פיתוח זיהוי של subpopulation רומן של אדם נויטרופילים הנגזר הענק Phagocytes<em&gt; במבחנה</em

Summary

אנו מתארים כאן שיטה לקבלה והגדרה תת-אוכלוסייה חדשה מאופיינת של פגוציטים ענקים הנגזרות נויטרופילים. תאים אלה להתפתח תרבות מן נויטרופילים דם אדם טריים, ומאופייני phagocytosis, autophagy, גודל גדול מאוד, ואת תוחלת חיים מורחבות. שיטה זו היא חיונית כדי להמשיך לחקור תת-אוכלוסייה ייחודית זו נגזרה-נויטרופילים.

Abstract

נויטרופילים (PMN) ידועים ביותר עבור פונקציות phagocytic שלהם נגד הפולש פתוגנים ומיקרואורגניזמים. יש להם זמן מחצית החיים הקצר בין לויקוציטים במצב שאינו מופעל שלהם מחויבים constitutively אפופטוזיס. כאשר גייסו לאתרים דלקתיים לפתור דלקת, הם מייצרים מערך של מולקולות ציטוטוקסיות עם הרג מיקרוביאלית חזק. עם זאת, כאשר מולקולות ציטוטוקסיות עוצמה אלה משתחררים בצורה בלתי מבוקרת הם יכולים לגרום נזק לרקמות שמסביב. בשנים האחרונות עם זאת, צדדי נויטרופילים מתבטא יותר ויותר, על ידי הוכחת פונקציות פלסטיות immunoregulatory. זיהינו לאחרונה תת-אוכלוסייה חדשה נגזר נויטרופילים, מפתח ספונטני בתנאי תרבות סטנדרטיים ללא תוספת של גורמי ציטוקינים / צמיחה כגון גורם מגרת מושבת גרנולוציט (GM-CSF) / interleukin (IL) -4. יכולות phagocytic שלהם של שרידי נויטרופילים בעיקר לתרום להגדיל שלהםגודל מאוד; ולכן הם כונו פגוציטים ענקים (Gφ). בניגוד נויטרופילים, Gφ הם חיו זמן רב בתרבות. הם מבטאים את המקבץ של סמנים נויטרופילים בידול (CD) CD66b / CD63 / CD15 / CD11b / myeloperoxidase (MPO) / אלסטט נויטרופילים (NE), והם חסרים את CD14 סמני שושלת monocytic / CD16 / CD163 ואת סמני הדנדריטים CD1c / CD141 . הם גם לקחת- up לטקס zymosan, ולהגיב על ידי פרץ חמצוני גירוי עם opsonized-zymosan ו PMA. Gφ גם לבטא את הנבלות קולטניות CD68 / CD36, ובניגוד נויטרופילים, להפנים ליפופרוטאין בצפיפות חמצון-נמוך (oxLDL). יתר על כן, בניגוד נויטרופילים טריים, או מונוציטים בתרבית, הם מגיבים ספיגת oxLDL ידי מינים חמצן תגובתי מוגברת (ROS) ייצור. בנוסף, פגוציטים אלה מכילים vacuoles microtubule הקשורים חלבון-1 אור שרשרת 3B (LC3B) מצופה, המציין את ההפעלה של autophagy. באמצעות מעכבים ספציפיים ניתן לראות כי הן phagocytosis ו autophagy הוא prerequisites לפיתוח שלהם NADPH סביר מונואמין תלויה ROS. אנו מתארים כאן שיטה להכנה תת-אוכלוסייה חדשה זו של תאי phagocytic הקבועים לטווח הארוכים, נגזר-נויטרופילים בתרבות, זיהוי שלהם מאפיין כיום הידוע שלהם. פרוטוקול זה הוא חיוני עבור קבלה ואפיון Gφ כדי להמשיך לחקור משמעות ואת תפקידיהם.

Introduction

נויטרופילים polymorphonuclear (PMN) מהווים את האוכלוסייה הגדולה ביותר של לויקוציטים בדם, אשר מהווים את קו ההגנה הראשון נגד פולש פתוגנים על ידי ייצור מגוון רחב של מולקולות ציטוטוקסיות. ההשקפה המסורתית כבר זמן רב של מחזורי דם, קצר מועד, פגוציטים מקצועי, אשר הם הראשונים להגיע לאתרים דלקתיים חריפים כדי להילחם בזיהומים וסיוע האישור של פתוגנים וחלקיקים מזיקים. ¹ במצב שאינו מופעל שלהם, נויטרופילים הם constitutively מחויב אפופטוזיס. כשמעבירים מהדם לאתרים דלקתיות, נויטרופילים עוברים שפעול לפתור דלקת. הם phagocytose ולהרוג פולשי מיקרואורגניזמים, על ידי ייצור מערך של מולקולות ציטוטוקסיות כמו מיני חמצן תגובתי (ROS), אנזימים ממסים כגון אלסטט נויטרופילים (NE) ו cathepsins עם פעילות microbicidal חזקה. כדי פתוגנים מלכודת, נויטרופילים גם לשחרר מלכודות תאיות (נטס) אשר מורכבים מחוטי הכרומטין גרעיניים המכילים פפטידים אנטיבקטריאלי ואנזימים ממסים שונים. עם זאת, שחרור לא מבוקר של מולקולות ציטוטוקסיות אלה נויטרופילים יכול גם להנציח תגובות דלקתיות ולגרום נזק לרקמות שמסביב. לכן ^2, של פינוי יעיל של נויטרופילים אפופטוטיים ידי מקרופאגים (Mφ) ותאים דנדריטיים (DC) הוא חיוני כדי לפתור דלקת. ^{3, 4, 5, 6}

בשנים האחרונות עם זאת, זה הפך להיות ברור יותר ויותר כי נויטרופילים הם מאוד תאים צדדיים, שתפקידיה הרבה מעבר phagocytosis והרג הפתוגן. ^{6, 7} על ידי עובר יחול או הפעלה, פלסטיות נויטרופילים הן צוברות תשומה בהדרגה. למשל, חיידקים mycobacteria נויטרופילים תיגר הוצגומפרישי interleukin (IL) -10 ולשלוט התגובה הדלקתית, דבר המצביעים על הנוכחות של תגובות חיסוניות רגולטוריות. פוסט mitotic ⁸ נויטרופילים הוצגו טרנס-להתמיין לתאי Mφ דמוי, או דמויי תאים DC ידי לעכל והצגת שברי אנטיגן כאשר טופלו ציטוקינים גורמי גדילה, ^{9, 10} ובכך, המשרתים תפקיד קריטי שילוב מולד אדפטיבית תגובות. ^{3, 6} הפעלה באמצעות גורמי גדילה קדמה לבליעת נויטרופילים אפופטוטיים או פסולת תא, ובכך, להקל אישור של פסולת באתרים דלקתיים ההחלטה של דלקת, ^{3, 9} במיוחד כאשר למערכת סליקת Mφ / DC אינה מספיקה או המומה, ^{11, 12} דבר המצביע על 'הסדרה עצמית' פוטנציאל לסייע מחדשלפתור את התגובה הדלקתית. זה, מאז אפופטוזיס הוא צורה של מוות עצמי מוסדר אשר יכול לעכב את שחרורו התאי של תרכובות ציטוטוקסיות ובכך למנוע פגיעה ברקמות שמסביב. ⁶

