפוקה גבוהה של מכשירי ה-DNA, מפחיתה את הסיכון של טעות אנוש הנובעות pipetting ידנית חוזרות. רצף נתונים מראים הרכבה אוטומטית ה-DNA תגובות שנוצר מזרימת עבודה זו הם ~ 95% נכון, דורשת קצת כמו 4% על הידיים הרבה זמן, לעומת הכנת התגובה ידנית.

Introduction

המוקדם סינתטי ביולוגיים גנטיים המכשירים של דו-מצבי מתג קולינס¹ ו repressilator Elowitz² הראו כי מערכות ביולוגיות יכול להיות קדימה מתוכנן יש פונקציות ספציפיות, דטרמיניסטי. מאז, ביולוגים סינתטי יש חתרו מהנדס חיים מערכות לבצע את הפונקציונליות מסובכת יותר בשירות biomaterials³, חברת^4,5,6, דלק ביולוגי ^7,8, ו biosensing יישומים^9,10,11. להשגת יישומים אלה באמצעות שילוב מודולרי DNA 'חלקים' לתוך 'מכשירים' עם פונקציונליות מסוימת כבר אחת ממטרותיה העיקריות של ביולוגיה סינתטית. לתהליך הזה קנה המידה, חייב להיות טכניקה המאפשרת היצירה של מכשירים מורכבים מספריות גדול של חלקים היעילה, חסכוניים, הדבר החשוב ביותר, באופן לשחזור.

כזה תהליך ההרכבה ולקיבולת היא מוצדקת כי כיום השדה חסר הבנה מלאה של החוקים המנחה מוצלח מערכת ביולוגית עיצוב ו הלחנה. זה היא מתעצמת על דיו מאופיין DNA חלקים¹², חוסר תאימות composability של חלקים¹³, ואינטראקציות צפוי, לא רצוי בין רכיבים גנטיים בתוך מכשירים סינתטי^{14, 15}. בהיעדר דגמי ניבוי אמין, פונקציונלי התקנים גנטי סינתטי הם הגיעו על ידי ניסוי וטעייה, אשר דורש עשרות או אפילו מאות, עוצמת אות קלט-פלט וריאנטים של התקן המיועד מוקרנים "הכי טוב" נבחרה עבור הרכב עם אלמנטים במורד הזרם¹⁶. בעוד מודרנית סטנדרטית דנ א שיטות הרכבה כמו שער הזהב¹⁷, שיבוט מודולרי^18,19,20 להקל על תהליך זה, מומחה ניסיוני עדיין נדרשת לביצוע כל פרוטוקול. ולגדול התקנים סינטטי בגודל ואת המורכבות, השטח הכולל עיצוב זמין יגדל יתר על המידה כדי לבנות ולבדוק באופן ידני²¹, והתהליך יהיה artisanal מדי עבור כל התקדמות משמעותית אשר ניתן לשכפול להתבצע בשטח.

עד כניסתו של ביולוגיה סינתטית, חלק ביולוגיות למאגרים כגון iGEM חלקים הרישום (http://partsregistry.org), JBEI מלאי של Composable אלמנטים גנטיים²², ואת SynBioHub²³, החלקים לא אוחסנו באף תבנית סטנדרטית הרכבה. רק קומץ קטן של חלקים צריכים להיות משובטים לכל פרוייקט, לפיכך, הנפח של שיבוט עשה היה קטן, ואת המימוש של התקן שהורכב היה השגה, טריוויאלי בהשוואה מטרות המחקר בפועל. שיבוט מולקולרי היה לעתים קרובות אד הוק , המבוצעת באמצעות הגבלת מעכל מבוסס על אתר ההגבלה וזמינות endonuclease ולא בעקבות כל תהליך סטנדרטית. היעדר סטנדרטיזציה הגיע מעשית כדי להפוך לאוטומטי בכל פרוטוקול שיבוט כפי שהיה סביר כי התגובה הבא שיבוט יעקבו פרוטוקול זהה. יתר על כן, אוטומציה של ה-DNA הרכבה נדרש השקעה כספית משמעותית בציוד (נוזל טיפול רובוטים והתשתית המשויכת אליהם מכשור מעבדתי ותוכנה) וכן הזמן וההשקעה לדור של ההוראות כדי לפתח מדויק פרמטרים עבור טיפול המעמדות השונים נוזלים המעובדות הסדרה מדויק של ההוראות להפעלת פרוטוקולים אלה. שיבוט המאמצים בקנה מידה קטן אינו מצדיק הוצאות אלו. השילוב של עיצובים התקן גנטי גדול יותר, מורכבים יותר בשילוב עם הרכבה מתוקננת פרוטוקולים^24,25 יוצר סביבה איפה מאוד פרקטי האוטומציה של תהליכים אלה. רובוטיקה בעלות נמוכה כמו Opentrons OT-אחד²⁶ מתגלים גם מה שמאפשר מעבדות ממומן אפילו בצניעות לגשת טכנולוגיה זו. בנוסף, "ענן" מעבדות²⁷ כולל Transcriptic, הברקת ענן מעבדה, כמו גם אקדמית "biofoundries" כגון אדינבורו הגנום היציקה, iBioFab UIUC, וקובע היציקה MIT-רחבה, רובוטיקה לרתום להרכיב מגוון של עיצובים למגוון רחב של לקוחות במהירות, שוב ושוב תוך שמירה על מאגר משותף של בסיסי DNA פרימיטיביים וטכנולוגיות הרכבה עבור הזמנות עתידיות.