הישרדות ממושכת היא תכונה נוספת של הפעלת נויטרופילים הודגם על ידי טיפול עם גורמים מארח שונים הנגזרים כגון גורם מגרה המושבה גרנולוציט (G-CSF), גורם מגרה המושבה מקרופאג-גרנולוציט (GM-CSF), ציטוקינים דלקתיים כגון אינטרפרון ( IFN) -γ, tumor necrosis factor (TNF) -α ו / או פתוגן מוצרים נגזרים, ובכך, המאפשר נויטרופילים לווסת בתגובת ההישרדות שלהם. ⁶ למעשה, הישרדות נויטרופילים היא תנאי הכרחי הפלסטיות שלה היה קשורה יכולתה לבצע phagocytosis. ^{6, 13} בהתאם לכך, ניתן היה לראות גם לקשר עם שינויים פנוטיפי ופונקציונלי אשר depenטוליפ אין על ביטוי גנים שהוגברו על ידי גרימת בסינתזה של חלבונים חדשים המעורבים הארכת תוחלת החיים נויטרופילים, אפופטוזיס פחתה. ¹⁰

בניגוד נויטרופילים אשר הן קצרות מועד ו constitutively עוברים אפופטוזיס בתרבות, או ציטוקינים / צמיחה גורמים המופעל נויטרופילים, שתוארו לעיל, אשר הרחיבו את תוחלת החיים, זיהינו לאחרונה תת-אוכלוסייה חדשה, קטנה של נויטרופילים שמתפתח באופן ספונטני תרבות סטנדרטי ממושך תנאים מ נויטרופילים בדם אדם מבודדים טרי בלי חיצוני הוספת ציטוקינים או גורמי גדילה. ¹⁴ אלה הנגזרות תאים נויטרופילים, אשר לא תוארו לפני בספרות היו פגוציטים ענקים כינה (Gφ). Gφ הרחיב תוחלת חיים בתרבות, הם מפותחים בתוך 5-7 ימים, ומאופיינים תכונות מורפולוגיות ייחודיות, ביטוי פנוטיפי ופונקציות. הם מוגדלים בהרבה בשל autophagocytosis של שרידי נויטרופילים מת, vacuolated, ומכילים phagolysosomes. Gφ להביע את הסמן גרגרי נויטרופילים ספציפי - מקבץ של 66b בידול (CD), סמנים גרגרי azurophilic - CD63 ו myeloperoxidase (MPO) וסמנים נויטרופילים נוספים כגון CD11b, NE, CD15, יחידות משנה מונואמין NADPH gp91- phox ו p22- phox, ואת -LC3BII סמן autophagy. ^{14, 15} מבחינה תפקודית, הם פעיל לקחת- up חרוזים לטקס וחלקיקים zymosan, וליצור ROS בתגובה zymosan ו phorbol 12-myristate 13-אצטט (PMA) גירוי. מעניין לציין, כי בניגוד נויטרופילים טריים, Gφ גם באינטנסיביות להביע את הקולטנים נבלות CD68 ו CD36, לקחת- up חמצון ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (oxLDL), וליצור ROS בתגובה לגירוי עם oxLDL. בנוסף, Gφ הם נטולים סמני שושלת monocytic CD14, CD16 ו CD163 או סמני הדנדריטים CD1c ו CD141. יתר על כן, PHAgocytosis ו autophagy ו מונואמין NADPH התפקודי סבירה הם תנאים מוקדמים להתפתחות שלהם. זה מאז, B cytochalsin-מעכב phagocytosis, מעכבי autophagy 3-methyladenine (3-MA) ​​bafilomycin (BafA1) ואת מעכב מונואמין NADPH - diphenylene iodonium (DPI) - מנעה התפתחותם. בנוסף, מונוציטים / נויטרופילים שיתוף תרבויות וכן חשיפה היפוקסיה לסירוגין הקשה התפתחותם, ואילו הסתגלות נויטרופילים היפוקסיה המתמשכת ניכרת. ^14,15 הפיתוח המומלץ שלהם בתרבות מודגם בפרוטוקול איור 1 .the בעיתון הנוכחי מתאר צעד אחר צעד להכנת Gφ מ מבודד טרי במחזור נויטרופילים בדם אדם, התפתחותם, זיהוי כמה מאפיינים בסיסיים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את הנושא ולחשוף את הקשת הרחבה ואת התפקידים של תארו אלה שזה עתה נויטרופילים הנגזרות מסקרן Gφ כדי characterizדואר משמעותם ופונקציות הפוטנציאל שלהם.

איור 1: ייצוג סכמטי של פיתוח תאים ענק ב -7 תרבויות יום נויטרופילים. הוא הציע כי באתרים דלקתיים (1) נויטרופילים עוברים מוות של תאים אפופטוטיים, ו (2) שחרור קרום מסביבו שברים המכילים פסולת גרעינית, גרגירים (ירוק ונקודות אדומות), ואת מרכיבי תא אחרים אשר לעורר מנגנוני autophagy. (3) פגוציטים ענקים (Gφ) לפתח בתרבויות נויטרופילים לטווח ארוך נטולות ציטוקינים או גורמי גדילה באמצעות הפנמת גופים אפופטוטיים ופסול נויטרופילים, תוך שמירת oxidase.They NADPH התפקודית מאופיינים השונה neutrophilic CD66b + / CD63 + / MPO + / CD15 + / CD11b + / סמני NE, phagosomes הגדול תוחם גרגרים ופסולת תאית, וקולטנים נבלות CD36 ו CD68. Gb1; הם בעיקר תאי mononucleated, מסוגלים להפנים חלקיקים שונים וגם LDL מחומצן וליצור ROS. הממברנות של vacuoles מילוי Gφ מכילות LC3B (מסומן בכחול כהה), סמן של קרום autophagosomal, דבר המצביע על קשר בין קפדן autophagy והיווצרות תָא בַּלעָן ענקית. Gφ אינם מפתחים במדיום המכיל GM-CSF / IL-4. כמו כן, מעכבי כגון מעכבי מונואמין NADPH - iodonium diphenylene (DPI), מעכבי autophagy 3-methyladenine (3-MA) ​​bafilomycin (BafA1) ואת B phagocytosis מעכב cytochalasin (. Cyto B) לבטל היווצרותם. (4) פונקציות Gφ פוטנציאל in vivo עשויות לכלול תכונות אנטי או פרו-דלקתיות והשתתפות בתהליכים טרשתיים (נתון זה מבוסס על ממצאינו ^{14, 15} ו שונה מן המערכה נלווית ידי Berton ^20). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Protocol

הפרוטוקול אושר על ידי ועדת זכויות האדם של התושבים המקומיים על פי ההכרזה של הלסינקי, וכל המשתתפים חתמו על טופס הסכמה מדעת.

בידוד נויטרופילים 1. ופיתוח של Gφ בתרבות

הערה: כל הצעדים צריכים להתבצע באמצעות lipopolysaccaride כיתה רקמה סטרילית (LPS) פתרונות -חינם במנדף זרימה ביו בטיחות למינרית. אל תוסיף אנטיביוטיקה, ציטוקינים או גורמי גדילה למכון ממוריאל פארק Roswell (RPMI) -1640 בינוני.

1. להשיג לפחות 40 מ"ל דם ורידי ממבוגרים צעירים ובריאים באמצעות מערכת וריד הקרקפת סטרילי. להקיז דם לתוך צינורות Vacutainer המכיל ethylenediamine טטרה חומצה אצטית K ₃ מלח (K ₃ EDTA) ומערבבים בעדינות. שמור את הדם בטמפרטורת החדר.
2. לבודד את נויטרופילים ידי שני צעד שיפוע צפיפות רציפה באמצעות polysucrose ב 1.119 ו 1.077 גרם / מ"ל. תביאו פתרונות לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
   הערה: במהלך צנטריפוגה, דם אדוםתאים (RBCs) נצברים ידי polysucrose ומשקעים במהירות. תאי mononuclear (מונוציטים / לימפוציטים) נמצאים בין הפלזמה העליונה / polysucrose -1077 ממשק, ואילו נויטרופילים נמצאים בדיוק מעל פני כדוריות הדם האדום, בבית polysucrose -1077 / 1,119 הממשק (ראה איור 2). שיטה זו מאפשרת הפרדה זמנית של תאים mononuclear ו נויטרופילים מאותו אדם.

איור 2: בידוד נויטרופילים מן האנושי כולו דם. Polysucrose בכל 1.077 גרם / המ"ל הוא שכבתי בזהירות על גבי polysucrose-1.119 גרם / מיליליטר כדי ליצור שיפוע רציף. הדם כולו המדולל הוא שכבתי אז על גבי polysucrose-1.077. צינורות חשופים מיד צנטריפוגה ב XG 700 במשך 30 דקות, בטמפרטורת החדר ללא בלם. שלוש להקות שונות מצוינות. (א) תאים mononuclear, (ב) בתאים polymorphonuclear (PMN),ו- (ג) תאי דם אדומים (RBC) בתחתית של התחתית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

1. להוסיף 12 מ"ל polysucrose-1119 לחלק התחתון של צינור צנטריפוגות חרוטי פוליפרופילן סטרילי 50 מ"ל.
2. בזהירות שכבת 12 מ"ל של polysucrose-1077 על polysucrose -1119.
3. לדלל 10 - 12 מ"ל דם מלא לנפח סופי של 24 מ"ל דם עם בופר פוספט חינם יון (PBS) המכילה סרום העובר עגל מומת 2% חום (HI-FCS). בזהירות שכבת 24 מיליליטר של דם המדולל השלם על השיפוע העליון של הצינור.
4. צנטריפוגה ב XG 700 במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (20 - 24 מעלות צלזיוס) ללא הבלם.
   הערה: צנטריפוגה בטמפרטורות נמוכות עלולה לגרום clumping תא והתאוששות עניה.
5. מוציאים בזהירות את הצינורות מן בצנטריפוגה without להפריע שיפוע. שתי שכבות אטומות יש לשים לב (א: תאי mononuclear ו- B: PMN, מתואר באיור 2).
6. לשאוב ולזרוק למעלה נוזל 0.5 ס"מ מעל העברת שכבת א (או השלך) התאים משכבה זו לצינור מסומן "mononuclear".
7. לשאוב ולזרוק למעלה נוזל הנותרים 0.5 ס"מ מעל B. שכבת העברת התאים משכבה זו כדי צינור שכותרתו "PMN".
8. PMN בריכה משני כל צינורות שיפוע ולשטוף עם PBS המכיל 2% HI-FCS לנפח סופי של 30 מ"ל. צנטריפוגות במשך 12 דקות ב 200 XG, להסיר את supernatant וזורקים.
9. כדי להיפטר זיהום תאי דם אדומים (RBC), להוסיף 3 מ"ל של NaCl סטרילי קר כקרח hypotonic 0.2% תוך resuspending את הכדור על ידי ציור בעדינות פנימה והחוצה עם טיפ pipet 1 מ"ל סטרילי. שמור על קרח למשך 30 שניות.
10. לאחר 30 שניות, לשחזר isotonicity על ידי הוספת 3 מ"ל של NaCl קרים כקרח סטרילי 1.6% אל הצינור.
11. אל 6 מ"ל של סליין איזוטוני, להוסיף 6 מ 'l של טרום התחמם (37 ° C) בינוני RPMI-1640 בתוספת 2% HI-FCS ו צנטריפוגות ב 250 XG במשך 12 דקות. בטל supernatant. גלולת PMN צריכה להיות נקיה של זיהום RBC.
    הערה: אם מזוהמת RBC, גלולת PMN מופיעה אדמדמה.
12. אם חלק RBC זיהום להישאר, חזור על שלבים 9 ו -10 פעם נוספת.
13. Resuspend התא גלולה ב 4 מ"ל RPMI-1640 בתוספת 10% HI-FCS לספור את התאים כדי לקבוע ריכוז ואת הכדאיות שלהם על ידי הרחקה כחול trypan.
14. התאם את הריכוז ל -1.25 - 1.5 x 10 ⁶ PMN / מ"ל (תלוי לצרכים ניסיוניים), צלחת 1.0 מ"ל / גם בצלחת 24 היטב.
    הערה: טוהר נויטרופילים באוכלוסייה גרנולוציט תמיד חרג 95%, כפי שהוערך על ידי במאי גרונוואלד-Giemsa מכתים מיקרוסקופ אור.
15. לאחר זריעה, למקם את התאים 5% CO ₂ באינקובטור humidified על 37 מעלות צלזיוס.
16. החלף בינוני כל 3 ימים על ידי aspirating חצי בעדינות שלהמדיום והוספת נפח זהה של מדיום חדש RPMI-1640 בתוספת 10% HI-FCS. פתרונות ותרכובות השתמשנו LPS חינם ורמות LPS נמוכות ב HI-FCS (0.05 ng / ml או פחות).
    הערה: שינוי בינוני עדין הכרחי מאז Gφ, אשר לפתח בתרבות לא בתוקף לצרף צלחת תרבות כביסה נמרצת עשויים גם לשטוף את התאים מתפתחים. הופעת Gφ הוא מורגש 3 - 4 ימים לאחר culturing PMN, תלוי תורם דם. רוב ניתוחי המבחנים המתוארים כאן מבוצעים בין 6 - 7 ימים בתרבות, כאשר Gφ גדול מאוד בגודלם. יצוין כי תוספת של 1 - 10 LPS ng / ml עד בינוני RPMI-1640 לא השפיע פיתוח Gφ בתרבות. ¹⁴