אחד האתגרים הגדולים ביותר של מיכון התהליך של מכלול ה-DNA הוא הדור של הפקודות pipetting עבור המטפל נוזלי. אמנם ממשקי תוכנה עבור התקנים אלה בדרך כלל קל לשימוש, מורכבים pipetting הוראות כאלה הדרושים להרכבה DNA קומבינטורית דורשים המדען במפורש לציין כל וביופסיה, לוותר על הפקודה באופן ידני. זה יוצר שמכבידות בזרימת העבודה, ומשאיר את תהליך יצירת קובץ script לפגיע השגיאות pipetting אותו כאילו ההרכבה בוצעו באופן ידני. זה מצריך כלי תוכנה שיכולות להפוך כל החלקים של תהליך זה, מעיצוב הספרייה המכשיר, כדי לייצר את ההוראות pipetting, ולספק החוקר הכיוונונים צלחת/ריאגנט נדרש להרכיב אותם. בעבודה זו, אנו ממנפים את כלי התוכנה שלנו כדי להפוך לאוטומטי את העיצוב של ספרייה קטנה DNA קומבינטורית המכשיר, וכן ערבוב של ריאגנטים (מאגר מים, אנזימים) וחלקים דנ א (איור 1b) לתוך 96 סיר אחד מודולרי DNA מכלול התגובות. השימוש בכלי דורש ניסיון בתכנות מראש, היא מדרגית וגבוה תפוקת, ואת קומבינטורית כברירת מחדל. אנו מראים כי שיבוט תגובות שהוכנו בפלטפורמות שונות טיפול בנוזלים אוטומטית שני התשואה הנכונה תבדוק-רצף שיבוטים עם תדר דומה כדי תגובות שהוכנו באופן ידני (95%), ועם הפעם תרגולים באופן משמעותי פחות.

Protocol

1. ציון חלקי כדי לשמש ספריית DNA התקן והוראות ליצור משתמש/נוזל המטפל [15 דקות]

1. שימוש בכל דפדפן אינטרנט, נווט אל mocloassembly.com ולהעלות Genbank קבצים עבור כל חלקי דנ א זה ייכלל בערכת עיצוב המכשיר DNA קומבינטורית.
2. לאחר כל הקבצים שהעלית, בחר חלקים DNA הרצוי ולגרור אותם אל בד ריק, הצבת חלק סוגים לפי הסדר סופי המיועד חלקי דנ א.
   הערה: אוספים של חלקים, כמו גם חלקים בודדים, יכול להיות שנבחרו והניח על גבי בד. גם, להזמין חלקי דנ א כך 5' של 3' חופות סלעיות עבור כל משחק חלק.
3. לחץ על "להרכיב" בחלק הימני התחתון של הדף.
   הערה: הכלי רק יפיק את הרכבות חוקי, buildable בהתבסס על המסוכך זוג בסיסים ארבע מחזיתות כל חלק על מערכת העיכול עם האנזים BsaI. אם אף התקן ה-DNA buildable קיים מבוסס על החלקים שהועלו על-ידי המדען, הכלי יציין כי הרכבות לא נמצאו.
4. נווט אל הכרטיסיה 'תוכניות' ולהוריד קבצים שנוצרו על-ידי הכלי. קבצים אלה יכללו:
   1. צלחת קריא מפות עבור המדען להכין דגימות די אן איי, וכן ריאגנטים הכרחי עבור התגובות
   2. 'בחירה' עבור המטפל נוזלי
   3. קבצים Genbank המבואר מלא עבור כל התקני ה-DNA הניתנים להרכבה
      הערה: נוזל טיפול הזרוע מיצוב בעת גישה לכל כוח מעבדה חדשה חייב להיבדק. עיין בספר ההדרכה של היצרן לקבלת הוראות מפורטות כיצד להתאים את הזרוע pipetting ממקמים X, Y ו- Z צירים לפי הצורך.