2. מיקרוסקופית סריקת לייזר Confocal

1. כן cytospins ¹⁶ מ נויטרופילים טריים מבודדים, ומן 7 תרבויות Gφ שפותח היום(מוכן בסעיף 1).
   הערה: כדי להגדיל את הריכוז של Gφ בצלחת עבור ניתוחים שונים, להסיר בעדינות מחצית בינונית. ודא כי Gφ אינם מזוהים במדיום הוסר על ידי בחינת המדיום תחת מיקרוסקופ אור. ואז, באופן אינטנסיבי pipet המדיום הנותרים להסיר דבק Gφ בקלילות. צנטריפוגה בינוני למשך 10 דקות ב 200 XG, ו resuspend גלולה ב 100 - 120 בינוני μl.
   1. להשתמש 100 - 120 μl של המדיום המכיל תאים עבור כל שקופית. כן שקופיות כפולות או משולשות בין כל טיפול. ספין במשך 7 דקות ב 84 x ז.
2. יבש את התאים הסתובב לתקן את התאים עם paraformaldehyde 4% בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות מתחת למכסה המנוע כימי. 3x לשטוף עם PBS (~ 100 μl במשך כמה שניות לכל לשטוף). עבור מכתים תאיים, permeabilize התאים עם 0.5% Triton X-100 ב PBS בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ולשטוף 5x עם PBS.
   הערה: בכל השלבים, השתמש volu חיץ / פתרון הולםממני למלא את מקומו ההיקף של התאים בשקופית. השתמש בעט מחסום הידרופובי לקביעת היקף תאים.
   זהירות: Paraformaldehyde רעיל. יש להימנע ממגע עם עור ועיניים. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים.
3. בלוק תאים עם 10% נסיוב עז נורמלי במדיום RPMI-1640 ו דגירה לילה בשעה 4 ºC או בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות. לשטוף עם PBS.
4. דגירה עם נוגדן יחיד (AB) או שילוב של עכבר נוגדנים ראשוניים ארנב (ABS) ביחס של 1: דילול 100 (~ 100 μl). דגירה לילה (18 - 20 שעות) בשעה 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: כאן, עכבר Abs monoclonal כללו: אנטי CD14, אנטי CD63, אנטי CD66b, אנטי CD1c, CD15 אנטי, ואנטי-ציטוכרום b-245 שרשרת אור (phox p22- זיהוי). Abs הארנב polyclonal כללו: אנטי CD68, אנטי CD36, אנטי LC3B, אנטי Myeloperoxidase, אנטי-נויטרופילים elastase (NE), ואנטי-Nox2 / gp91- Abs phox. שולט אלוטיפ כלול IgG1 עכבר המטוהר IgG2, ו IgG ארנב. הכנהדואר את שרירי הבטן על פי הוראות היצרן ולהשתמש נפח מתאים (כ -100 μl) כדי לכסות את ההיקף של התאים.
5. שוטפים את התאים דגירה עם 1/400 משני נוגדנים Cy2-CF (488A) עז מצומדות נגד ארנב IgG (ירוק) ו / או Cy5 (CF 647) עז מצומדות אנטי עכבר IgG (אדום) בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות.
   הערה: לדלל ולהכין Abs פי הוראות היצרן.
6. לאחר הכביסה, הר שקופיות עם טיפה אחת של הרכבה בינונית, המכיל 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) מכתים גרעיני, ומיד למקם את תלוש לכסות.
7. לנתח את השקופיות על ידי מערכת סריקת לייזר confocal באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואובייקטיבי שמן טבילה תוכנית Apo 40X. לבצע את הניתוח בתוך 30 דקות עד 2 שעות לאחר ההכנה של השקופיות או לשמור על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   1. חשב את שטח התא ועוצמת הקרינה באמצעות תוכנת הדמיה (J תמונה למשל). עבור שיתוף לוקליזציה, קואהntify ידי התוכנה באמצעות מאנדרס חפיפה מקדם (MOC) ^17.
      הערה: רק תאים עם MOC> 0.6 יכולה להיחשב תאים עם לוקליזציה שיתוף משמעותית.

3. גלגול של PMN מעבר לתאי אנדותל: אפקטים של IL-8 על הענק תָא בַּלעָן (Gφ) גיבוש

הערה: השתמש 24 גם תרבית תאים חדירה מחדירה עבור assay גלגול תא.

1. מעיל בחדר העליון של הכנס עם 150 פיברונקטין μl בריכוז של 50 מיקרוגרם / מ"ל, לשמור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
2. הוסף בחדר העליון 5 x 10 ⁴ EA.hy926 תאי אנדותל / טוב, resuspended ב 150 μl של הבינוני של הנשר השונה של ניסח Dulbecco (מדיום גידול להשלים).
   הערה: ודא כי monolayer האנדותל הוא ומחובר לפני השימוש.
3. כדי בתא התחתון, להוסיף 700 μL של מדיום הגידול להשלים.
4. מניחים את חדירתרבית תאים מוסיף במגשים אשכול ותרבות לתאי אנדותל EA.hy926 עבור 2 ימים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO _2.
   הערה: במקביל, ביום השני להכין PMN טרי (כמתואר בסעיף 1).
5. אחרי 2 ימים, להחליף את המדיום בתא התחתון והעליון של המוסיף.
   1. כדי בתא התחתון, להוסיף בינוני RPMI-1640 בתוספת 10% IH-FCS ו interleukin (IL) -8 בריכוז סופי של 50 ננומטר / מ"ל. אל תוסיף IL-8 לשלוט בחדרים תחתונים.
   2. לכל חדר עליון, להוסיף 10 ⁶ PMN טרי 100 μl של מדיום RPMI-1640 בתוספת 10% IH-FCS.
6. דגירה המגשימה האשכול ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ למשך 90 דקות.
7. לאחר 90 דקות דגירה, להסיר את התאים מן העליונים תאיים הנמוכה בנפרד ולספור כל תת-אוכלוסייה. תאים אקספרס בתא אחד כאחוז התאים המוסף.
   הערה: מוציאים בזהירות התאים מן chamb העליוןאה על ידי pipetting בעדינות על מנת למנוע הסרת תאי אנדותל ולהעביר צינור סטרילי. הסרת התאים מן בתא התחתון על ידי pipetting ושטיפה בתא התחתון עם 500 μl ולהעביר צינור שני סטרילי.
8. בריכת 10 ⁶ תאים מכמה בארות transmigrating (בתא התחתון) ולא נודדות (הבית העליון) שברים PMN והתרבות בכל למשך 7 ימים ללא גורמי גדילה כמפורט צעדים 14 - 16 (סעיף 1).
9. ספין תאים על גבי שקופיות ¹⁶ ולנתח את התאים פיתחו בכל מצב התרבות על ידי מיקרוסקופ confocal כמתואר בסעיף 2.

תוצאות

נויטרופילים Autophagocytosis ופיתוח תרבות

Autophagocytosis נויטרופילים והתפתחותם לתוך Gφ תוך 7 ימים בתרבות מוצג איורים 3 ו -4. לפי ימים 4 - 7, גודלם היה מוגדל בהרבה, ¹⁵ ו autophagosytosis ניכר כבר 90 דקות אחרי השיתוף culturing נויטרופילים עם כתמי קרום ניאון (PKH-26, אדום; PKH-67, ירוק). ¹⁴ כביקורת על-אוכלוסייה נויטרופילים זה, בתרבויות מסוימות נויטרופילים טופלו גם עם GM-CSF / IL-4. התאים שטופלו ציטוקינים גדלו בתוך 7 - 14 ימים בתרבות כפי שתוארו לעיל. ^{18, 19} אבל, היו קטנים יותר מאשר Gφ והיו תחזיות ציטופלסמית דומות דמויות תאי DC (איור 5), כפי שדווחו בעבר ב y Oehler et al. ¹⁹ כמו כן, תאי GM-CSF / IL-4 מטופלים היו שליליים או היה ביטוי CD66b נמוך, ¹⁵ מפגיני הבדלים מורפולוגיים בבירור ואפשרות פונקציונליים גם כן.

איור 3: Autophagocytosis ב Phagocytes ענק מפתחים (Gφ) בתרבות. טרי נויטרופילים מטוהרים מבודד תויגו עם PKH-67 (ירוק) או PKH-26 (אדום) צבעי ניאון קרום בזמן אפס, ולאחר מכן שיתוף תרבותי והיו במעקב עד שבעה ימים. תאים היו סובבים על גבי שקופיות זכוכית, גרעינים הוכתמו DAPI דגימות נותחו באמצעות מיקרוסקופיה confocal. Autophagocytosis כבר מורגש לאחר 90 דקות של תרבות משותפת. מיזוג של אדום וירוק לתוך צהוב וכתום ניכר בבירור בפיתוח Gφ. קבצים / ftp_upload / 54,826 / 54826fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: פיתוח של הענק Phagocytes (Gφ) בתרבות. טרי נויטרופילים מטוהרים מבודדים היו במעקב עד 7 ימים בתרבות. תאים היו סובבים על גבי שקופיות זכוכית במרווחי הזמן המצוינים, מוכתם מאי גרינוולד-Giemsa, ונתחו עם מיקרוסקופ שדה בהיר. אדם עם כמה אאוזינופילים מוצג להשוואה. שימו לב שהגודל של אאוזינופילים נותר ללא שינוי בתרבות. שמן הגדלה 100X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

FO: keep-together.within-page = "1">
איור 5: השוואה בין ההתפתחות הענקית Phagocytes (φ G) ו- GM-CSF / IL מטופלים נויטרופילים בתרבות. (א) במאי נויטרופילים מוכתם גרונוולד-Giemsa מתורבת ללא (Gφ) ועם GM-CSF / IL-4 למשך 7 ימים. דוגמאות נותחו עם מיקרוסקופ שדה בהיר. הגדלה, X40. תאים שפותחו תרבויות עם מדיום השלים עם GM-CSF / להראות IL-4 תחזיות ציטופלסמית נפוצות אך הם קטנים יותר מאשר Gφ. (ב) נויטרופילים מבודדים טרי תויגו עם PKH-26 (אדום) צבע ו בתרבית בינוני ציטוקינים חינם במשך 7 ימים או שכותרתו עם PKH-67 (ירוק) לצבוע בתרבית בינוני השלימו עם GM-CSF / IL-4 עבור 7 ימים. לאחר מכן, התאים פיתחו היו מעורבים ביחס של 1: 1 ו שיתוף תרבותי עבור שעה 2. התאים היו קבועים ונותחו על ידי confocal micr oscopy. נתון זה יש הבדל בין התייחסות. ¹⁵ אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

כדי להמשיך לחקור את מהלך ההתפתחות Gφ, שינויים מורפולוגיים שלהם היו במעקב גם על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות. וידאו-1 (יום 3 עד היום 4) ווידאו-2 (יום 4 עד היום 5) להפגין התפתחותם בתרבויות נויטרופילים מטוהרים. Gφ אלה שאינם חסידים או חסיד בקלילות עם קיבולת תנועה מוגבלת באופן פעיל להיבלע סביב שרידי נויטרופילים ופסולת. בסרטון-3, התנועה של מונוציטים הנגזרות Mφ ו Gφ מושווה בתרבות מונוציטים / נויטרופילים מעורבת. Mφ זוחל פעיל (משמאל, תא ללא תווית). Gφ (מימין), הוא תא בהיר PKH-26 שכותרתו.

ether.within-page = "תמיד">
וידאו-1: מדגים את הפיתוח הענק Phagocytes בתרבויות המטוהר PMN על ימים 3 - 4 על ידי זמן לשגות מיקרוסקופי. נויטרופילים עקבו אחר בתרבות מהיום 3 עד היום 4 על ידי מערכת מיקרוסקופיה זמן לשגות microscopy.The זמן לשגות מורכב מיקרוסקופ פלואורסצנטי ממונע הפוכה, מצלמת CCD ברזולוציה גבוהה B / W, עם על החממה הבמה. רכישת לכידת תמונה של הזמן לשגות נלקחת כל 10 דקות. פורסם במקור בהתייחס ¹⁴ אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.

וידאו-2: מדגים את הפיתוח הענק Phagocytes ב מטוהרי PMN תרבות על ימים 4 - 5 על ידי Tiלי לשגות מיקרוסקופית. נויטרופילים עקבו אחר בתרבות מיום 4 עד היום 5 על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות. מערכת מיקרוסקופיה הזמן לשגות מורכבת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הממונעת הפוכה, מצלמת CCD ברזולוציה גבוהה B / W, עם על חממה הבמה. רכישת לכידת תמונה של הזמן לשגות נלקחת כל 10 דקות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.

וידאו-3: ענק תָא בַּלעָן וכן Macrophage פותח Co-תרבות. מונוציטים / נויטרופילים שיתוף התרבות היה במעקב מהיום 4 עד היום 5 על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות. מקרופאג הנגזרות מונוציטים (משמאל); בהיר (PKH-26 מוכתם התא) תָא בַּלעָן ענק הנגזרות נויטרופילים (מימין). מערכת מיקרוסקופיה זמן לשגות עבור וידאו מורכב micr פלורסנט ממונע הפוכהoscope, ומצלמת CCD ברזולוציה גבוהה B / W, עם על חממה הבמה. רכישת לכידת תמונה של הזמן לשגות נלקחת כל 10 דקות. פורסם במקור בהתייחס ¹⁴ אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.