2. מכינים דנ א פלסמיד, ריאגנטים עבור הרכבה [3 ימים]

1. [יום 1] באמצעות לולאה חיסון סטרילי, לעבוד ליד להבה פתוחה או בכל תא למינארי, פס החוצה גליצרול חיידקי מניות על גבי לוחות LB-אגר בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה. . עושה את זה בשביל כל החלקים DNA הכרחי, מקפיד לעקר את הלולאה בין כל דגימה. דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   הערה: קפוא גליצרול חיידקי מניות יש לשמור על הקרח ככל האפשר. מחזורים ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה להנמיך את הכדאיות של המניה, יש להימנע.
2. [יום 2] באמצעות פיפטה סטרילי עצה, קיסם, או חיסון לולאה, והוא פועל ליד להבה פתוחה או בכל תא למינארי, לחסן 3 מ ל מרק ליברות (בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה) עם מושבה בודדת של הלוחות LB-אגר המבושלות 2.1. דגירה תרבויות בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס תוך טלטול-300 סל ד.
3. [יום 3] לטהר DNA פלסמיד חיידקי תרבויות באמצעות ערכת טיהור כל הכנה מיני זמינים מסחרית פלסמיד.
4. באמצעות הקובץ MoClo_Setup.xlsx מסופקים, לדלל כל דגימה של פלסמיד דנ א כדי ריכוז של 20 fmol µL במים או מאגר טה.
5. בעקבות המפה צלחת של קובץ PDF שנוצר על-ידי הכלי הרכבה, למקם את עוצמת הקול המצוין של כל חלק DNA מדולל לתוך הבאר המתאים על צלחת המתנוצץ PCR 96-ובכן. החזק הזה SetupPlate על הקרח עד הצורך, או לסגור עם נייר דבק חותם ולאחסן ב-20 ° C.
6. על קרח, להכין את התגובה mastermix עם הרכיבים הבאים: עבור כל µL 20 של תגובה הוסף 2 µL של 10 x T4 DNA ליגאז מאגר, 0.5 µL של T4 DNA ליגאז (HC), ו µL 1 של האנזים BsaI. גיליון מחשבון נכלל בקובץ MoClo_Setup.xlsx כדי לסייע עם זה.
   1. להפיץ את האנזים mastermix לתוך הבארות המתאים של המתנוצץ 96-ובכן PCR צלחת חדשה, בעקבות המפה צלחת עבור ReagentPlate בקובץ PDF שנוצר. שמור את ReagentPlate על הקרח או על 96-ובכן קר-בלוק.
      הערה: ReagentPlate צריך רק להיות מוכן כשאתה מוכן להפעיל את מכלול המטפל נוזלי.

3. לבצע את ההרכבה Script על המטפל נוזלי [משתנה]

1. מקם את SetupPlate(s) את ReagentPlate(s) (על הקור 96-ובכן-בלוק), את המספר הדרוש של המתנוצץ לוחות ה-PCR של 96-ובכן ריק על סיפונה של המטפל נוזלי. Plate(s) ריק יהיה OutputPlate(s) שבו התגובות הם מורכבים.
2. להכין את המטפל נוזלי לשלוט תוכנה על-ידי יצירת מופעים של ריאגנט ולדגום שהלוח מוכן, מקפיד לתת להם שמות. בדיוק כפי שהם מופיעים על מפות צלחת נוצר על ידי mocloassembly.com, כולל שוקת של נקי, מים יונים שכותרתו ' מאגר '.
3. באמצעות הפקודה 'Worklist' בתוכנה שליטה, לטעון את הקובץ .gwl שנוצר על ידי כלי התוכנה שלנו, ואחריו עוד פקודה 'Worklist' אשר יבצע את הקובץ .gwl טעון בפקודה הראשונה.
4. לבצע את ה-script באמצעות הפקודה 'הפעל' של התוכנה בקר.
   הערה: אפשר תמיד המטפל נוזלי רובוטית להשלמת הביצוע של קובץ script לפני שתנסה לגשת אל החלל הסיפון.
5. הסר את כל הצלחות סיפון נוזלי המטפל. הנותרים דנ א יכול להיוושע על ידי איטום את SetupPlate(s) עם סרט איטום אלומיניום ואחסון ב-20 ° C. לסגור את OutputPlate(s) עם סרט דביק, מקום thermocycler או חום-בלוק ולהפעיל עם הפרמטרים הבאים מחזור:
   37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, 50 מעלות למשך 5 דקות, 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, להחזיק ב 4 ° C
   הערה: לאחר השלמת התגובה thermocycling, OutputPlate(s) ניתן לאחסן ב-20 ° C עד שהם יהיו מוכנים להשתנות.

4. להפוך את התגובות [יום 1]

1. להפשיר את מספר המחוייבים המוסמכת e. coli תא aliquots צריך (10 µL-תגובה) על קרח.
   הערה: כדי לשמור על עקרות, השלבים הבאים יש לבצעו ליד להבה פתוחה, או בתוך תא למינארי.
   1. בעוד תאים הם מפשיר, הכן LB-אגר צלחות (המכיל אנטיביוטיקה מתאימה) על ידי pipetting 50 µL של 0.1 M IPTG, µL 50 של 20 מ"ג/מ"ל של X-גל על גבי המשטח. להפוך את תערובת הבסיס אם ציפוי מספר רב של תגובות. מעיל הלוחות באופן אחיד בעזרת מוט זכוכית סטריליים או חרוזי זכוכית ומאפשרים את הצלחות לנוח ב 37 מעלות צלזיוס למשך לפחות 15 דקות לפני ציפוי חיידקים.
      הערה: לחלופין, הוסף IPTG, X-גל אגר נוזלי לפני הצלחות הם שפכו, 2 מ מ IPTG, µg/mL 40 X-גל הריכוז הסופי. אחסן את הצלחות האלה מחוץ לאורות ישירים כמו X-גל רגישים לאור.
2. על קרח, aliquot 10 µL של תאים המוסמכים עבור כל תגובה לתוך צלחת חדשה של ה-PCR 96-ובכן. זה יהיה הצלחת השינוי.
3. להוסיף 1-3 µL של כל תגובה OutputPlate(s) אל המתאימה היטב הצלחת השינוי, דגירה על קרח למשך 5 דקות.
4. לאטום את הצלחת השינוי עם דבק הלם חום ו קולנוע ב- thermocycler ב- 42 ° C ל 30 s. לאחר מכן, מיד במקום את הצלחת על קרח למשך 2 דקות.
5. לבארות באותה צלחת טרנספורמציה, להוסיף 150 µL של התקשורת SOC, החותם בחותם דבק אלומיניום, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס תוך טלטול-900 סל"ד עבור 1שעות.
6. צלחת את התוכן המלא של כל טוב של הצלחת השינוי על לוחות LB-אגר המבושלות 4.1.1 באמצעות מוט זכוכית סטריליים או חרוזי זכוכית כדי להרגיע באופן אחיד על פני הצלחת. דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

5. לשבט אימות [2 ימים]

1. להכין אחד או כמה התרבות 96-ובכן-באר רחובות עם 1.5 מ ל מרק ליברות (המכיל אנטיביוטיקה מתאימה).
   1. דומה צעד 2.2, לחסן את גושי-באר תרבות עם מושבות לבן יחיד של כל צלחת אגר ליברות של תגובות טרנספורמציה.
   2. לאטום את גושי תרבות גושפנקה גז-חדיר, דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס תוך טלטול-900 סל"ד.
      הערה: מודולרי שיבוט טכניקה מנצל כחול-לבן הקרנה, לכן CFUs חיובי יופיעו לבן על הצלחת LB-אגר, ואילו יעד ריק וקטורים יופיעו כחול.
2. לבודד דנ א פלסמיד מתרבויות חיידקי (כמו 2.3) ולהגיש עבור סנגר רצף כדי לוודא שיבוטים.

תוצאות

כאן אנחנו מדגימים מכלול מודולרי אוטומטי של התקנים 96 דנ א מחלקים שונים בסיסי הדנ א (איור 1b) באמצעות שתי פלטפורמות אוטומטית רובוטית טיפול בנוזלים. כל יחידה תעתיק הוא סידור ליניארי של יחצ ן, אתר קישור ribosomal, ג'ין תעתיק שליחות קטלנית, משובטים לתוך וקטור יעד ספציפי. טאס הם מרכיב מרכזי רבים מעגל גנטי הירארכי עיצובים^28,29,30 , ולכן הם הוכחה הטבעי של המושג עבור גישה זו. . תבדוק-רצף שיבוטים יכולה להיות מושגת ~ 5 ימים מתחילתו ועד סופו, סקירה של זרימת העבודה הציג מוצג איור 1a.