ביטוי של סמנים הענקים Phagocytes

מקורו neutrophilic של Gφ אומתה על ידי ביטוי חיובי של סמנים נויטרופילים הבאים CD66b / CD63 / MPO / NE / CD15 (איור 6). Gφ גם הביע מונואמין NADPH, הקולטנים נבלות oxLDL - CD68 ו CD36, והכילה LC3B מצופה vacuoles אגרגטים (מזוהה על ידי המערבי סופג כמו LC3BII ^15), מה שמדגים את הנוכחות של סמן autophagy. עם זאת הם היו שליליים עבור שושלת monocytic (CD14, CD16 ו CD163) ואת dendritic תאים (CD1c ו CD141) סמנים, דבר המצביע על כך Gφ לא נבעו מונוציטים מזהם.

איור 6: ביטוי של סמנים שונים עבור נויטרופילים, מונוציטים ותאים דנדריטיים ב"ענק" Phagocytes (Gφ) לאחר 7 ימים בתרבות. ביטוי חיובי של סמן הגרגיר ספציפי נויטרופילים CD66b, את CD63 סמני גרגרי azurophil ו MPO, אלסטט נויטרופילים ו CD15. ביטוי שלילי עבור סמני CD1c ו CD141 הדנדריטים וסמני שושלת monocytic CD14, CD16 ו CD163. בנוסף, Gφ והביע LC3B סמן autophagy, הקולטנים נבלות CD68 ו CD36 ואת יחידות משנה מונואמין NADPH gp91-phox / P22-phox יחידות משנה. גרעינים הוכתמו DAPI, דגימות נותחו באמצעות מיקרוסקופיה confocal. נתון זה יש הבדל בין הפניות. ¹⁴ p>, ¹⁵ אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

תפקידי Gφ - הפעלת מונואמין NADPH, ROS ייצור Phagocytosis:

Phagocytosis של חרוזי לטקס zymosan opsonized ניכר Gφ. Gφ גם שנוצר הבזליים ROS (איור 7 א), והגיבו zymosan וגירוי PMA ידי פרץ חמצוני (איור 7 ב-ד). עם זאת, בניגוד מונוציטים או נויטרופילים, Gφ שנוצר ROS גם בתגובה לגירוי oxLDL ו הוכתמו על ידי שמן האדום O (איור 7 ב, ו). מן ראוי לציין כי טיפול של נויטרופילים טריים עם מעכב מונואמין NADPH - DPI, לא רק מעכב ייצור ROS, אלא גם pהיווצרות Gφ revented בתרבות, דבר המצביע על כך איתות ROS חיונית להיווצרות Gφ. ^{14, 15}

איור 7: פרץ חמצונים, Phagocytosis, ו oxLDL ספיגה ידי הענק Phagocytes (Gφ). (א) הייצור בסל ROS ניכר lysosomes של Gφ. (ב) ייצור ROS בתגובה LDL מחומצן (oxLDL), PMA ו zymosan (חלקיקים zymosan מסומנים בבירור). (C) Nitroblue tetrazolium (NBT) מבחן Gφ המציג את הפעילות פרץ נשימה בלי ועם PMA (שקופיות בלא כתם, אבל מוסיף מגואלות מאי גרינוולד-Giemsa). (ד) בדיקת NBT ומאי גרונוואלד-Giemsa מוכתם Gφ עם PMA ו PMA / DPI אשר עכבות מונואמין NADPH ו ROS. (E) Phagocytosis של LATEX ו zymosan IgG-opsonized ב PKH-26 (אדום) תאים מוכתמים. (F) שמן האדום O מכתים שלא טופלו ו oxLDL מטופלים Gφ. נתון זה יש הבדל בין הפניות. ^{14, 15} אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

גלגול נשמות של PMN מעבר לתאי אנדותל

על מנת לזהות פוטנציאל נויטרופילים תת אוכלוסיות שעלולות להתפתח Gφ, ההגירה של נויטרופילים באמצעות monolayers תא האנדותל נקבעה (איור 8 א). לאחר 90 דקות, 62.3 ± 12.2% של נויטרופילים transmigrated דרך תאי האנדותל כלפי IL-8 בתא התחתון. מן הראוי לציין כי Gφ חיובית עבור CD66b / CD15 / LC3B התפתח רק מן האוכלוסייה transmigrated של נויטרופילים ואילו התאים שפיתחה מן השבר נויטרופילים שאינם נודדים היו קטנים בגודלם שליליות על סמנים neutrophilic CD66b / CD15 (איור 8B, 8C) .

איור 8: אפקטים של IL-8 תלויי PMN גלגול דרך לתאי אנדותל על הענק תָא בַּלעָן (Gφ) גיבוש. (א) תוכנית הממחישות assay גלגול נויטרופילים ברחבי monolayers תא האנדותל (EC) כלפי IL-8. assay זה יכול להיחשב כמודל גיוס נויטרופילים לאתרים דלקת חריפה. (ב - ג) ב assay נדידת תאים (המפורטים בפרוטוקול 3), transmigrating (ב) ולא נודד (C) frac נויטרופיליםמשא היה בתרבית במשך שבעה ימים ללא גורמי גדילה (כמו פרוטוקול 1). לאחר מכן, תאים היו סובבים על גבי שקופיות זכוכית ונותחו על ידי מיקרוסקופיה confocal. תאים קבועים היו מוכתמים עבור CD66b (אדום), LC3B (ירוק) ו CD15 (אדום). גרעינים הוכתמו DAPI (כחול). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

פגוציטים ענקים (Gφ) הם אוכלוסייה מוגדרת חדש של תאים שמקורם נויטרופילים להביע סמני יסוד וספציפיים neutrophilic כגון CD66b / CD15 / CD63 / MPO / NE. סוג זה של תָא בַּלעָן נויטרופילים נגזרים לא תואר בספרות לפני. בניגוד נויטרופילים כי הם קצרים מועד עוברים אפופטוזיס, Gφ הוא Annexin-V-שלילי ולהציג תוחלת חיים מורחבים. עם זאת, כמו נויטרופילים, Gφ גם להפנים חלקיקים ולייצר NADPH oxidase התלוי ROS בתגובה אותם החלקיקים וכדי PMA. עם זאת, היכולות שלהם להפנים OxLDL וכתוצאה מכך לייצר ROS הם מאפיינים ייחודיים של Gφ. ¹⁴