באמצעות הכלי שתואר פרוטוקול, לכדנו שימושי לקביעת פלטפורמת הרכבה אופטימלית נתנו לי מספר מוגדר של תגובות שיבוט להיות שנוצר על-ידי המדען מספר מדדים. איור 2a מדגים השוואה בין זמני התגובה הרכבה על פני כל שלוש שיטות. זמן הביצוע הוא הזמן הכולל כדי להשלים את כל השלבים pipetting הדרושים להרכיב את ריאקציות 96, הכולל dispensing של כל חלקי דנ א, ריאגנטים. הפעם תרגולים מתייחס הזמן הכולל שבן אנוש היה מעורב באופן ידני את הכנת התגובות שיבוט או ההתקנה של התוכנה פועל המטפל נוזלי. איור 2b השוואת עלויות בין השיטות השונות. עלויות הציג לתגובה יחיד שהוכנו על ידי כל שיטה וכוללים את המחיר של אנזימים וטיפים פיפטה חד פעמיות, נתן את העוצמה הנמוכה תגובה טיפוסית (20 µL עבור המטפל נוזלי, µL 10 עבור 250 ידנית, nL עבור מתקן אקוסטית). שיבוטים יחיד של כל 96 תגובות עבור המטפל איך מכינים ערכות הן ידנית והן נוזלי היו רציף, עם תת-ערכה של 12 וסודרו על התגובות מתקן אקוסטית (איור 2 c). רצפים נכונים התקבלו 95% של ערכות המטפל ידנית ולא נוזלי 96. 83% קבוצת מדגם המשנה מנפק האקוסטי ' היו נכונים, אולם שתי התגובות האחרון נכשל להניב כל מושבות לבן, ככל הנראה בגלל ערבוב לא מספיקות של טיפות לאחר dispensing של ה-DNA, ריאגנטים הושלמה. איור דו-ממדי ממחיש את יעילות התגובה שיבוט, כפי שהיא נמדדת על ידי היחס של מושבות לבן למספר הכולל של מושבות, אשר דומות בין באופן ידני (94%) ותגובות נוזלי שהרכבת הנדלר (84 אחוזים). מעניין, כאשר קנה המידה את הווליום התגובה האחרונה עם מנפק אקוסטית, הבחנו מסומן יעילות התגובה כאשר תגובות הוכנו בעוצמות קטן מ- 1 µL (משלימה איור 1 & 2 טבלה משלימה). . זה עשוי בשל התאיידות במהלך התגובה thermocycling, אשר יכול לגרום לעליה בריכוז המלח בעקבות התגובות.

איור 1. אוטומטיות DNA התקן ספריית הרכבה זרימת עבודה.
(א) סקירה כללית של זרימת העבודה ניסיוני המוצג בעבודה זו. (1) חוקרים להעלות קודם Genbank קבצים עבור כל חלקי דנ א & וקטורים היעד שהם רוצים להשתמש. (2) הבא, ה-DNA חלקים כדי להיכלל באסיפה ייבחרו. (3) כלי ואז יפיק בחירה מטפל נוזלי אוטומטיות, כמו גם מפות צלחת לסייע עם האוכלוסייה ידנית עם ה-DNA חלקים של האנזים mastermix. (4) באמצעות ה-DNA & צלחות ריאגנטים, כמו גם הבחירה שנוצר, חוקרים לבצע את מכלול התגובות שיבוט על המטפל נוזלי. (5) פעם אחת להשלים, התגובות טרנספורמציה, מצופה לניתוח במורד הזרם. (b) רשימה של DNA חלקים שימוש בעבודה זו. סך של היזמים שלוש, שלוש ribosomal מחייב אתרים, ארבעה קידוד רצף, ושימשו המחסל תעתיק אחד ליצור ספריית קומבינטורית טאס 96. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

באיור 2. השוואות בין שלוש שיטות הרכבה תגובה אחרת.
(א) זמן התגובה ההתקנה עבור 96 תגובות התאספו באופן ידני, באמצעות מלווה נוזלי, ועל ידי מתקן אקוסטית. הרכבה ידנית לקח 2 h 10 דקות, אשר כולם הפעם תרגולים. המטפל נוזלי לקח כמות דומה של זמן (2 שעות 6 דקות) כדי לבצע את פקודות pipetting, אולם רק שבריר של אותה תקופה (5 דקות) היה על הידיים. מנפק אקוסטית ארכה פחות באופן משמעותי לביצוע העברות נוזלי (5 דקות), לקח זמן מינימלי על הידיים (5 דקות). (b) מחיר התגובה שיבוט יחיד עבור כל שיטת ההרכבה. מחיר זה כולל את העלות של אנזימים בשימוש, כמו גם עצות פיפטה. (ג) קביעת רצף תוצאות מושבות יחיד של כל 96 התאספו טאס. האחוז של שיבוטים הנכון היה מקביל לרוחב כל שיטות ההרכבה. שימו לב כי רק ערכת משנה (12) של ההרכבות מלא 96 השתנו מ מנפק אקוסטית הכין דגימות. שתי תגובות נכשלה תשואה בכל מושבות לבן, ככל הנראה בשל ערבוב לא מספיקות של הדנ א & אנזים mastermix טיפות ב OutputPlate. (ד) השוואה של שיבוט יעילות התגובה בין ידני נוזלי מוכן המטפל תגובות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משלימה איור 1. התגובה היעילות פוחתת עם הפחתת נפח התגובה.
התגובה היעילות ירידה ניכרת כאשר להצטמצם התגובה אחסון מתחת 1 µL. מגמה זו נתפסת עם שני הסופי DNA ריכוזים שונים; עם זאת, מדענים יכול לבחור להשתמש באמצעי אחסון קטן יותר כדי לחסוך בעלויות ריאגנט אם יכול להיות נסבל נמוכה יותר. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלימה טבלה 1.
שולחן של פרמטרי מחלקה נוזלי DNA ואנזים עבור אמצעי אחסון pipetting שונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלימה בטבלה 2.
התגובה יעילות חישובים. מספרים CFU raw מקבלים 12 של 96 תגובות טרנספורמציה שהוכנו באופן ידני, דרך המטפל נוזלי. מספרים CFU ניתנים גם בדיקה של אמצעי אחסון קטן יותר תגובה סופית על מנפק אקוסטית. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

לסיכום, אוטומציה מלאה DNA התקן תהליך היצירה, החל ב- silico בתכנון וכלה טיפול בנוזלים, היא מטרה מעשית עם הקיימת כיום הטכנולוגיה. תוכנה ורובוטיקה מודרניות לאפשר יצירת זרימות עבודה הינם חסכוניים, היעילה, מדרגי, תוך שהיא גם תוצאות לשחזור באופן עקבי יותר מאשר בשיטות ידניות. בעוד אוטומציה עשוי להיות לא תמיד הבחירה הכי חסכונית עבור ביצוע פרוטוקול, היא לשפר את ניסיוני הפארמצבטית, חוקר בעל ערך זמן פנוי. עם זאת, תלוי בחומרה מנוצל, השימוש באוטומציה לפעמים נסיעה עלות וזמן ביצוע מתחת מה יכולה להיות מושגת באמצעות שיטות קונבנציונליות ידנית. יתר על כן, אוטומציה לוכדת פרוטוקולים באופן מפורש באופן פורמאלי מניעת אד-הוק, artisanal, ומבוססות מומלצת אנקדוטיים ניסויים. כאן הוכח הרכבה אוטומטית של מכשירי ה-DNA מודולרי, פרוטוקול, קבצים אלקטרוניים ומשאבים פיזיים דנ א הדרוש עבור הקורא לבצע אלה, דומה, ניסויים על עצמם הינם מסופקים. אנו מקווים הזמינות של הכלי שלנו, פרסום פרוטוקול זה לשמש משאב ולהזיז את השדה לקראת עתיד שקוף יותר, קהילתיים באזור של ה-DNA מכלול התהליכים ונוזלים טיפול רובוטיקה.

התועלת של אוטומציה החומרה תלויה ברובה תצורת & היכולות של הציוד הזה. למשל, המטפל נוזלי שלנו משתמשת הזחה נוזל מערכת כדי להניע וביופסיה ולא לוותר על פקודות. ה פיסטונס כי הכונן הנוזל המערכת הם גדולים יחסית 1 מ"ל מזרקים של אשר, בזמן שימושי עבור מגוון רחב של אמצעי אחסון, מטיל מגבלה נמוכה יותר 2 µL עבור dispensing מדויק של ריאגנטים. כתוצאה מכך, אנו מדורגים את הנפח הכולל של שיבוט תגובות להגדיר על המטפל נוזלי כדי 20 µL, מאז כל לוותר על הפקודה צריך להיות ≥2 µL. זה יעיל הוכפל העלות לכל תגובה לתגובות נוזלי מוכן המטפל, אולם הקטינה באופן משמעותי משך הזמן על הידיים נדרש לבצע את התגובות האלה. במאמץ כדי לטפל בבעיה זו, אנחנו חזר על הגדרת תגובה עבור כל 96 תגובות על מתקן נוזלי אקוסטית. מכשיר זה משתמש באנרגיה קול כדי לשלול נוזל ישירות מתוך לוח אחד למשנהו, והוא יכול להשיג לוותר על אמצעי אחסון הרחק למטה (2.5 nL) מה אפשרי עם עקירה אוויר רגיל המבוסס על פיפטות ידנית. שימוש במכשיר זה, היינו מסוגלים לטפס למטה את הנפח הכולל של התגובות שלנו 250 nL, ירידה 40-fold בהשוואה מוכן באופן ידני תגובות של 10 µL. בגלל אמצעי האחסון קטן בגליל, העדר טיפ שינויים בין שלבים pipetting, מנפק אקוסטית היה מסוגל לייצר לאותן תגובות 96 בשבריר מהזמן (< 5 דקות). אמצעי האחסון התגובה קטן יותר גם לשמור על ריאגנטים מבוזבז, מאז אנחנו בדרך כלל רק שינוי צורה 1-3 µL של התגובה. זאת, השימוש של חומרה אוטומציה, יחד עם תוכנה אינטואיטיבית, באפשרותך להפוך הדור של מספרים גדולים של ה-DNA הרכבה תגובות נגיש קהל אקדמי הרבה יותר רחב.