מספר גורמים הוצגו להשפיע התפתחותם בתרבות. חוסר ציטוקינים חיצוני או גורמי גדילה במדיום צמיחה חיוני (במיוחד GM-CSF / IL-4). עם זאת, נויטרופילים ההגירה כלפי IL-8 הוכיח גורם להפלות בין אלה devברח לתוך Gφ ואלה שלא. כמו כן, הפנמה של פסולת הנובעים נויטרופילים אפופטוטיים, הביטוי של חלבוני autophagy (LC3B) ו מונואמין NADPH התפקודי, היה כל העולם להיות הכרחי להתפתחותם, מאז העיכוב שלהם מנע היווצרות Gφ (איור 1). ככל הנראה, את התפתחות תאי ענק אלה הנובעים נויטרופילים שונה מזו היווצרות תא ענק המאפיינת בשושלת מונוציטים / מקרופאג. התאים הענקים רב גרעיני הטופס האחרונים הקשורים למחלות דלקתיות כרוניות מגוונות, ^{20, 21} ואילו Gφ neutrophilic המתואר כאן לפתח באמצעות autophagocytosis, על ידי אופפת שרידי תא ולהישאר בעיקר מונה-גרעיניים ברחבי התפתחותם, ¹⁴ (לעתים רחוקות עם זאת, לפעמים שני גרעין ניתן לצפייה). יתר על כן, מספר הבקרות הוקם ממוצא neutrophilic שלהם: (1) expression של neutropilic סמנים והיעדרות הספציפיים של סמני שושלת הדנדריטים monocytic, (2) פיתוח הקשו שלהם מונוציטים / PMN שיתוף תרבויות, (3) התבניות השונות התנועה שלהם בתרבות מ מקרופאגים (כפי שמעיד הדמית תא חייה וזמן מיקרוסקופיה -lapse), ¹⁴ (4) דבקות האור שלהם מנות פלסטיק (5) הפיתוח שלהם CD15 הטהור ⁺ / CD14 ^- PMN נרכשו על ידי cytometry זרימה.

חלק מהפונקציות מזוהות-גופייה יכול לתת לנו רמזים לגבי פונקציות הפוטנציאל שלהם in vivo. לדוגמא, את היכולות של Gφ לצרוך כמויות גדולות של גרגרי נויטרופילים ופסולת, בנוכחות vacuoles הגדול, ואת LC3B הביטוי - חלבון autophagy תורם ופוחת דלקת באמצעות אינטראקציות רגולטוריים עם מסלולי איתות חיסון מולדים, ²² - שכולן יכולות הדחת תמיכה. ככזהגם, ממצאים אלה מצביעים על כך Gφ עלול להיות מתפקד באתרים דלקתיים שבו מערכת Mφ / DC אינה מספיקה או מאוימת, ובכך לתרום את הרזולוציה של דלקת. רעיון זה עשוי להיות נתמך על ידי העובדה כי בתרבויות מונוציטים / נויטרופילים מעורבים בפיתוח Gφ נפגע. ¹⁴ כמו כן, בהתחשב בכך Gφ לבטא קולטנים נבלות oxLDL (CD36, CD68), להפנים oxLDL, ולייצר ROS בתגובה עליו, עשוי להצביע על כך הם מעורבים בתהליכים טרשתיים לפתור דלקת. מאז Gφ שפותח רק נויטרופילים אשר הגרו לכיוון IL-8, הגלגול 'נויטרופילים ברחבי monolayers אנדותל כלפי IL-8 מייצג גיוס נויטרופילים לאתרים דלקתיים חריפים, ממצא זה גם יכול לתמוך בפונקציות אנטי-דלקתיות. לעומת זאת, את הביצועים של Gφ בתנאים דלקתיים מסוימים יכולים לאפשר להם לפרוק מרכיבי גרגיר ו ROS, ובכך, לתרום לכלדלקת רקמות נזק עולים בקנה אחד. ²⁰ עם זאת, באופן כללי, יכולות autophagic שלהם עולה כי Gφ מעורבים סביר בהפחתת התגובה הדלקתית ולא להנציח אותו.

מעניין זיהינו לאחרונה בנוכחות Gφ ב פלאק טרשת עורקים האדם. (בהכנה). עם זאת, מספר רב של שאלות להישאר להיות מפוענח. למשל, הם Gφ בעד או אנטי דלקתי? מה הם הגורמים הקובעים היווצרות ותפקוד שלהם במבחנה או in vivo? איזה תת-אוכלוסייה נויטרופילים ספציפית הוא תא מקדימם מקל על ההתפתחות שלהם לתוך Gφ? האם הם קשורים עם פתולוגיות מסוימות ואשר? באופן קולקטיבי, הצגת שאלות מעניינות לגבי מוצאם ופונקציות פוטנציאליות.

עם זאת צעדים ואת חסרונות קריטיים בתוך הפרוטוקול צריכים לזכור. שלב קריטי בפיתוח i Gφים culturing נויטרופילים טהור נטול בינוני של ציטוקינים, גורמי גדילה או אנטיביוטיקה. שלב קריטי נוסף הוא לשלול כי Gφ להתפתח מונוציטים זיהום וכדי לברר את מוצא neutrophilic של Gφ. לפיכך, לאחר הפרדת דם על ידי שיפוע רציף, את הנויטרופילים היו נתונים נוספים צעד נוסף של טיהור ידי cytometry זרימה באמצעות gating גרנולוציט ו CD15 ⁺ / CD14 ^- סמנים. המפותח Gφ המתקבל נויטרופילים כי היו מטוהרים עוד יותר על ידי cytometry זרימה ההפרדה לא שונים מאלה שלא נחשפו בשלב זה של טיהור. לכן, רוב הניסויים נערכו ללא הזרימה cytometry צעד של טיהור עקב אובדן תא נוסף. מן הראוי לציין כי, במקרים נדירים קצת אאוזינופילים כמה צוינו בתרבות. הגודל שלהם נותר ללא שינוי במשך כל תקופת התרבות. גם אנחנו צריכים לשים לב כי למרות שיש מספר שיטותלהפרדה נויטרופילים מדם אנושי, השיטה המתוארת כאן היא השיטה היחידה העסקנו ולכן אנחנו לא יכולים להשוות פיתוח Gφ ידי משיטות אימות אחרות להפרדה נויטרופילים.

נופל בפח מרכזי חוקרת Gφ נובע חוסר היכולת להשיג בכמות מספקת של אוכלוסייה טהורה Gφ מתאים מבחני ביוכימיים שונים. זה בעצם בלתי אפשרי בתנאי הניסויים שלנו בוצעו. ראשית, התשואה של Gφ היא נמוכה. מ 1.0 x 10 ⁶ PMN זורעים על 100 - 200 Gφ להתפתח לאחר שבעה ימים בתרבות, תלוי תורם דם. שנית, זה בעצם קשה כרגע להפריד את Gφ מפותחת בתרבות מן ההריסות נויטרופילים שנותרו בצלחת. מגבלות אלה סייעו כמעט בלתי אפשרי לנתח את התאים על ידי שיטות ביולוגיה ביוכימי או המולקולרית. לכן, בפרוטוקול זה מתמקד ב המתאר זיהוי Gφ ותפקוד באמצעות אורמיקרוסקופ confocal. השינוי המורפולוגי שלהם נויטרופילים לתוך Gφ בתרבות בעקבות גם על ידי הדמיה תא חי מיקרוסקופיה זמן לשגות. ¹⁴ ככל הנראה, הרבה כרכי דם גדולים עשויים להיות נחוצים כדי ליישם שיטות ביולוגיה ביוכימי או מולקולריות ולהתגבר התשואה הנמוכה שהתקבלה והפרדת Gφ הקיימא 'פסול נויטרופילים בצלחת.