. הנה, נדגים את התועלת של כלי התוכנה שלנו, עם זאת ישנם מספר תכונות אשר יסייעו להרחיב את השימושיות שלה. ראשית, בכל פעם שהכלי משמש להפקת אסיפה קומבינטורית, לוחיות הרישוי של החלק ה-DNA להפיקם, הדורשים המדען לאכלוס הצלחות האלה באופן ידני עבור כל הרכבה לרוץ. זה יהיה מועיל, במקום זאת, אם המדען יכול לציין את המיקום של חלקים בצלחת דנ א כדי לשמש בהרכבה. זה יאפשר השימוש תפוקה גבוהה פלסמיד ערכות טיהור DNA כיוון חוקרים יכולים לחסן תרבויות ערכה כמו הספרייה MoClo CIDAR, לטהר כל דוגמאות יחד תוך שמירה על מיקום טוב של כל חלק שצוין בערכה. שנית, הכלי תומך כעת רק את השימוש 96-ובכן צלחות. לפרויקטים גדולים יותר שבו מספר התקנים DNA מאות צריך להיות בנוי, המספר של ה-DNA, ריאגנט היעד צלחות עשוי לעלות על הסיפון קיבולת של המטפל נוזלי. בעיה זו, ניתן להקל לפחות חלקית, על ידי תמיכה עבור תבניות צלחת צפיפות גבוהה יותר (384 או ובכן 1536). לבסוף, הכלי תומך כעת רק סוג אחד של המטפל נוזלי ואסטרטגיה הרכבה הדנ א. אמנם זה יחסית קל להמיר את ההוראות המיוצר כלי המטפל נוזלי לתבנית מנפק אקוסטיים באמצעות תוכנת הגיליון האלקטרוני, אנו מקווים להרחיב תמיכה מקורית רבים המטפלים נוזלי שונים אשר ירחיב במידה רבה את תחולתן, כמו תאימות עם טכניקות הרכבה נפוצות אחרות DNA רוצה גיבסון הרכבה³¹.

חלק חיוני של המערכת האקולוגית הזו הרכבה אוטומטית הוא סט של כלי תוכנה שמתרגמת הרכבה ברמה גבוהה תוכניות פרוטוקולים ידידותי אוטומציה המתוזמנים באופן מפורש על נוזל טיפול רובוטים. על פי מספר כלי תוכנה קיימים לאפשר לחוקרים עיצוב הרכבות ב- silico כולל Benchling, MoClo המתכנן של רייבן³², למעטים יש את היכולת לתרגם את התכניות לתוך הוראות הפעלה להפעיל נוזל המטפל. לזה קץ, עבודה כגון יחסי ציבור-יח צ אוטומציה, בובנאי^33,34,35 החלו להפוך כלים אלה זמינים. בנוסף, ישויות מסחריות עובד באזור זה הם בחינת דרכים להציג את "ענן" labs המספקים שירותי ניסיוני לקבוצות גדולות של משתמשי קצה באמצעות אוטומציה. פרוטוקול המתוארים במאמר זה יכול לשמש כאמור חתיכה של כל המאמצים הללו שהן מוצגות כשירות.