לסיכום, תיארנו לאחרונה בפעם הראשונה בפיתוח Gφ בתרבות, subpopulation של פגוציטים חיים ארוכים ממוצא neutrophilic. לכן, זוהי השיטה היחידה הזמינה כרגע להשיג Gφ בתרבות, למרות שתי המגבלות העיקריות הנ"ל יש להתגבר (התשואה הנמוכה של Gφ שהושגה תרבות וחוסר היכולת להפריד בין Gφ פתח מן ההריסות נויטרופילים בתרבות צַלַחַת). ובכל זאת, הכנה והזדהותם, המובאים בפרוטוקול זה, הוא essential עבור מדענים המעוניינים תגובות דלקתיות וביולוגית נויטרופילים פלסטי, על מנת לחקור את משמעות פוטנציאל נוסף ותפקידי Gφ.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterile scalp vein set (21GX3/4)	Bio Diagnostics Ltd.	# 20080312	A strile needle for venipancture
VACUETTE HOLDEX Single-Use Holder PP	Greiner Bio-One	# 450263	For securing during venipuncture
VACUETTE Tube K3E K3EDTA (16 x 100/9 mL)	Greiner Bio-One	# 455036	Sterile tube for blood collection
Nunclon MultiDish (24 well x 1 ml)	Thermo Scientific	# 142475
Polypropylene conical centrifuge tube (50 ml)	Greiner Bio-One	# E14103PJ
Transwell-24 well (transmigration assay)	Corning	# CA-3415	Polycarbonate membrane, 6.5 mm diameter, 3 μm pores)
RPMI-1640 medium	BioIndustries	# 01-100-1A	Do not add antibiotics
EA.hy926 (ATCC CRL2922)	BioIndustries	# CRL-2922
ATCC-formulated Dulbecco’s  Modified Eagle’s Medium	BioIndustries	# 302002	complete growth medium
Polysucrose - Histopaque1119	Sigma-Aldrich	# 1119-1	Tissue culture grade
Polysucrose - Histopaque1077	Sigma-Aldrich	# 1077-1	Tissue culture grade
Phosphate buffered saline (PBS) - ion free	BioIndustries	# 02-023-1A	Cell biology and molecular biology grade
Heat inactivated Fetal calf serum (HI-FCS)	BioIndustries	# 04-121-1B	Cell biology grade or tissue culture grade, low LPS
NaCl	Sigma	# S3014	Molecular biology grade, suitable for cell culture
Paraformaldehyde, 16%	Electron Microscopy Sciences	# 15710	Cell bology grade or tissue culture grade (only 16% PFA)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	# 9002-93-1	Molecular biology grade
Normal Goat Serum	BioIndustries	# 04-009-1	Cell biology and molecular biology grade
Trypan blue	BioIndustries	# 031021B	Tissue culture grade
May-Grünwald	Sigma-Aldrich	# MG500	Cell biology grade-(procedure No GS-10)
Giemsa stain Kit	Sigma	# 48900	Cell biololgy grade-(procedure No GS-10)
Fibronectin	BioIndustries	# 03090105
Human Interleukin-8 (CXCL8)	PeproTech	# 200-08-5
Anti-CD14 (clone 5A3B11B5)	Santa Cruz Biotechnologies	# sc-58951	Mouse IgG2b; expressed by  monocytes
Anti-CD63 (clone MX-49.129.5)	Santa Cruz Biotechnologies	# sc-5275	Mouse IgG1; expressed by neutrophils
Anti-CD66b (clone 80H3)	AbD Serotec	# MCA216	Mouse IgG1; expressed by neutrophils
Anti-CD1c (BDCA-1) (clone AD5-8E7)	MACS Miltenyi Biotec	# 130-090-695	Mouse IgG2a; expressed by  dendritic cells
Anti-CD15 (clone MY-1)	Abcam	# ab754	Mouse IgM; expressed by neutrophils
Anti-Cytochrome b-245 Light Chain (p22-phox) (clone 44.1)	BioLegend	# 650001	Mouse IgG2a; to recognize neutrophil NADPH oxidase complex
Anti-CD68	Protein Tech	# 16192-1-AP	Rabbit IgG; to recognize oxLDL scavenger receptor
Anti-LC3B	Sigma	# L7543	Rabbit IgG
Anti-Myeloperoxidase	Abcam	# ab45977	Rabbit IgG
Anti-Neutrophil elastase	Calbiochem	# 481001	Rabbit IgG
Anti-NOX2 (gp91-phox)	Abcam	# ab131083	Rabbit IgG
Anti-CD36 (SR-B3)	Novus Biologicals	# NB400-144	Rabbit IgG
Purified Mouse IgG1, κ Isotype Control (clone MG1-45)	BioLegend	# 401401	Antibody used as isotype control
Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control (clone MOPC-173)	BioLegend	# 400263	Antibody used as isotype control
Normal rabbit IgG	Santa Cruz Biotechnologies	# sc-2027	Antibody used as isotype control
CF488A Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Biotium	# 20012	Anti-Rabbit IgG with the green fluorescent dye CF488A
CF647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Biotium	# 20043	Anti-Rabbit IgG with the red fluorescent dye CF647
CF488A Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Biotium	# 20010	Anti-Mouse IgG with the green fluorescent dye CF488A
CF647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Biotium	# 20040	Anti-Mouse IgG with the red fluorescent dye CF647
Fluorescent Mounting Medium with DAPI	Vectashield H-1000; Vector Lab Inc.	# E19-18	Nuclear staining
Confocal laser scanning microscope (LSM 700)	Carl Zeiss	Ser.# 3523000380	Plan Apo 40X immersion oil objective
Zeiss CLSM software (ZEN 2010)	Carl Zeiss MicroImaging GmbH	version 6.0	For colocalization analysis
ImageJ software	Wayne Rasband, NIH, USA	version 1.49k	For determination of cell  areas and fluorescence intensity
Light microscope (Axiovert 25)	Carl Zeiss	Ser.# 201060153	Examination of cells in culture
Centrifuge (Megafuge 1.0 R)	Heraeus Instruments	# D-37520	Cells separation from blood; cytospins preparation
Inverted fluorescent microscope (Zeiss Axio Observer Z.1)	Carl Zeiss	Ser.# 3834001470	Demonstration of giant phagocytes development
Temperature-controlled incubation system (Cube&Box)	Life Imaging Services		Temperature control system for microscopes
High resolution digital CCD camera (AxioCam HRm)	Carl Zeiss	Ser.# 117090279	For capturing high-contrast  image data from an examined cell objects
Hydrophobic barrier pen (Elite PAP Pen)	Diagnostic Biosystems	# K039	For defining cell perimeter for immunoflourescence staining