בעוד הרכבה אוטומטית של התקני ה-DNA הוא בעל ערך מיידי וברור ביולוגיה סינתטית, פרוטוקול שלנו שימושי עבור הקהילה גדול פיצחו גם. אוטומציה של מכלול ה-DNA מאפשר מספר רב של ידועים, אך מכשירים דומים, גנטי ליצור במקביל והוא יכול לאפשר סינתזה מהירה של הביטוי ספריות הקרנת ולבדיקה למטרות בלימודי פיתוח התרופה. אנו מקווים כי-כלי תוכנה שלנו מאמצים גדולים קומבינטורית מבוססי DNA הרכבה נגיש יותר, לשמש משאב שימושי הן ביולוגיה סינתטית, כמו גם הקהילה האקדמית גדול יותר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hardware / Software
Freedom EVO 150 Liquid Handling Robot	Tecan		Custom liquid handler fitted with an 8-channel pipetting arm http://lifesciences.tecan.com/products/liquid_handling_and_robotics/freedom_evo
Freedom EVOware Standard (Version 2.4 Service Pack 2)	Tecan		Software used to control the Freedom EVO 150 liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/software/freedom_evoware
Echo 550	Labcyte		Acoustic Liquid Dispenser http://www.labcyte.com/products/liquidhandling/echo-550-liquid-handler
Sorvall Legend RT	Sorvall		Large benchtop swing-bucket sentrifuge
MasterCycler Pro	Eppendorf	950040015	Thermocycler with 96-well heat block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/PCR-44553/Cyclers-44554/Mastercycler-pro-PF-5193.html
ECHOTHERM Chilling/Heating Dry Bath	Torrey Pines Scientific		Heating/Chilling block for EVO 150 deck https://www.torreypinesscientific.com/products/chilling-and-heating-dry-baths/echotherm-ric20-series-remote-controlled-chillingheating-dr
Tabletop Microcentrifuge 5418	Eppendorf	5418000017	Stardard 18-well microcentrifuge https://online-shop.eppendorf.com/OC-en/Centrifugation-44533/Centrifuges-44534/Centrifuges-5418--5418R-PF-9257.html
Name	Company	Catalog Number	Comments
Resources
mocloassembly.com	Lattice Automation		Web-tool for combinatorial DNA assembly mocloassembly.com
CIDAR MoClo Parts Kit	AddGene	1000000059	Kit of bacterial glycerol stocks for all DNA parts used in this study https://www.addgene.org/cloning/moclo/densmore/
CIDAR ICE Registry	CIDAR Lab		Registry of plasmid DNA maps https://ice.cidarlab.org/folders/8 https://synbiohub.programmingbiology.org/public/bubdc_ice/bubdc_ice_folder_8/current
Name	Company	Catalog Number	Comments
Labware
50 μL Conductive Tips	Tecan	30 057 818	Sterile 50 μL conductive tips for Tecan liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/consumables/disposable_tips/liquid_handling_disposable_tips
2 mL Deep 96-well Culture Plates	USA Scinetific	5678-0285	Bacterial culture plates used for culturing of large numbers of samples http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-1-3-2-0ml-deepwell-plates-shared-wall-technology.html
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	USA Scinetific	1615-5599	Disposable microcentrifuge tubes http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-colors.aspx
Breathe Easier sealing membrane	Sigma-Aldrich	Z763624-100EA	Breathable sealing membrane for bacterial culture plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z763624?lang=en&region=US
Full-Skirted, Low-Profile, 96-Well PCR Plates	GeneMate	T-3183-2	PCR plates used for all steps https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-3183-R
Alluminum Sealing Foil for PCR Plates	GeneMate	T-2451-1	Alluminum seals for PCR plate storage https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2451-1
Polyolefin Sealing Film for PCR Plates	GeneMate	T-2450-1	Plastic seals for PCR plates during cycling https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2450-1
PCR Cooler	Eppendorf	22510525	96-well cold block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Temperature-Control-and-Mixing-44518/Accessories-44520/PCR-Cooler-PF-55940.html
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
GenCatch Plasmid DNA Mini-Prep Kit	Epoch Life Sciences	2160250	Plasmid DNA purification kit http://www.epochlifescience.com/Product/PurificationKit/dna_mini.aspx
T4 DNA Ligase (HC)	Promega	M1794	High concentration T4 DNA Ligase https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/molecular-biology-enzymes-and-reagents/t4-dna-ligase/?catNum=M1794
BbsI Restriction Enzyme	New England Biolabs	R0539L	BbsI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r0539-bbsi
BsaI Restriction Enzyme	New England Biolabs	R0535L	BsaI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r3535-bsai-hf
T4 DNA Ligase Buffer Pack	Promega	C1263	10x T4 DNA ligase buffer https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/t4-dna-ligase/
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Zymo Research	I1001-25	0.5M IPTG Solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/isopropyl-ss-d-thiogalactopyranoside-iptg
5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside (X-GAL)	Zymo Research	X1001-25	20 mg/ml X-GAL solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-d-galactopyranoside-x-gal
Kanamycin Sulfate	Zymo Research	A1003-25	35 mg/ml Kanamycin solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/antibiotics/kanamycin-sulfate
Carbenicillin (Disodium Salt)	Fisher	BP26481	1 g Carbenicillin (Ampicillin analog) https://www.fishersci.com/shop/products/carbenicillin-disodium-salt-fisher-bioreagents-3/p-25005#?keyword=carbenicillin
SOC Broth Media	Teknova	S0225	Powder media used to make SOC broth http://www.teknova.com/SOC-BROTH-MEDIA-p/s0225.htm
LB Broth (Lennox) Media	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	Powder media used to make LB broth http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l3022?lang=en&region=US
LB Broth with agar (Lennox) Media	Sigma-Aldrich	L2897-1KG	LB with agar mix used for making solid media plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l2897?lang=en&region=US
Alpha-Select Gold Efficiency Competent Cells	Bioline	BIO-85027	High efficiency chemically competent E. coli cells http://www.bioline.com/us/alpha-select-gold-efficiency.html
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primers
Primer VF			5'-TGCCACCTGACGTCTAAGAA-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs
Primer VR			5'-ATTACCGCCTTTGAGTGAGC-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs